Um Protocolo de Transplante de Coração Heterotópico Porcino para Entrega de Terapêutica a um Aoenxerto Cardíaco

Resumo

Apresentamos um protocolo para a utilização de um sistema de perfusão normal ex vivo sanguinous para a entrega de terapêutica a um aoentrato cardíaco inteiro em um modelo de transplante de coração heterotópico porcina.

Resumo

Transplante cardíaco é o tratamento padrão ouro para insuficiência cardíaca em estágio final. No entanto, permanece limitado pelo número de corações doadores disponíveis e complicações, como disfunção primária do enxerto e rejeição do enxerto. O recente uso clínico de um dispositivo de perfusão ex vivo em transplante cardíaco introduz uma oportunidade única para o tratamento de a lotoxeris cardíacos com intervenções terapêuticas para melhorar a função e evitar respostas deletérios do receptor. Estabelecer um modelo translacional e animal grande para entrega terapêutica a todo o aoenxerto é essencial para testar novas abordagens terapêuticas no transplante cardíaco. O modelo de transplante de coração suíno e heterotópico na posição intraabdominal serve como um excelente modelo para avaliar os efeitos de novas intervenções e a imunopatologia da rejeição do enxerto. Este modelo também oferece sobrevida a longo prazo para o suíno, uma vez que o enxerto não é necessário para manter a circulação do receptor. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para alcançar a entrega ex vivo de um terapêutico a toda a alusão cardíaca antes do transplante e fornecer detalhes técnicos para realizar um transplante heterotópico de sobrevivência do coração ex vivo perfumado.

Introdução

A insuficiência cardíaca é uma condição que afeta cerca de 6 milhões de adultos nos Estados Unidos e deve aumentar para 8 milhões de adultos até o ano de 2030¹. Transplante cardíaco é o tratamento padrão ouro para insuficiência cardíaca em estágio final. No entanto, não é sem suas limitações e complicações. Permanece limitado pelo número de corações doadores disponíveis, disfunção do enxerto primário, rejeição do coração e os efeitos colaterais da imunossupressão de longo prazo². Essas limitações são particularmente importantes em jovens receptores que podem sofrer falha de aoenxerto e requerem posterior reco transplante para alcançar a expectativa de vida normal.

Uma intervenção ideal para superar essas limitações trataria a loenxertos cardíacos inteiros com terapêutica antes da implantação no receptor que pode melhorar a viabilidade do aoenxerto e conferir "cardioproteção". Tais intervenções seriam dadas profilaticamente para minimizar a incidência de insultos isquêmicos, rejeição de aloenxerto, vasculopatia de aloenxerto cardíaco e até mesmo reparar aloenxertos marginais. Estudos translacionais para o desenvolvimento desses tipos de intervenções requerem um modelo animal de transplante cardíaco para permitir a vigilância a longo prazo do enxerto cardíaco. O modelo de transplante de coração suíno e heterotópico na posição intraabdominal tem se mostrado ideal para este fim. O transplante de coração nesta posição permite testar os efeitos de novas terapias e avaliar a imunopatologia da rejeição do enxerto. Além disso, o modelo heterotópico é vantajoso sobre o modelo ortotópico devido à melhor sobrevida geral do receptor, sem necessidade de bypass cardiopulmonar e sem necessidade do enxerto para manter a circulação do receptor³.

A efetiva entrega de intervenções terapêuticas ao coração, como gene, celular ou imunoterapia, é uma barreira significativa para a aplicação clínica ^4,5. A tecnologia introduzida pelos dispositivos de perfusão ex vivo permite que os enxertos sejam continuamente perfundidos, mantendo-os em um estado não trabalhador, mas metabolicamente ativo 6,7,8,9. Isso oferece uma oportunidade única para tratar um coração inteiro com terapêutica avançada, minimizando os potenciais efeitos colaterais do parto sistêmico 10,11,12,13. Outra vantagem de utilizar dispositivos de perfusão ex vivo para entrega terapêutica é que eles permitem a administração de medicamentos para a circulação coronariana por períodos prolongados que não são viáveis usando métodos tradicionais de armazenamento estático frio. Isso permite uma entrega mais global da terapêutica ao enxerto¹⁴. Usando o protocolo aqui apresentado, entregamos com sucesso o gene luciferase de vagalume a um enxerto cardíaco porcino inteiro usando vetores adenovirais¹⁵. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para a realização da entrega de um terapêutico para toda a alusão cardíaca antes do transplante.

Protocolo

NOTA: São selecionados dois suínos yucatán fêmeas, com um designado para ser o doador de enxerto cardíaco e o outro o receptor. Recomenda-se suínos de 6 a 8 meses, pesando aproximadamente 30 kg e com tipos sanguíneos compatíveis. A visão geral do protocolo é demonstrada na Figura 1. Os procedimentos de moradia e tratamento dos suínos são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Duke University Medical Center.

1. Preparação do dispositivo de perfusão ex vivo

1. Prepare o dispositivo de perfusão ex vivo e um dispositivo de poupança celular para uso de acordo com as diretrizes do fabricante.
2. Tenha uma caixa de ritmo e desfibrilador disponíveis e configure-os.
3. Tenha um dispositivo de teste ponto de cuidado (POC) disponível para verificar uma contagem completa de sangue (CBC), painel metabólico básico (BMP) e gás arterial (ABG).
4. Adicione os seguintes medicamentos à solução de escoramento de perfusão fornecida pelo fabricante, se ainda não estiver presente na solução de perfusão do fabricante: 100 mL de 25% de albumina, 10 mL de 200 mg/100 mL ciprofloxacina, 1 g de sódio cefazolina, dois frascos de 5 mL de injeção multivitamina, 250 mg de metilprednisolona, 10.000 UI de heparina, e 50 UI de insulina.
   1. Realize testes POC da solução de escoramento de dispositivos ex vivo para garantir que os níveis de eletrólitos estejam dentro da faixa fisiológica normal. Se não, administre gluconato de cálcio, dextrose e/ou bicarbonato de sódio em conformidade para complementar quaisquer níveis de eletrólito ou glicose subterapêutica.
5. Para adicionar a solução de escorva com os medicamentos adicionados, espete a solução e desa arejada da linha entregando a solução para o dispositivo de perfusão ex vivo .
   NOTA: Pule para a seção 6 para obter instruções sobre como preparar o dispositivo de perfusão ex vivo .

2. Iniciação da anestesia e acesso iv no suíno doador

1. Depois de jejuar o porco por 8-12 h, premeditá-lo com cetamina (5-33 mg/kg, intramuscular) e midazolam (0,2-0,5 mg/kg, intramuscular) e administrar isoflurane (1-4%) usando uma máscara facial.
2. Coloque o porco em posição supina e entubada com um tubo endotraqueal (ETT) (5,5-6,5 mm de diâmetro interno) para proteger as vias aéreas. Segure o ETT amarrando-o ao focinho do porco. Posicione as extremidades usando laços pesados presos à mesa.
3. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
4. Coloque um cateter intravenoso (IV) (20-22 G) em uma veia de ouvido.
5. Iniciar os fluidos IV de manutenção (solução lactated ringer a 10 mL·; kg·h)^-1).
6. Administrar a buprenorfina intramuscular (IM) 0,005-0,01 mg/kg para analgesia.

3. Sinais vitais e configurações da linha central

1. Inicie a ventilação mecânica a um volume de maré de 10 mL· (kg·min) ^-1 e uma taxa de 10-15 respirações por minuto com isoflurano (1-3%) mantidos durante todo o procedimento de tal forma que os reflexos estão ausentes e a frequência cardíaca (>60 bpm, <100 bpm) e pressão arterial (pressão arterial sistólica >90 mmHg, <130 mmHg) permanecem dentro da faixa fisiológica.
   NOTA: A adição de um paralítico é opcional.
2. Monitore continuamente a saturação de oxigênio e as frequências cardíacas durante toda a cirurgia.

4. Sternotomia mediana do porco doador

1. Palpate o esterno do manúbrio ao xifoide. Marque a linha média usando um marcador cirúrgico estéril. Raspe qualquer cabelo do local com um cortador de cabelo e esterilize a área usando 4% de clorexidina para um total de 3 rodadas de esterilização. Aplique uma cortina cirúrgica estéril ao redor do local cirúrgico imediato.
   NOTA: Os cirurgiões devem lavar as mãos e os braços com uma lavagem à base de álcool ou iodo e vestir vestidos e luvas estéreis.
2. Use uma lâmina nº 10 para fazer uma incisão do manúbrio até o xifoide, medindo 20-30 cm, dependendo do tamanho do porco.
3. Use eletrocauteria para dividir o peitoral maior do esterno para o xiphoide, tomando cuidado para fazer isso ao longo da linha média do esterno. Uma vez até o esterno, marque a linha média e comece a esternotomia a partir do xiphoide dividindo-o com uma tesoura pesada.
4. Estenda a cefaleia de esternotomia com uma tesoura pesada. Após cada corte, separe sem rodeios o coração do esterno usando varreduras de dedos. Desta forma, complete a esternotomia através do manúbrio.
5. Após completar a esternotomia, realize a hemostasia aplicando eletrocauteria nas bordas ósseas cortadas.
6. Coloque um retratedor severo e abra-o para otimizar a exposição do campo cirúrgico. Identifique e remova o timo com eletrocauteria. Digite o pericárdio longitudinalmente do diafragma até a aorta. Crie um berço pericárdial usando tamanho 5-6: 2-0, suturas de seda.

5. Parada cardíaca e cardiectomia do porco doador

1. Divida totalmente o tecido entre a aorta e a artéria pulmonar (PA) e visualize a localização do arco aórtico e do tronco braquiocefálico para facilitar a colocação adequada do grampo transversal aórtico.
   NOTA: A aorta ascendente é muito mais curta no porco versus humano.
2. Liberte circunferencialmente a veia cava superior (SVC) usando tesoura e dissecção contundente. Passe dois, tamanho: 0, laços de seda ao redor do SVC.
3. Liberte circunferencialmente a veia cava inferior (IVC) usando tesoura e dissecção sem cortes. Da mesma forma, passe duas gravatas de seda 0 ao redor do IVC.
4. Aplique um ponto U, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno na aorta ascendente.
5. Aplique uma bolsa-string, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno no átrio direito (RA).
6. Administre um bolus de heparina IV usando uma dose inicial de 300 U/kg.
7. Insira uma cânula raiz aórtica pediátrica de 4-Fr, fixada pelo ponto U previamente colocado. Deso arejar a cânula e fixá-la no lugar com um torniquete Rummel.
8. Conecte a cânula raiz aórtica à tubulação de cardioplegia depois que a tubulação tiver sido lavada com cardioplegia del Nido. Lave com a quantidade necessária para remover quaisquer bolhas de ar dentro da tubulação.
   NOTA: A comunicação com a equipe de perfusão é fundamental neste momento para executar corretamente a parada cardíaca.
   1. Certifique-se de que os perfusionistas instalaram os descartáveis do protetor de células de forma estéril, preparou o dispositivo conforme recomendado pelo fabricante (ver seção 6) e estão prontos para processar o sangue coletado.
   2. Confirme que a cardiotomia do protetor celular (recipiente plástico ligado ao dispositivo de poupança celular onde o sangue é armazenado após a lavagem) está pronta com 10.000 U de heparina e que a cardiotomia está ligada à sucção, não excedendo -150 mmHg de pressão.
      NOTA: Isto é para evitar hemólise de glóbulos vermelhos.
9. Crie uma atriotomia direita dentro da corda de bolsa previamente colocada, insira uma cânula venosa de 24 Fr no RA e fixe com um torniquete Rummel.
10. Conecte a cânula venosa a uma linha de sucção estéril conectada à cardiotomia do protetor celular e colete aproximadamente 1-1,3 L de sangue. Em seguida, aplique o grampo cruzado aórtico, assegurando cuidadosamente que o grampo oclui completamente a aorta ascendente. Administre 500 mL de cardioplegia Del Nido na raiz a uma pressão de 100-150 mmHg usando um saco de pressão.
    NOTA: O coração vai branqueá e prenderá.
11. Coloque lama de gelo estéril no coração.
12. Uma vez que a cardioplegia é entregue, remova a cânula raiz aórtica e a cânula venosa RA e amarre as suturas de corda da bolsa para baixo.
13. Divida o seguinte: o IVC, o SVC apenas proximal à veia azygos, a aorta ao nível do arco apenas distal à artéria Innominada, o PA principal na bifurcação, e a veia azygous esquerda quando entra no seio coronário.
    NOTA: Os porcos têm uma veia azygous esquerda que drena para o seio coronário.
14. Identifique as veias pulmonares e liga-as com tamanho: 2-0, laços de seda ou clipes de grande porte. Deixe uma veia pulmonar aberta para a inserção da ventilação lv.
15. Retire o coração do peito e coloque-o em um recipiente com lama de gelo estéril.
16. Mova o coração para o backtable para preparar o enxerto para colocação no dispositivo de perfusão ex vivo .

6. Lavar o sangue do doador e preparar o dispositivo de perfusão ex vivo

NOTA: Esta etapa é necessária para remover quaisquer componentes do soro do doador que possam neutralizar a entrega do terapêutico quando ele for introduzido no perfusado. Realize esta etapa durante a expiração do coração doador para minimizar o tempo isquêmico de aoenxerto.

1. Complete um prime de poupança de células e ciclo de lavagem.
   1. Instale os componentes descartáveis no dispositivo de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Prime o dispositivo de salvamento de células espiando Plasmalyte A e selecionando a função principal no dispositivo. Adicione tanto Plasmalyte A quanto o volume de sangue coletado do porco doador de forma 1:1.
      NOTA: Uma vez que o dispositivo complete o ciclo de escoramento, ele está pronto para a adição de sangue. Veja as seções 5.9-5.11 para como adicionar o sangue do porco doador.
   3. Uma vez que o sangue esteja no dispositivo, selecione o ciclo de lavagem no dispositivo de economia de células.
      NOTA: Durante este processo, o sangue é centrifuzado enquanto o Plasmalyte A é introduzido para lavar o sangue. Este passo concentra e lava o sangue.
2. Transfira o sangue lavado em um saco de coleta de sangue para transferência para o dispositivo ex vivo .
3. Adicione o sangue lavado ao dispositivo de perfusão ex vivo de acordo com as diretrizes do fabricante.
4. Prepare uma solução de epinefrina injetando 0,25 mg de epinefrina e 30 UI de insulina em 500 mL de 5% de dextrose na água durante a espinheiro da máquina ex vivo . Espetar a solução e desarvar a linha entregando a solução para o dispositivo ex vivo .
5. Adicione 10.000 U de heparina ao dispositivo de perfusão ex vivo .
6. Adicione 5% de albumina para reconstituir o sangue.
   NOTA: O volume de 5% de albumina adicionado ao dispositivo é igual à quantidade de plasma removido pelo dispositivo de economia de células. Isso é feito para ajudar a alcançar uma pressão oncótica fisiológica e hematócrito.
7. Ligue a bomba para fluir a 1-1,5 L/min para preparar o circuito com o prime claro, drogas e sangue administrado no reservatório. Depois de ligar o fluxo da bomba e circular o prime através do módulo de perfusão, certifique-se de que as linhas do circuito estão livres de ar.
   NOTA: O volume final da solução de manutenção é de 1000 mL, além do volume de sangue lavado.
8. Obtenha uma linha de base perfusada química POC e lactato usando o dispositivo de teste POC. Reponha eletrólitos conforme necessário.
   1. Adicione dextrose suficiente para manter um nível mínimo de glicose de 100 mg/dL.
   2. Adicione bicarbonato de sódio suficiente para manter uma meta mínima de pH de 7,4.
      NOTA: É importante que o bicarbonato de sódio adicionado não possa ser removido do perfusato. O excesso de sódio contribuirá para que o coração se torne edematoso e deve ser evitado. É preciso ter cuidado ao tratar o déficit base, pois o coração começará a corrigir o déficit base após a reanimação.
   3. Adicione gluconato de cálcio suficiente para manter um nível mínimo de cálcio ionizado de 0,8 mmol/L.
9. Afina a temperatura em 37 °C.
10. Ajuste a vazão do gás para 150 mL/min e ajuste conforme necessário para alcançar um nível fisiológico de pCO₂ .
11. Defina a meta média de pressão arterial (MAP) para 60-70 mmHg.
12. Abaixe o fluxo da bomba para 0,6 L/min.

7. Preparação instável do coração doador e reanimação do coração

1. Oversew o SVC. Coloque quatro penhorados, tamanho: 4-0, suturas de polipropileno em uma forma simples de colchão horizontal ao redor do interior da aorta distal, 5 mm abaixo da borda de corte e amarrá-los para baixo.
2. Enquanto segura o 4, tamanho: 4-0, suturas aórticas penhoradas, insira o conector aórtico na aorta e amarre uma fita umbilical ao redor da aorta para fixar o conector.
3. Coloque um tamanho: 4-0, bolsa de polipropileno-string em torno da borda de corte distal do PA principal. Insira a cânula pa e amarre as extremidades da corda da bolsa para fixar a cânula.
4. Leve o enxerto preparado do backtable para o dispositivo de perfusão ex vivo e conecte o conector aórtico ao dispositivo. Certifique-se de desararar o conector aorta/aórtico antes de fixar o coração no dispositivo.
5. Inicie o relógio de perfusão, mantenha o fluxo da bomba em torno de 0,6 L/min e diminua o ponto de temperatura para 34 °C.
6. Inicie os gotejamentos de epinefrina e manutenção de acordo com as recomendações do fabricante.
7. Conecte a cânula PA ao conector PA no dispositivo e fixe-a com uma gravata.
8. Coloque o ventrículo esquerdo (LV) dreno através da veia pulmonar desamanal no átrio esquerdo e através da válvula mitral na LV. Fixar a ventilação no lugar com um único ponto para ancorá-la adequadamente.
9. Coloque dois condutores de ritmo cardíaco na parede livre de LV.
10. Verifique lactato, ABG, CBC e BMP a cada hora. Administrar potássio, 50% dextrose e cálcio conforme necessário para manter os níveis fisiológicos normais.
    NOTA: A amostragem mais frequente de lactato pode ser apropriada durante a estabilização precoce para estabelecer perfusão adequada com base no lactato.
11. Se for necessário ritmo, defina o ritmo ventricular em 80 batidas por minuto a 10 mA (o ritmo atrial normalmente não é utilizado).
12. Se for necessária a desfibrilação, comece em 10 J após a temperatura no dispositivo atingir 34 °C. Não exceda 50 J.
    NOTA: O fluxo médio total da meta é de 600 mL/min, e o fluxo coronário médio é de 400 mL/min.

8. Administrar o terapêutico

1. Desenhe o terapêutico em uma seringa de forma estéril.
2. Desarme a porta cardioplegia usando uma seringa estéril de 3 mL para extrair sangue através da porta. Administre o terapêutico na porta cardioplegia (ou equivalente) de tal forma que o terapêutico seja introduzido diretamente na raiz aórtica.
3. Lave a porta com o volume de sangue coletado na etapa 8.2 ao desarmar a porta; tenha cuidado para não lavar nenhum ar com ele.
   NOTA: Isto é para garantir que a terapêutica seja administrada na raiz aórtica do coração.
   NOTA: Esta seção foi descrita anteriormente em detalhes em Bishawi et al. para introduzir vetores virais para expressão luciferase¹⁵.
4. Perfunda o enxerto no dispositivo por 2 h após a introdução do terapêutico.

9. Preparação do receptor e laparotomia com exposição vascular

1. Uma vez que o alusão cardíaca é fixado ao dispositivo e o terapêutico é introduzido no circuito, inicie a indução da anestesia e preparação pré-operatória, conforme descrito na seção 2 para o porco receptor.
2. Iniciar a infusão dos medicamentos de imunossupressão: ciclosporina 50 mg/kg total como uma infusão de gotejamento lento durante todo o procedimento e metilprednisolona 1 g iv bolus.
3. Aplicar antibióticos: enrofloxacina IM (5 mg/kg) e cefazolina 1 g IV bolus.
4. Insira um cateter Foley na bexiga.
   NOTA: Descomprimir os auxílios da bexiga com a obtenção de uma exposição ideal da aorta infrarenal e do IVC.
5. Marque a linha abdominal do meio do abdômen para o púbis usando um marcador cirúrgico estéril. Raspe qualquer cabelo do local com um cortador de cabelo e esterilize a área usando 4% de clorexidina para um total de 3 rodadas de esterilização. Aplique uma cortina cirúrgica estéril ao redor do local cirúrgico imediato.
   NOTA: Os cirurgiões devem lavar as mãos e os braços com uma lavagem à base de álcool ou iodo e vestir vestidos e luvas estéreis.
6. Use uma lâmina de 10 para incisionar a pele (incisão de 20-30 cm) e mude para eletrocauteria para dissecar até a fáscia.
7. Use dois grampos Kocher para levantar a fáscia e o peritônio e faça cuidadosamente uma pequena incisão (1 cm) na cavidade peritoneal usando uma tesoura Metzenbaum.
8. Estenda a abertura peritoneal para toda a extensão da incisão usando eletrocauteria, colocando um dedo por baixo para proteger as vísceras subjacentes. Coloque um retraínte Balfour para otimizar a exposição. Retraia o intestino delgado cranialmente e com toalhas molhadas.
9. Abra o espaço retroperitoneal inferior aos rins com cuidado direcionado para identificar os ureteres e evitar lesões.
10. Leve a dissecção até a aorta abdominal e IVC. Ligate os linfáticos com clipes médios e grandes.
11. Disseque os vasos circunferencialmente e exponha um segmento grande o suficiente para caber um grande grampo satinsky em torno de cada vaso. Tome cuidado para evitar o rompimento de ramos arteriais lombares, que saem da parte posterior da aorta. Coloque dois loops de vaso ao redor da aorta e IVC nas extremidades proximal e distal da exposição.

10. Prisão final e remoção do coração do dispositivo de perfusão ex vivo

1. No final das 2h de perfusão ex vivo , conecte a máquina aquecedora-refrigerador ao dispositivo ex vivo . Coloque a temperatura mais fria do aquecedor a 34 °C.
2. De forma estéril e sem ar, conecte a linha de entrega de cardioplegia desordenada ao dispositivo ex vivo na porta de acesso à aoórtica.
3. Desligue o ponto de configuração de temperatura do dispositivo ex vivo.
4. Reduza a temperatura do aquecedor-refrigerador para 24 °C e diminua o fluxo da bomba para manter o MAP entre 60 e 70 mmHg (tipicamente uma mudança no fluxo da bomba de 1 L/min para 0,9 L/min).
5. Uma vez que a leitura de temperatura no dispositivo de perfusão ex vivo atinja 24-26 °C, reduza a temperatura do aquecedor-refrigerador ainda mais para 14 °C e diminua ainda mais o fluxo da bomba em 100 mL/min.
6. Uma vez que a temperatura atinja 14-16 °C, retire a cânula pa da porta PA, inicie a entrega de antegrade del Nido (500 mL), feche a válvula da linha AO, pare a bomba e aperte rapidamente a linha de ventilação AO.
   NOTA: A pressão de entrega de cardioplegia precisa ser titulada para manter uma pressão média de entrega de 45-65 mmHg, como mostrado no monitor do dispositivo ex vivo .
7. Remova o coração do dispositivo de perfusão ex vivo desconectando a cânula pa e o conector aórtico e cortando os fios de ritmo.
8. Coloque o coração em um balde cheio de lama de gelo estéril.
9. Na linha de trás, sobresaque a veia pulmonar/atriotomia esquerda onde a ventilação lv tinha sido inserida. Corte (1 ou 2 mm) do aspecto distal da aorta e pa onde a fixação às cânulas pode ter esmagado o tecido.
   NOTA: O coração está pronto para implantação intraabdominal e heterotópica.

11. Implantação heterotópica do enxerto cardíaco

1. Antes de colocar os grampos de Satinsky, administre 300 U/kg de heparina intravenosa ao porco receptor.
2. Coloque um grampo satinsky no IVC e crie uma venotomia longitudinal medindo ~1,5 cm usando uma lâmina de 11 lâminas e a tesoura de Pott.
3. Anastomose o enxerto PA ao IVC infra-renal do receptor de forma de ponta a ponta usando uma corrida, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno. Realize a parte interna da anastomose primeiro e reforce conforme necessário com suturas interrompidas antes de completar a parte externa da anastomose.
   NOTA: A anastomose PA para IVC é realizada primeiro, e a anastomose aorta-à-aorta é feita por último para reduzir a duração da oclusão aórtica.
4. Coloque um grampo satinsky na aorta e crie uma aortotomia longitudinal medindo ~1,5 cm usando uma lâmina de 11 e a tesoura de Pott.
   NOTA: Obtenha um ABG antes da colocação do grampo. Verifique-o imediatamente após a liberação do grampo e novamente 15-30 minutos depois para avaliar quaisquer alterações na hipercalemia, hiperlacatiemia ou acidemia indicativa de lesão isquêmica no receptor.
5. Anastomose a aorta do enxerto à aorta infra-renal do receptor de forma de ponta a ponta usando uma corrida, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno. Realize a parte interna da anastomose primeiro e reforce conforme necessário com suturas interrompidas antes de completar a parte externa da anastomose.
6. Remova os grampos de Satinsky para reperfar o coração; primeiro, remova o grampo IVC seguido do grampo aórtico.
7. Coloque um angiocato de 18 G no ápice lv do enxerto para desatar. Quando feito, remova o angiocato e feche o local com uma sutura penhorada.
8. Verifique cuidadosamente os anastomoses para qualquer sangramento.
9. Coloque cuidadosamente o coração no espaço retroperitoneal direito, de tal forma que não haja tensão nos anastomoses e nenhuma torção dos vasos. Substitua o intestino delgado.

12. Encerramento da laparotomia

1. Feche a fáscia com looped, tamanho: 0, sutura Maxon em uma forma de corrida a partir de ambas as extremidades da incisão e amarrando no meio. Tome cuidado para evitar qualquer lesão no intestino.
2. Feche a camada dérmica profunda com tamanho: 2-0, Vicryl em uma forma de corrida e a pele com tamanho: 4-0, Monocril em uma forma de corrida.
3. Limpe a incisão da pele e aplique cola na pele.

13. Tratamento pós-cirúrgico e eutanásia

1. Após a conclusão da cirurgia, desligue o fluxo de isoflurano e monitore o porco para retorno do tom muscular e reflexos neuromusculares (reflexo córnea, retirada a estímulos dolorosos, engolindo).
2. Após confirmar a restauração dessas funções, desligue a ventilação mecânica e observe para respirar espontâneo. Se houver respiração espontânea, remova o tubo endotraqueal; se não houver, reconecte o tubo endotraqueal à ventilação mecânica.
3. Transfira o porco da mesa de operação para um recinto isolado onde seus sinais vitais (temperatura retatal, pressão arterial, frequência cardíaca) podem ser monitorados de perto. Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer o porco conforme necessário. Forneça um bolus de fluido IV de 250 mL da solução de Lactated Ringer no ajuste da hipotensão (pressão arterial sistólica < 100mmHg). Continue monitorando o porco até que ele possa manter a recumbência severa e sinais vitais são totalmente normalizados.
   NOTA: O animal não fica sozinho até recuperar a consciência suficiente. Além disso, o animal não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
4. Para o tratamento da dor, administre uma dose única de buprenorfina (liberação sustentada) injeção subcutânea 0,12 mg/kg para 72 h de analgesia.
5. Ao final do período experimental, eutanize o porco para explantação do coração nativo (torácico) e do coração aoentox (abdominal).
   1. Prepare o porco conforme descrito nas seções 2 e 3 para o procedimento. Prepare dois sacos de del Nido e duas linhas de cardioplegia para prender cada coração.
   2. Exponha o coração torácico como descrito na seção 4. Uma vez concluída, prossiga para realizar uma laparotomia como descrito na seção 9.
   3. Uma vez expostos os anastomoses aórticos e PA-IVC, coloque um grampo de Satinsky na aorta do receptor e outro no IVC receptor para isolar o alusorto da circulação sistêmica.
   4. Insira uma cânula de raiz aórtica pediátrica 4-Fr na raiz aórtica do aerógrafo e conecte uma linha de cardioplegia ao cateter. Administre 500 mL de cardioplegia del Nido na raiz a uma pressão de 100-150 mmHg usando um saco de pressão. Após o início da infusão, use a tesoura Metzenbaum para fazer uma incisão de 2 cm ao nível da anastomose PA-IVC para desabafar o aloenxerto.
   5. Uma vez que o aerógrafo é preso, proceda a explantar o alusão usando tesouras Metzenbaum para extirpa ao nível da anastomose aórtica e o restante da anastomose PA-IVC. Não remova nenhum dos grampos de Satinsky.
   6. Prossiga com a remoção do coração torácico como descrito na seção 5.
      NOTA: A única diferença significativa é que as veias pulmonares não precisam ser cuidadosamente ligadas e podem ser grosseiramente dissecadas usando tesouras Metzenbaum ao realizar a cardiectomia.

Resultados

Esse grupo sobreviveu com sucesso a 9 suínos entre 5 e 35 dias após o protocolo apresentado aqui, dependendo do desenho do estudo. Dos 10 suínos submetidos a este protocolo, apenas 1 morreu prematuramente por complicações cirúrgicas, gerando uma taxa de sobrevivência de 90%. Demonstrado na Figura 2 é um diagrama da configuração de um coração heterotópico transplantado na posição intraabdominal em um porco. Ao determinar o local para anastomose do alusão, selecione um site que...

Discussão

A entrega de terapêutica durante a ex vivo perfusão em transplante cardíaco oferece uma estratégia para modificar o aoenxerto e potencialmente melhorar os resultados do transplante. O protocolo aqui apresentado incorpora o armazenamento de perfusão normoérmico de última geração e oferece potencial promissor para testar a entrega isolada de células, genes ou imunoterápicos ao alusão 11,12,13. Até o ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Looped Maxon suture	Covidien	GMM-341L	Used to close fascia of the laparotomy incision
0 Silk ties	Medtronic, Inc	S346
18 G Angiocath	BD	381144	Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation
20 Fr LV vent	Medtronic, Inc	12002
2-0 Silk sutures	Ethicon, Inc.	SA11G
2-0 Silk ties	Ethicon, Inc.	SA65H
2-0 Vicryl suture	Ethicon, Inc.	J259H
24 Fr venous cannula	Medtronic, Inc	68124
3-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8522
4-0 Monocryl suture	Ethicon, Inc.	Y469G
4-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8521
Animal hair cutting clipper	Wahl	8786-452
Aortic clamp	V. Mueller	CH6201
Army Navy retractor	V. Mueller	SU3660
ATF 40, Cell saver disposable set	Fresenius Kabi	9108494	Cell saver device insert
Balfour retractor	V. Mueller	SU3042	Used as an abdominal wall retractor
C.A.T.S cell saver	Fresenius Kabi	ES0019	Cell saver device used to wash donor blood
Cardiac defibrillator	Zoll	M Series	Cardiac defibrillator
Castro needle holder	V. Mueller	CH8589
CG4 iStat cartridges	Abbott	03P85-25	POC testing
CG8 iStat cartridges	Abbott	03P88-25	POC testing
DeBakey forceps	V. Mueller	CH5902
Electrocautery disposable pencil	Covidien	E2450H
Gerald forceps	V. Mueller	NL1451
Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater	Cincinnati Sub-Zero	86022	Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device
iSTAT 1	Abbott	04P75-03	POC testing device
Kocher clamp	V. Mueller	SU2790
Large clip applier	Sklar	50-4300
Large clips	Teleflex	4200
Large soft pledgets	Covidien	8886867901
Medium clip applier	Sklar	50-4335
Medium clips	Teleflex	2200
Metzenbaum scissor	V. Mueller	CH2006-001
No. 10 scalpel blade	Swann-Mortan	301	Used for skin incision
No. 11 scalpel blade	Kiato Plus	18111	Used for vascular incision
OCS device with base	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device
OCS disposable	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits
Pacing cable	Remington Medical	FL-601-97
Pediatric cardioplegia catheter (4Fr)	Medtronic, Inc	10218	Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root
Pediatric Foley catheter	Teleflex	RSH170003080	Placed pre-op to decompress the recipient's bladder
Potts scissors	V. Mueller	CH13038
Pressure bag x2 (1,000 mL)	Novaplus	V4010H	Used to deliver cardioplegia at a set pressure
Satinsky clamp	V. Mueller	CH7305	Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels
Scissors	Felco	FELCO 200A-50	Used to perform sternotomy
Small hard pledgets	Covidien	8886867701
Sternal retractor	V. Mueller	CH6950-007
Temporary cardiac pacing wires	Ethicon, Inc.	TPW32
Temporary dual chamber pacemaker	Medtronic, Inc	5388	Cardiac pacing device
Tourniquet kit	Medtronic, Inc	79005	Rummel tourniquets
Umbilical tape	Covidien	8886861903
Vessel loops	Covidien	31145686