Un protocolo de trasplante de corazón heterotópico porcino para la administración de terapias a un aloinjerto cardíaco

Resumen

Presentamos un protocolo para la utilización de un sistema de perfusión sanguínea normotérmica ex vivo para la administración de terapias a un aloinjerto cardíaco completo en un modelo de trasplante de corazón heterotópico porcino.

Resumen

El trasplante cardíaco es el tratamiento estándar de oro para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal. Sin embargo, sigue estando limitado por el número de corazones de donantes disponibles y complicaciones como la disfunción primaria del injerto y el rechazo del injerto. El reciente uso clínico de un dispositivo de perfusión ex vivo en el trasplante cardíaco presenta una oportunidad única para tratar los aloinjertos cardíacos con intervenciones terapéuticas para mejorar la función y evitar respuestas perjudiciales del receptor. El establecimiento de un modelo traslacional de animales grandes para la administración terapéutica a todo el aloinjerto es esencial para probar nuevos enfoques terapéuticos en el trasplante cardíaco. El modelo de trasplante cardíaco heterotópico porcino en posición intraabdominal sirve como un excelente modelo para evaluar los efectos de las intervenciones novedosas y la inmunopatología del rechazo del injerto. Este modelo también ofrece supervivencia a largo plazo para el cerdo, dado que el injerto no es necesario para mantener la circulación del receptor. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para lograr la administración ex vivo de una terapia a todo el aloinjerto cardíaco antes del trasplante y proporcionar detalles técnicos para realizar un trasplante heterotópico de supervivencia del corazón perfundido ex vivo .

Introducción

La insuficiencia cardíaca es una afección que afecta a un estimado de 6 millones de adultos en los Estados Unidos y se proyecta que aumentará a 8 millones de adultos para el año 2030¹. El trasplante cardíaco es el tratamiento estándar de oro para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal. Sin embargo, no está exento de limitaciones y complicaciones. Sigue estando limitado por el número de corazones de donantes disponibles, la disfunción primaria del injerto, el rechazo del corazón y los efectos secundarios de la inmunosupresión a largo plazo². Estas limitaciones son particularmente importantes en los receptores jóvenes que pueden experimentar fracaso del aloinjerto y requieren un nuevo trasplante posterior para lograr una esperanza de vida normal.

Una intervención ideal para superar estas limitaciones trataría los aloinjertos cardíacos completos con terapias previas a la implantación en el receptor que pueden mejorar la viabilidad del aloinjerto y conferir "cardioprotección". Tales intervenciones se administrarían profilácticamente para minimizar la incidencia de insultos isquémicos, rechazo de aloinjertos, vasculopatía de aloinjerto cardíaco e incluso reparar aloinjertos marginales. Los estudios traslacionales para desarrollar este tipo de intervenciones requieren un modelo de trasplante cardíaco en animales grandes para permitir la vigilancia a largo plazo del injerto cardíaco. El modelo de trasplante cardíaco heterotópico porcino en posición intraabdominal ha demostrado ser ideal para este propósito. El trasplante de corazón en esta posición permite probar los efectos de las nuevas terapias y evaluar la inmunopatología del rechazo del injerto. Además, el modelo heterotópico es ventajoso sobre el modelo ortotópico debido a una mejor supervivencia general del receptor, sin necesidad de bypass cardiopulmonar y sin requisito del injerto para mantener la circulación del receptor³.

La administración efectiva de intervenciones terapéuticas al corazón, como la terapia génica, celular o inmunoterapia, es una barrera significativa para la aplicación clínica ^4,5. La tecnología introducida por los dispositivos de perfusión ex vivo permite perfundir continuamente los injertos, manteniéndolos en un estado no funcional pero metabólicamente activo 6,7,8,9. Esto ofrece una oportunidad única para tratar todo un corazón con terapias avanzadas al tiempo que minimiza los posibles efectos secundarios de la administración sistémica 10,11,12,13. Otra ventaja de utilizar dispositivos de perfusión ex vivo para la administración terapéutica es que permiten la administración de medicamentos a la circulación coronaria durante períodos prolongados que no son factibles utilizando los métodos tradicionales de almacenamiento estático en frío. Esto permite una entrega más global de la terapéutica al injerto¹⁴. Usando el protocolo presentado aquí, entregamos con éxito el gen luciferasa de la luciérnaga a un injerto cardíaco porcino completo utilizando vectores adenovirales¹⁵. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para lograr la administración de una terapia a todo el aloinjerto cardíaco antes del trasplante.

Protocolo

NOTA: Se seleccionan dos hembras de cerdo yucateco, una designada para ser la donante de injerto cardíaco y la otra como receptora. Se recomiendan cerdos de 6 a 8 meses de edad, que pesen aproximadamente 30 kg y tengan tipos de sangre compatibles. La visión general del protocolo se muestra en la Figura 1. El alojamiento y los procedimientos de tratamiento para los cerdos se realizan de acuerdo con las pautas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Duke.

1. Preparación del dispositivo de perfusión ex vivo

1. Prepare el dispositivo de perfusión ex vivo y un dispositivo de ahorro de células para su uso según las pautas del fabricante.
2. Tenga una caja de ritmo y un desfibrilador disponibles y configúrelos.
3. Tenga un dispositivo de prueba en el punto de atención (POC) disponible para verificar un conteo sanguíneo completo (CBC), un panel metabólico básico (BMP) y un gasometría arterial (ABG).
4. Agregue los siguientes medicamentos a la solución de cebado de perfusión proporcionada por el fabricante, si aún no está presente en la solución de perfusión del fabricante: 100 ml de albúmina al 25%, 10 ml de ciprofloxacina de 200 mg / 100 ml, 1 g de cefazolina sódica, dos viales de 5 ml de inyección multivitamínica, 250 mg de metilprednisolona, 10,000 UI de heparina y 50 UI de insulina.
   1. Realice pruebas POC de la solución de cebado del dispositivo ex vivo para garantizar que los niveles de electrolitos estén dentro del rango fisiológico normal. De lo contrario, administre gluconato de calcio, dextrosa y / o bicarbonato de sodio en consecuencia para complementar cualquier electrolito subterapéutico o niveles de glucosa.
5. Para agregar la solución de cebado con los medicamentos agregados, coloque la solución y desairee la línea que entrega la solución al dispositivo de perfusión ex vivo .
   NOTA: Vaya a la sección 6 para obtener instrucciones sobre el cebado del dispositivo de perfusión ex vivo .

2. Inicio de la anestesia y acceso intravenoso en el cerdo donante

1. Después de ayunar al cerdo durante 8-12 h, premedicarlo con ketamina (5-33 mg /kg, intramuscular) y midazolam (0.2-0.5 mg / kg, intramuscular) y administrar isoflurano (1-4%) usando una máscara facial.
2. Coloque al cerdo en posición supina e intuba con un tubo endotraqueal (ETT) (5,5-6,5 mm de diámetro interno) para proteger las vías respiratorias. Asegure el ETT atándolo al hocico del cerdo. Coloque las extremidades usando lazos pesados unidos a la mesa.
3. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
4. Coloque un catéter intravenoso (IV) (20-22 G) en una vena del oído.
5. Iniciar el mantenimiento de fluidos intravenosos (Solución de Ringer lactada a 10 mL·( kg·h)^-1).
6. Administrar buprenorfina intramuscular (IM) 0,005-0,01 mg/kg para la analgesia.

3. Signos vitales y ajustes de la línea central

1. Iniciar ventilación mecánica a un volumen corriente de 10 mL· (kg·min) ^-1 y una tasa de 10-15 respiraciones por minuto con isoflurano (1-3%) mantenida durante todo el procedimiento de tal manera que los reflejos están ausentes y la frecuencia cardíaca (>60 lpm, <100 lpm) y la presión arterial (presión arterial sistólica >90 mmHg, <130 mmHg) permanecen dentro del rango fisiológico.
   NOTA: La adición de un paralítico es opcional.
2. Controle continuamente la saturación de oxígeno y las frecuencias cardíacas durante toda la cirugía.

4. Esternotomía mediana del cerdo donante

1. Palpar el esternón desde el manubrium hasta el xifoide. Marque la línea media con un marcador quirúrgico estéril. Afeitar cualquier cabello del sitio con un cortapelos y esterilizar el área usando clorhexidina al 4% para un total de 3 rondas de esterilización. Aplique una cortina quirúrgica estéril alrededor del sitio quirúrgico inmediato.
   NOTA: Los cirujanos deben lavarse las manos y los brazos con un lavado a base de alcohol o yodo y ponerse batas y guantes estériles.
2. Use una cuchilla no. 10 para hacer una incisión desde el manubrium hasta el xifoide, que mide 20-30 cm, dependiendo del tamaño del cerdo.
3. Use electrocauterización para dividir el pectoral mayor desde el esternón hasta el xifoide, teniendo cuidado de hacerlo a lo largo de la línea media del esternón. Una vez bajado al esternón, puntúa la línea media y comienza la esternotomía desde la xifoidea dividiéndola con tijeras pesadas.
4. Extienda la cefálada de esternotomía con tijeras pesadas. Después de cada corte, separe sin rodeos el corazón del esternón usando barridos de dedos. De esta manera, complete la esternotomía a través del manubrio.
5. Después de completar la esternotomía, logre la hemostasia aplicando electrocauterización en los bordes óseos cortados.
6. Coloque un retractor esternal y ábralo para optimizar la exposición del campo quirúrgico. Identificar y extraer el timo con electrocauterización. Ingrese el pericardio longitudinalmente desde el diafragma hasta la aorta. Crea una cuna pericárdica usando 5-6 tamaños: 2-0, suturas de seda.

5. Paro cardíaco y cardiectomía del cerdo donante

1. Divida completamente el tejido entre la aorta y la arteria pulmonar (AP) y visualice la ubicación del arco aórtico y el tronco braquiocefálico para facilitar la colocación adecuada de la pinza cruzada aórtica.
   NOTA: La aorta ascendente es mucho más corta en el cerdo que en el humano.
2. Libere circunferencialmente la vena cava superior (SVC) usando tijeras y disección roma. Pase dos, tamaño: 0, lazos de seda alrededor del SVC.
3. Libere circunferencialmente la vena cava inferior (IVC) usando tijeras y disección roma. Del mismo modo, pase dos corbatas de seda 0 alrededor del IVC.
4. Aplique una puntada en U, tamaño: 4-0, sutura de polipropileno a la aorta ascendente.
5. Aplique una cuerda de monedero, tamaño: 4-0, sutura de polipropileno en la aurícula derecha (AR).
6. Administrar un bolo de heparina IV utilizando una dosis inicial de 300 U/kg.
7. Inserte una cánula de raíz aórtica pediátrica de 4-Fr, asegurada por la puntada en U colocada previamente. Desairear la cánula y asegurarla en su lugar con un torniquete Rummel.
8. Conecte la cánula de la raíz aórtica al tubo de cardioplejia después de que el tubo se haya enjuagado con cardioplejia del Nido. Enjuague con la cantidad necesaria para eliminar cualquier burbuja de aire dentro del tubo.
   NOTA: La comunicación con el equipo de perfusión es fundamental en este punto para ejecutar correctamente el paro cardíaco.
   1. Asegúrese de que el perfusionista o perfusionistas hayan instalado los desechables de ahorro celular de manera estéril, cebado el dispositivo según lo recomendado por el fabricante (ver sección 6) y estén listos para procesar la sangre recolectada.
   2. Confirme que la cardiotomía de ahorro celular (recipiente de plástico conectado al dispositivo de ahorro de células donde se almacena la sangre después del lavado) está lista con 10,000 U de heparina y que la cardiotomía está conectada a la succión, sin exceder los -150 mmHg de presión.
      NOTA: Esto es para evitar la hemólisis de los glóbulos rojos.
9. Cree una auritomía derecha dentro de la cuerda del bolso colocada anteriormente, inserte una cánula venosa de 24 Fr en la AR y asegúrela con un torniquete de Rummel.
10. Conecte la cánula venosa a una línea de succión estéril conectada a la cardiotomía de ahorro celular y recolecte aproximadamente 1-1.3 L de sangre. Luego, aplique la abrazadera cruzada aórtica, asegurándose cuidadosamente de que la abrazadera ocluya completamente la aorta ascendente. Administrar 500 ml de cardioplejia del Nido en la raíz a una presión de 100-150 mmHg utilizando una bolsa de presión.
    NOTA: El corazón se blanqueará y se detendrá.
11. Coloque granizado de hielo estéril en el corazón.
12. Una vez que se administra la cardioplejia, retire la cánula de la raíz aórtica y la cánula venosa de la AR y ate las suturas de la cuerda del bolso hacia abajo.
13. Divida lo siguiente: el IVC, el SVC solo proximal a la vena ácigos, la aorta a nivel del arco justo distal a la arteria innominada, la AF principal en la bifurcación y la vena cigoto izquierda a medida que ingresa al seno coronario.
    NOTA: Los cerdos tienen una vena acigota izquierda que drena hacia el seno coronario.
14. Identificar las venas pulmonares y ligarlas con tamaño: 2-0, lazos de seda o clips de gran tamaño. Deje una vena pulmonar abierta para la inserción del respiradero del VI.
15. Retire el corazón del pecho y colóquelo en un recipiente con granizado de hielo estéril.
16. Mueva el corazón a la mesa posterior para preparar el injerto para su colocación en el dispositivo de perfusión ex vivo .

6. Lavado de la sangre del donante y cebado del dispositivo de perfusión ex vivo

NOTA: Este paso es necesario para eliminar cualquier componente del suero del donante que pueda neutralizar la administración de la terapia cuando se introduce en el perfusato. Realice este paso durante la explantación del corazón del donante para minimizar el tiempo isquémico del aloinjerto.

1. Complete un ciclo de preparación y lavado de ahorro de celdas.
   1. Instale los componentes desechables en el dispositivo según las instrucciones del fabricante.
   2. Imprima el dispositivo de ahorro de celdas aumentando Plasmalyte A y seleccionando la función principal en el dispositivo. Agregue tanto plasmalito A como el volumen de sangre recolectada del cerdo donante de una manera 1: 1.
      NOTA: Una vez que el dispositivo completa el ciclo de cebado, está listo para la adición de sangre. Ver secciones 5.9-5.11 para saber cómo añadir la sangre del cerdo donante.
   3. Una vez que la sangre esté en el dispositivo, seleccione el ciclo de lavado en el dispositivo de ahorro de células.
      NOTA: Durante este proceso, la sangre se centrifuga mientras que el plasmalito A se introduce para lavar la sangre. Este paso concentra y lava la sangre.
2. Transfiera la sangre lavada a una bolsa de recolección de sangre para transferirla al dispositivo ex vivo .
3. Agregue la sangre lavada al dispositivo de perfusión ex vivo según las pautas del fabricante.
4. Prepare una solución de epinefrina inyectando 0,25 mg de epinefrina y 30 UI de insulina en 500 ml de dextrosa al 5% en agua durante el cebado de la máquina ex vivo . Pinche la solución y desairee la línea que entrega la solución al dispositivo ex vivo .
5. Añadir 10.000 U de heparina al dispositivo de perfusión ex vivo .
6. Agregue albúmina al 5% para reconstituir la sangre.
   NOTA: El volumen de albúmina al 5% agregado al dispositivo es igual a la cantidad de plasma eliminado por el dispositivo de ahorro celular. Esto se hace para ayudar a lograr una presión oncótica fisiológica y hematocrito.
7. Encienda la bomba para que fluya a 1-1.5 L/min para cebar el circuito con el primo claro, los medicamentos y la sangre administrados en el depósito. Después de encender el flujo de la bomba y hacer circular el primo a través del módulo de perfusión, asegúrese de que las líneas del circuito estén libres de aire.
   NOTA: El volumen de la solución de mantenimiento final es de 1000 ml además del volumen de sangre lavada.
8. Obtener una química POC de perfusato de referencia y lactato utilizando el dispositivo de prueba POC. Reponga los electrolitos según sea necesario.
   1. Agregue suficiente dextrosa para mantener un nivel mínimo de glucosa de 100 mg / dL.
   2. Agregue suficiente bicarbonato de sodio para mantener un objetivo de pH mínimo de 7.4.
      NOTA: Es importante destacar que el bicarbonato de sodio agregado no se puede eliminar del perfusato. El exceso de niveles de sodio contribuirá a que el corazón se vuelva edematoso y debe evitarse. Se debe tener precaución al tratar el déficit base, ya que el corazón comenzará a corregir el déficit base al volver a apelar.
   3. Agregue suficiente gluconato de calcio para mantener un nivel mínimo de calcio ionizado de 0.8 mmol / L.
9. Ajuste la temperatura a 37 °C.
10. Ajuste el caudal de gas a 150 ml/min y ajuste según sea necesario para alcanzar un nivel fisiológico de pCO₂ .
11. Establezca el objetivo de presión arterial media (PAM) en 60-70 mmHg.
12. Baje el caudal de la bomba a 0,6 L/min.

7. Preparación de la mesa posterior del corazón del donante y reanimación del corazón

1. Sobrecargado el SVC. Coloque cuatro suturas de polipropileno prometidas, tamaño: 4-0, en una forma de colchón horizontal simple alrededor del interior de la aorta distal, 5 mm por debajo del borde cortado y átelas hacia abajo.
2. Mientras sostiene el 4, tamaño: 4-0, suturas aórticas prometidas, inserte el conector aórtico en la aorta y ate una cinta umbilical alrededor de la aorta para asegurar el conector.
3. Coloque un tamaño: 4-0, cuerda de polipropileno alrededor del borde de corte distal del PA principal. Inserte la cánula pa y ate los extremos de la cuerda del bolso para asegurar la cánula.
4. Lleve el injerto preparado de la mesa posterior al dispositivo de perfusión ex vivo y conecte el conector aórtico al dispositivo. Asegúrese de desairear el conector aorta/aórtico antes de asegurar el corazón al dispositivo.
5. Encienda el reloj de perfusión, mantenga el flujo de la bomba alrededor de 0,6 L/min y disminuya el punto de ajuste de temperatura a 34 °C.
6. Comience los goteos de epinefrina y mantenimiento según las recomendaciones del fabricante.
7. Conecte la cánula de PA al conector de PA del dispositivo y asegúrela con una corbata.
8. Coloque el drenaje de ventilación del ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar desatada hacia la aurícula izquierda y a través de la válvula mitral hacia el VI. Asegure el respiradero en su lugar con una sola puntada para anclarlo adecuadamente.
9. Coloque dos cables de estimulación cardíaca en la pared libre de VI.
10. Revise el lactato, ABG, CBC y BMP cada hora. Administre potasio, 50% de dextrosa y calcio según sea necesario para mantener los niveles fisiológicos normales.
    NOTA: El muestreo de lactato más frecuente puede ser apropiado durante la estabilización temprana para establecer una perfusión adecuada basada en lactato.
11. Si se requiere estimulación, establezca el ritmo ventricular en 80 latidos por minuto a 10 mA (generalmente no se utiliza el ritmo auricular).
12. Si se requiere desfibrilación, comience a 10 J después de que la temperatura en el dispositivo haya alcanzado los 34 ° C. No exceda los 50 J.
    NOTA: El flujo promedio total objetivo es de 600 ml / min, y el flujo coronario promedio es de 400 ml / min.

8. Administración de la terapéutica

1. Dibuje la terapéutica en una jeringa de manera estéril.
2. Desairee el puerto de cardioplejia mediante el uso de una jeringa estéril de 3 ml para extraer sangre a través del puerto. Administrar la terapéutica en el puerto de cardioplejia (o equivalente) de tal manera que la terapéutica se introduzca directamente en la raíz aórtica.
3. Enjuague el puerto con el volumen de sangre recolectada extraído en el paso 8.2 al desairear el puerto; tenga cuidado de no enjuagar el aire con él.
   NOTA: Esto es para garantizar que la terapéutica se administre en la raíz aórtica del corazón.
   NOTA: Esta sección ha sido descrita previamente en detalle en Bishawi et al. introducir vectores virales para la expresión de luciferasa¹⁵.
4. Perfundir el injerto en el dispositivo durante 2 h después de introducir el terapéutico.

9. Preparación del receptor y laparotomía con exposición vascular

1. Una vez asegurado el aloinjerto cardíaco al dispositivo y introducido el terapéutico en el circuito, se inicia la inducción de anestesia y preparación preoperatoria como se describe en el apartado 2 para el cerdo receptor.
2. Iniciar la infusión de los medicamentos de inmunosupresión: ciclosporina 50 mg/kg total como infusión por goteo lento durante todo el procedimiento y bolo de metilprednisolona 1 g IV.
3. Administrar antibióticos: enrofloxacina IM (5 mg/kg) y cefazolina 1 g en bolo IV.
4. Inserte un catéter Foley en la vejiga.
   NOTA: La descompresión de la vejiga ayuda a obtener una exposición óptima de la aorta infrarrenal y la CIV.
5. Marque la línea media abdominal desde la mitad del abdomen hasta el pubis con un marcador quirúrgico estéril. Afeitar cualquier cabello del sitio con un cortapelos y esterilizar el área usando clorhexidina al 4% para un total de 3 rondas de esterilización. Aplique una cortina quirúrgica estéril alrededor del sitio quirúrgico inmediato.
   NOTA: Los cirujanos deben lavarse las manos y los brazos con un lavado a base de alcohol o yodo y ponerse batas y guantes estériles.
6. Use una cuchilla de 10 para incidir la piel (incisión de 20-30 cm) y cambie a electrocauterización para diseccionar hasta la fascia.
7. Use dos abrazaderas Kocher para levantar la fascia y el peritoneo y haga cuidadosamente una pequeña incisión (1 cm) en la cavidad peritoneal con tijeras Metzenbaum.
8. Extienda la abertura peritoneal durante toda la longitud de la incisión con electrocauterización, colocando un dedo debajo para proteger las vísceras subyacentes. Coloque un retractor Balfour para optimizar la exposición. Retraiga el intestino delgado cranealmente y con toallas húmedas.
9. Abra el espacio retroperitoneal inferior a los riñones con cuidado dirigido a identificar los uréteres y evitar lesiones.
10. Lleve la disección hasta la aorta abdominal y la CIV. Ligar los linfáticos con clips medianos y grandes.
11. Diseccionar los vasos circunferencialmente y exponer un segmento lo suficientemente grande como para colocar una abrazadera Satinsky grande alrededor de cada vaso. Tenga cuidado de evitar la interrupción de las ramas arteriales lumbares, que se desprenden de la parte posterior de la aorta. Coloque dos bucles de vasos alrededor de la aorta y la CIV en los extremos proximal y distal de la exposición.

10. Detención final y extracción del corazón del dispositivo de perfusión ex vivo

1. Al final de las 2 h de perfusión ex vivo , conecte la máquina calentadora-enfriadora al dispositivo ex vivo . Ajuste la temperatura del enfriador del calentador a 34 °C.
2. De manera estéril y sin aire, conecte la línea de administración de cardioplejia desaireada al dispositivo ex vivo en el puerto de acceso aórtico.
3. Apague el punto de ajuste de temperatura del dispositivo ex vivo.
4. Reduzca la temperatura del calentador-enfriador a 24 °C y disminuya el flujo de la bomba para mantener el MAP entre 60 y 70 mmHg (generalmente un cambio en el flujo de la bomba de 1 L / min a 0.9 L / min).
5. Una vez que la lectura de temperatura en el dispositivo de perfusión ex vivo alcanza los 24-26 °C, reduzca aún más la temperatura del calentador-enfriador a 14 °C y disminuya aún más el flujo de la bomba en 100 ml / min.
6. Una vez que la temperatura alcance los 14-16 °C, separe la cánula de PA del puerto de PA, inicie la entrega de antegrade del Nido (500 mL), cierre la válvula de línea AO, detenga la bomba y sujete rápidamente la línea de ventilación AO.
   NOTA: La presión de administración de cardioplejia debe ajustarse para mantener una presión media de entrega de 45-65 mmHg como se muestra en el monitor del dispositivo ex vivo .
7. Retire el corazón del dispositivo de perfusión ex vivo desconectando la cánula de PA y el conector aórtico y cortando los cables de estimulación.
8. Coloque el corazón en un cubo lleno de granizado de hielo estéril.
9. En la tabla posterior, sobresalga la vena pulmonar / auritomía izquierda donde se había insertado el respiradero del VI. Recorte (1 o 2 mm) del aspecto distal de la aorta y PA donde la unión a las cánulas puede haber aplastado el tejido.
   NOTA: El corazón ya está listo para la implantación intraabdominal y heterotópica.

11. Implantación heterotópica del injerto cardíaco

1. Antes de colocar las abrazaderas Satinsky, administre 300 U/kg de heparina IV al cerdo receptor.
2. Coloque una abrazadera Satinsky en el IVC y cree una venotomía longitudinal que mida ~ 1.5 cm usando una hoja de 11 y las tijeras de Pott.
3. Anastomose la AP del injerto a la CIV infrarrenal del receptor de extremo a lado utilizando una sutura de polipropileno de tamaño variable: 4-0. Realice primero la parte interna de la anastomosis y refuerce según sea necesario con suturas interrumpidas antes de completar la parte externa de la anastomosis.
   NOTA: La anastomosis PA a IVC se realiza primero, y la anastomosis de aorta a aorta se realiza en último lugar para reducir la duración de la oclusión aórtica.
4. Coloque una abrazadera Satinsky en la aorta y cree una aortotomía longitudinal que mida ~ 1.5 cm usando una hoja de 11 y las tijeras de Pott.
   NOTA: Obtenga un ABG antes de colocar la abrazadera. Vuelva a verificarlo inmediatamente después de la liberación de la pinza y nuevamente 15-30 minutos después para evaluar cualquier cambio en la hiperpotasemia, hiperlactatemia o acidemia indicativa de lesión isquémica en el receptor.
5. Anastomose la aorta del injerto a la aorta infrarrenal del receptor de forma de extremo a lado utilizando una sutura de polipropileno de tamaño variable: 4-0. Realice primero la parte interna de la anastomosis y refuerce según sea necesario con suturas interrumpidas antes de completar la parte externa de la anastomosis.
6. Retire las abrazaderas Satinsky para volver a perfundir el corazón; primero, retire la abrazadera IVC seguida de la abrazadera aórtica.
7. Coloque un angiocath de 18 G en el ápice del VI del injerto para desairear. Cuando haya terminado, retire la angiocath y cierre el sitio con una sutura prometida.
8. Revise cuidadosamente las anastomosis para detectar cualquier sangrado.
9. Coloque cuidadosamente el corazón en el espacio retroperitoneal derecho, de modo que no haya tensión en las anastomosis ni torceduras de los vasos. Reemplace el intestino delgado.

12. Cierre de la laparotomía

1. Cierre la fascia con bucle, tamaño: 0, sutura Maxon de manera corrida comenzando desde ambos extremos de la incisión y atando en el medio. Tenga cuidado de evitar cualquier lesión en el intestino.
2. Cierre la capa dérmica profunda con tamaño: 2-0, Vicryl en forma de correr y la piel con tamaño: 4-0, Monocryl en forma de running.
3. Limpie la incisión de la piel y aplique pegamento para la piel.

13. Tratamiento postquirúrgico y eutanasia

1. Después de completar la cirugía, apague el flujo de isoflurano y controle al cerdo para detectar el retorno del tono muscular y los reflejos neuromusculares (reflejo corneal, retirada a estímulos dolorosos, deglución).
2. Después de confirmar la restauración de estas funciones, apague la ventilación mecánica y observe la respiración espontánea. Si hay respiración espontánea, retire el tubo endotraqueal; si no lo hay, vuelva a conectar el tubo endotraqueal a la ventilación mecánica.
3. Transfiera el cerdo de la mesa de operaciones a un recinto aislado donde sus signos vitales (temperatura rectal, presión arterial, frecuencia cardíaca) puedan ser monitoreados de cerca. Use una lámpara de calefacción para calentar al cerdo según sea necesario. Proporcionar un bolo líquido intravenoso de 250 ml de solución de Ringer lactado en el contexto de hipotensión (presión arterial sistólica < 100 mmHg). Continúe monitoreando al cerdo hasta que pueda mantener la reclinación esternal y los signos vitales estén completamente normalizados.
   NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente. Además, el animal no es devuelto a la compañía de otros animales hasta que se recupere por completo.
4. Para el manejo del dolor, administrar una dosis única de buprenorfina (liberación sostenida) inyección subcutánea 0,12 mg/kg durante 72 h de analgesia.
5. Al final del período experimental, eutanasia al cerdo para la explantación del corazón nativo (torácico) y el corazón aloinjerto (abdominal).
   1. Prepare el cerdo como se describe en las secciones 2 y 3 para el procedimiento. Prepara dos bolsas de del Nido y dos líneas de cardioplejia para detener cada corazón.
   2. Exponer el corazón torácico como se describe en la sección 4. Una vez completado, proceder a realizar una laparotomía como se describe en la sección 9.
   3. Una vez expuestas las anastomosis aorto-aórticas y PA-IVC, coloque una abrazadera Satinsky en la aorta receptora y otra en la IVC receptora para aislar el aloinjerto de la circulación sistémica.
   4. Inserte una cánula de raíz aórtica pediátrica de 4-Fr en la raíz aórtica del aloinjerto y conecte una línea de cardioplejia al catéter. Administrar 500 ml de cardioplejia del Nido en la raíz a una presión de 100-150 mmHg utilizando una bolsa de presión. Después de iniciar la infusión, use tijeras Metzenbaum para hacer una incisión de 2 cm a nivel de la anastomosis PA-IVC para ventilar el aloinjerto.
   5. Una vez detenido el aloinjerto, proceder a explantar el aloinjerto mediante el uso de tijeras Metzenbaum para extirpar a nivel de la anastomosis aorto-aórtica y el resto de la anastomosis PA-IVC. No retire ninguna de las abrazaderas Satinsky.
   6. Proceder a la extirpación del corazón torácico como se describe en la sección 5.
      NOTA: La única diferencia significativa es que las venas pulmonares no necesitan ser ligadas cuidadosamente y en su lugar pueden ser diseccionadas groseramente usando tijeras Metzenbaum al realizar la cardiectomía.

Resultados

Este grupo ha sobrevivido con éxito a 9 cerdos entre 5 y 35 días siguiendo el protocolo presentado aquí, dependiendo del diseño del estudio. De cada 10 cerdos que se han sometido a este protocolo, solo 1 murió prematuramente por complicaciones quirúrgicas, lo que arrojó una tasa de supervivencia del 90%. En la Figura 2 se muestra un diagrama de la configuración de un corazón heterotópico trasplantado en posición intraabdominal en un cerdo. Al determinar el sitio para la anastomosi...

Discusión

La administración de terapias durante la perfusión ex vivo en el trasplante cardíaco ofrece una estrategia para modificar el aloinjerto y mejorar potencialmente los resultados del trasplante. El protocolo presentado aquí incorpora el almacenamiento de perfusión sanguínea normotérmica ex vivo de última generación y ofrece un potencial prometedor para probar la administración aislada de células, genes o inmunoterapias al aloinjerto 11,12,13.^<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Looped Maxon suture	Covidien	GMM-341L	Used to close fascia of the laparotomy incision
0 Silk ties	Medtronic, Inc	S346
18 G Angiocath	BD	381144	Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation
20 Fr LV vent	Medtronic, Inc	12002
2-0 Silk sutures	Ethicon, Inc.	SA11G
2-0 Silk ties	Ethicon, Inc.	SA65H
2-0 Vicryl suture	Ethicon, Inc.	J259H
24 Fr venous cannula	Medtronic, Inc	68124
3-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8522
4-0 Monocryl suture	Ethicon, Inc.	Y469G
4-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8521
Animal hair cutting clipper	Wahl	8786-452
Aortic clamp	V. Mueller	CH6201
Army Navy retractor	V. Mueller	SU3660
ATF 40, Cell saver disposable set	Fresenius Kabi	9108494	Cell saver device insert
Balfour retractor	V. Mueller	SU3042	Used as an abdominal wall retractor
C.A.T.S cell saver	Fresenius Kabi	ES0019	Cell saver device used to wash donor blood
Cardiac defibrillator	Zoll	M Series	Cardiac defibrillator
Castro needle holder	V. Mueller	CH8589
CG4 iStat cartridges	Abbott	03P85-25	POC testing
CG8 iStat cartridges	Abbott	03P88-25	POC testing
DeBakey forceps	V. Mueller	CH5902
Electrocautery disposable pencil	Covidien	E2450H
Gerald forceps	V. Mueller	NL1451
Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater	Cincinnati Sub-Zero	86022	Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device
iSTAT 1	Abbott	04P75-03	POC testing device
Kocher clamp	V. Mueller	SU2790
Large clip applier	Sklar	50-4300
Large clips	Teleflex	4200
Large soft pledgets	Covidien	8886867901
Medium clip applier	Sklar	50-4335
Medium clips	Teleflex	2200
Metzenbaum scissor	V. Mueller	CH2006-001
No. 10 scalpel blade	Swann-Mortan	301	Used for skin incision
No. 11 scalpel blade	Kiato Plus	18111	Used for vascular incision
OCS device with base	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device
OCS disposable	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits
Pacing cable	Remington Medical	FL-601-97
Pediatric cardioplegia catheter (4Fr)	Medtronic, Inc	10218	Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root
Pediatric Foley catheter	Teleflex	RSH170003080	Placed pre-op to decompress the recipient's bladder
Potts scissors	V. Mueller	CH13038
Pressure bag x2 (1,000 mL)	Novaplus	V4010H	Used to deliver cardioplegia at a set pressure
Satinsky clamp	V. Mueller	CH7305	Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels
Scissors	Felco	FELCO 200A-50	Used to perform sternotomy
Small hard pledgets	Covidien	8886867701
Sternal retractor	V. Mueller	CH6950-007
Temporary cardiac pacing wires	Ethicon, Inc.	TPW32
Temporary dual chamber pacemaker	Medtronic, Inc	5388	Cardiac pacing device
Tourniquet kit	Medtronic, Inc	79005	Rummel tourniquets
Umbilical tape	Covidien	8886861903
Vessel loops	Covidien	31145686