Ein porcines heterotopes Herztransplantationsprotokoll für die Abgabe von Therapeutika an ein kardiales Allotransplantat

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die Verwendung eines normothermen ex vivo sanguinösen Perfusionssystems für die Abgabe von Therapeutika an ein ganzes kardiales Allotransplantat in einem porcinen heterotopen Herztransplantationsmodell.

Zusammenfassung

Die Herztransplantation ist die Goldstandardbehandlung für Herzinsuffizienz im Endstadium. Es bleibt jedoch durch die Anzahl der verfügbaren Spenderherzen und Komplikationen wie primäre Transplantatdysfunktion und Transplantatabstoßung begrenzt. Der jüngste klinische Einsatz eines Ex-vivo-Perfusionsgeräts bei der Herztransplantation bietet eine einzigartige Gelegenheit zur Behandlung von Herzallotransplantaten mit therapeutischen Interventionen, um die Funktion zu verbessern und schädliche Reaktionen der Empfänger zu vermeiden. Die Etablierung eines translationalen Großtiermodells für die therapeutische Verabreichung des gesamten Allotransplantats ist unerlässlich, um neuartige therapeutische Ansätze in der Herztransplantation zu testen. Das porcine, heterotope Herztransplantationsmodell in der intraabdominalen Position dient als hervorragendes Modell zur Beurteilung der Auswirkungen neuartiger Interventionen und der Immunpathologie der Transplantatabstoßung. Dieses Modell bietet dem Schwein zusätzlich ein langfristiges Überleben, da das Transplantat nicht erforderlich ist, um den Kreislauf des Empfängers aufrechtzuerhalten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren und robusten Ansatz für die Ex-vivo-Abgabe eines Therapeutikums an das gesamte kardiale Allotransplantat vor der Transplantation bereitzustellen und technische Details für die Durchführung einer überlebensheterotopen Transplantation des ex vivo perfundierten Herzens bereitzustellen.

Einleitung

Herzinsuffizienz ist eine Erkrankung, von der schätzungsweise 6 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten betroffen sind und die bis zum Jahr 2030 voraussichtlich auf 8 Millionen Erwachsene ansteigen wird¹. Die Herztransplantation ist die Goldstandardbehandlung für Herzinsuffizienz im Endstadium. Es ist jedoch nicht ohne Einschränkungen und Komplikationen. Es bleibt begrenzt durch die Anzahl der verfügbaren Spenderherzen, die primäre Transplantatdysfunktion, die Abstoßung des Herzens und die Nebenwirkungen der langfristigen Immunsuppression². Diese Einschränkungen sind besonders wichtig bei jungen Empfängern, bei denen ein Allotransplantatversagen auftreten kann und eine anschließende erneute Transplantation erforderlich ist, um eine normale Lebenserwartung zu erreichen.

Eine ideale Intervention zur Überwindung dieser Einschränkungen würde ganze Herzallotransplantate vor der Implantation in den Empfänger mit Therapeutika behandeln, die die Lebensfähigkeit des Allotransplantats verbessern und "Kardioprotektion" verleihen können. Solche Interventionen würden prophylaktisch verabreicht, um die Häufigkeit von ischämischen Beleidigungen, Allotransplantatabstoßung, kardialer Allotransplantatvaskulopathie zu minimieren und sogar marginale Allotransplantate zu reparieren. Translationale Studien zur Entwicklung dieser Art von Interventionen erfordern ein Großtiermodell der Herztransplantation, um die langfristige Überwachung des Herztransplantats zu ermöglichen. Das porcine, heterotope Herztransplantationsmodell in intraabdominaler Position hat sich für diesen Zweck als ideal erwiesen. Die Herztransplantation in dieser Position ermöglicht es, die Auswirkungen neuartiger Therapien zu testen und die Immunpathologie der Transplantatabstoßung zu beurteilen. Darüber hinaus ist das heterotope Modell gegenüber dem orthotopen Modell vorteilhaft, da das Gesamtüberleben des Empfängers, kein kardiopulmonaler Bypass erforderlich ist und das Transplantat nicht erforderlich ist, um den Kreislauf des Empfängers aufrechtzuerhalten³.

Die effektive Durchführung therapeutischer Interventionen am Herzen, wie Gen-, Zell- oder Immuntherapie, ist ein signifikantes Hindernis für die klinische Anwendung ^4,5. Die von Ex-vivo-Perfusionsgeräten eingeführte Technologie ermöglicht es, Transplantate kontinuierlich zu durchbluten und sie in einem nicht funktionierenden, aber metabolisch aktiven Zustand zu halten 6,7,8,9. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, ein ganzes Herz mit fortschrittlichen Therapeutika zu behandeln und gleichzeitig die möglichen Nebenwirkungen der systemischen Verabreichung^{zu minimieren 10,11,12,13}. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Ex-vivo-Perfusionsgeräten für die therapeutische Verabreichung besteht darin, dass sie die Verabreichung von Medikamenten an den Koronarkreislauf über längere Zeiträume ermöglichen, die mit herkömmlichen statischen Kaltspeichermethoden nicht möglich sind. Dies ermöglicht eine globalere Abgabe der Therapeutika an das Transplantat¹⁴. Unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls haben wir das Glühwürmchen-Luciferase-Gen erfolgreich mit adenoviralen Vektoren¹⁵ an ein ganzes porcines Herztransplantat abgegeben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren und robusten Ansatz für die Abgabe eines Therapeutikums an das gesamte kardiale Allotransplantat vor der Transplantation bereitzustellen.

Protokoll

HINWEIS: Zwei weibliche Yucatan-Schweine werden ausgewählt, wobei eines als Herztransplantatspender und das andere als Empfänger bestimmt ist. Schweine im Alter von 6-8 Monaten, mit einem Gewicht von ca. 30 kg und kompatiblen Blutgruppen werden empfohlen. Die Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Unterbringung und die Behandlungsverfahren für die Schweine werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee des Duke University Medical Center durchgeführt.

1. Vorbereitung der Ex-vivo-Perfusionsvorrichtung

1. Bereiten Sie das Ex-vivo-Perfusionsgerät und ein Zellenspargerät für die Verwendung gemäß den Richtlinien des Herstellers vor.
2. Halten Sie eine Pacing-Box und einen Defibrillator bereit und richten Sie sie ein.
3. Halten Sie ein Point-of-Care (POC) -Testgerät zur Verfügung, um ein vollständiges Blutbild (CBC), ein metabolisches Basispanel (BMP) und ein arterielles Blutgas (ABG) zu überprüfen.
4. Fügen Sie der vom Hersteller bereitgestellten Perfusionsprimierungslösung die folgenden Medikamente hinzu, sofern sie nicht bereits in der Perfusionslösung des Herstellers vorhanden sind: 100 ml 25% Albumin, 10 ml 200 mg/100 ml Ciprofloxacin, 1 g Cefazolin-Natrium, zwei 5 ml Durchstechflaschen mit Multivitamin-Injektion, 250 mg Methylprednisolon, 10.000 IE Heparin und 50 IE Insulin.
   1. Führen Sie POC-Tests der Ex-vivo-Vorrichtungslösung durch, um sicherzustellen, dass die Elektrolytwerte innerhalb des normalen physiologischen Bereichs liegen. Wenn nicht, verabreichen Sie Calciumgluconat, Dextrose und / oder Natriumbicarbonat entsprechend, um den subtherapeutischen Elektrolyt- oder Glukosespiegel zu ergänzen.
5. Um die Grundierungslösung mit den hinzugefügten Medikamenten hinzuzufügen, spitzen Sie die Lösung und entlüften Sie die Leitung, die die Lösung an das Ex-vivo-Perfusionsgerät liefert.
   HINWEIS: In Abschnitt 6 finden Sie Anweisungen zum Ansaugen des Ex-vivo-Perfusionsgeräts .

2. Einleitung der Anästhesie und IV-Zugang beim Spenderschwein

1. Nach dem Fasten des Schweins für 8-12 h, behandeln Sie es mit Ketamin (5-33 mg/kg, intramuskulär) und Midazolam (0,2-0,5 mg/kg, intramuskulär) und verabreichen Sie Isofluran (1-4%) mit einer Gesichtsmaske.
2. Legen Sie das Schwein in Rückenlage und intubieren Sie es mit einem Endotrachealtubus (ETT) (5,5-6,5 mm Innendurchmesser), um die Atemwege zu schützen. Sichern Sie das ETT, indem Sie es an die Schnauze des Schweins binden. Positionieren Sie die Extremitäten mit schweren Bindungen, die am Tisch befestigt sind.
3. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
4. Legen Sie einen intravenösen (IV) Katheter (20-22 G) in eine Ohrvene.
5. Initiieren Sie Erhaltungs-IV-Flüssigkeiten (Lactated Ringer's Solution bei 10 ml·( kg·h)^-1).
6. Verabreichen Sie intramuskuläres (IM) Buprenorphin 0,005-0,01 mg / kg für Analgesie.

3. Vitalzeichen und zentrale Linieneinstellungen

1. Beginnen Sie mit der mechanischen Beatmung bei einem Tidalvolumen von 10 ml· (kg·min) ^-1 und eine Rate von 10-15 Atemzügen pro Minute mit Isofluran (1-3%) während des gesamten Eingriffs aufrechterhalten, so dass Reflexe fehlen und die Herzfrequenz (>60 bpm, <100 bpm) und der Blutdruck (systolischer Blutdruck >90 mmHg, <130 mmHg) im physiologischen Bereich bleiben.
   HINWEIS: Die Zugabe eines Lähmungsmittels ist optional.
2. Überwachen Sie kontinuierlich die Sauerstoffsättigung und die Herzfrequenz während der gesamten Operation.

4. Mediane Sternotomie des Spenderschweins

1. Palpieren Sie das Brustbein vom Manubrium bis zum Xiphoid. Markieren Sie die Mittellinie mit einem sterilen chirurgischen Marker. Rasieren Sie alle Haare von der Website mit einer Haarschneidemaschine und sterilisieren Sie den Bereich mit 4% Chlorhexidin für insgesamt 3 Sterilisationsrunden. Tragen Sie ein steriles chirurgisches Tuch um die unmittelbare Operationsstelle an.
   HINWEIS: Chirurgen müssen Hände und Arme mit einer alkohol- oder jodbasierten Wäsche waschen und sterile Kittel und Handschuhe anziehen.
2. Verwenden Sie eine Klinge Nr. 10, um einen Schnitt vom Manufrium bis zum Xiphoid zu machen, der je nach Größe des Schweins 20-30 cm misst.
3. Verwenden Sie Elektrokauterisation, um die Pectoralis major vom Brustbein zum Xiphoid zu teilen, wobei Sie darauf achten, dies entlang der Mittellinie des Brustbeins zu tun. Sobald Sie zum Brustbein hinuntergegangen sind, ritzen Sie die Mittellinie ab und beginnen Sie die Sternotomie vom Xiphoid aus, indem Sie sie mit einer schweren Schere teilen.
4. Verlängern Sie die Sternotomie-Cephalade mit einer schweren Schere. Trennen Sie nach jedem Schnitt stumpf das Herz vom Brustbein mit Fingerstreichern. Auf diese Weise vervollständigen Sie die Sternotomie durch das Manubrium.
5. Nach Abschluss der Sternotomie erreichen Sie eine Hämostase, indem Sie Elektrokauterisation auf die geschnittenen Knochenkanten auftragen.
6. Platzieren Sie einen Sternalretraktor und öffnen Sie ihn, um die Exposition des Operationsfeldes zu optimieren. Identifizieren und entfernen Sie den Thymus mit Elektrokauterisation. Geben Sie das Perikard längs vom Zwerchfell bis zur Aorta ein. Erstellen Sie eine Perikardwiege mit der Größe 5-6: 2-0, Seidennähte.

5. Herzstillstand und Cardiektomie des Spenderschweins

1. Teilen Sie das Gewebe vollständig zwischen der Aorta und der Lungenarterie (PA) auf und visualisieren Sie die Lage des Aortenbogens und des brachiozephalen Rumpfes, um die richtige Platzierung der Aortenkreuzklemme zu erleichtern.
   HINWEIS: Die aufsteigende Aorta ist beim Schwein im Vergleich zum Menschen viel kürzer.
2. Umlaufend befreien Sie die obere Hohlvene (SVC) mit einer Schere und stumpfer Dissektion. Pass zwei, Größe: 0, Seide bindet um den SVC.
3. Umlaufend befreien Sie die untere Hohlvene (IVC) mit einer Schere und stumpfer Dissektion. Führen Sie in ähnlicher Weise zwei 0-Seidenbinden um die IVC herum.
4. Tragen Sie einen U-Stich, Größe: 4-0, Polypropylennaht auf die aufsteigende Aorta auf.
5. Tragen Sie eine Handtasche, Größe: 4-0, Polypropylennaht auf den rechten Vorhof (RA) auf.
6. Verabreichen Sie einen Bolus Heparin IV mit einer Anfangsdosis von 300 U/kg.
7. Setzen Sie eine pädiatrische 4-Fr-Aortenwurzelkanüle ein, die durch den zuvor platzierten U-Stich gesichert ist. Entlüften Sie die Kanüle und befestigen Sie sie mit einem Rummel-Tourniquet.
8. Verbinden Sie die Aortenwurzelkanüle mit dem Kardioplegieschlauch, nachdem der Schlauch mit del Nido-Kardioplegie gespült wurde. Spülen Sie mit der notwendigen Menge, um Luftblasen im Schlauch zu entfernen.
   HINWEIS: Die Kommunikation mit dem Perfusionsteam ist zu diesem Zeitpunkt entscheidend, um den Herzstillstand korrekt auszuführen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Perfusionisten die Einwegartikel des Zellretters steril installiert haben, das Gerät wie vom Hersteller empfohlen vorbereitet haben (siehe Abschnitt 6) und bereit sind, das gesammelte Blut zu verarbeiten.
   2. Bestätigen Sie, dass die Zellsparkardiotomie (Kunststoffbehälter, der an das Zellspargerät angeschlossen ist, in dem das Blut nach dem Waschen gelagert wird) mit 10.000 U Heparin bereit ist und dass die Kardiotomie mit einer Absaugung verbunden ist, die -150 mmHg Druck nicht überschreiten darf.
      HINWEIS: Dies dient dazu, eine Hämolyse der roten Blutkörperchen zu vermeiden.
9. Erstellen Sie eine rechte Atriotomie innerhalb der zuvor platzierten Geldbeutelsaite, führen Sie eine 24 Fr venöse Kanüle in die RA ein und sichern Sie sie mit einem Rummel-Tourniquet.
10. Verbinden Sie die Venenkanüle mit einer sterilen Saugleitung, die mit der Zellretter-Kardiotomie verbunden ist, und sammeln Sie etwa 1-1,3 l Blut. Wenden Sie dann die Aortenkreuzklemme an und stellen Sie vorsichtig sicher, dass die Klemme die aufsteigende Aorta vollständig verdeckt. Verabreichen Sie 500 ml Del Nido-Kardioplegie in die Wurzel bei einem Druck von 100-150 mmHg mit einem Druckbeutel.
    HINWEIS: Das Herz wird blanchieren und festhalten.
11. Legen Sie sterilen Eismatsch auf das Herz.
12. Sobald die Kardioplegie geliefert ist, entfernen Sie die Aortenwurzelkanüle und die RA-Venenkanüle und binden Sie die Handtuch-String-Nähte fest.
13. Teilen Sie die folgenden Teile auf: die IVC, die SVC nur proximal zur Azygosvene, die Aorta auf der Höhe des Bogens, die gerade distal zur Arteria Innominate ist, die Haupt-PA an der Bifurkation und die linke Azygote Vene, wenn sie in die Koronarhöhle eintritt.
    HINWEIS: Schweine haben eine linke azygote Vene, die in die Koronarhöhle abfließt.
14. Identifizieren Sie die Lungenvenen und ligieren Sie sie mit Größe: 2-0, Seidenkrawatten oder großformatige Clips. Lassen Sie eine Lungenvene für das Einführen der LV-Entlüftung offen.
15. Entfernen Sie das Herz aus der Brust und legen Sie es in einen Behälter mit sterilem Eismatsch.
16. Bewegen Sie das Herz auf den Backtable, um das Transplantat für die Platzierung auf dem Ex-vivo-Perfusionsgerät vorzubereiten.

6. Waschen des Spenderblutes und Grundieren des Ex-vivo-Perfusionsgeräts

HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um alle Komponenten aus dem Spenderserum zu entfernen, die die Abgabe des Therapeutikums neutralisieren könnten, wenn es in das Perfusat eingeführt wird. Führen Sie diesen Schritt während der Explantation des Spenderherzens durch, um die ischämische Zeit des Allotransplantats zu minimieren.

1. Schließen Sie einen Zellenspar-Prime- und Waschzyklus ab.
   1. Installieren Sie die Einwegkomponenten gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Gerät.
   2. Grundieren Sie das Zellenspargerät, indem Sie Plasmalyte A spiken und die Prime-Funktion des Geräts auswählen. Fügen Sie so viel Plasmalyte A hinzu wie das Volumen des Blutes, das vom Spenderschwein in einer 1: 1-Weise gesammelt wurde.
      HINWEIS: Sobald das Gerät den Priming-Zyklus abgeschlossen hat, ist es bereit für die Zugabe von Blut. Siehe Abschnitte 5.9-5.11, um zu erfahren, wie das Blut des Spenderschweins hinzugefügt wird.
   3. Sobald sich das Blut im Gerät befindet, wählen Sie den Waschzyklus auf dem Zellspargerät aus.
      HINWEIS: Während dieses Prozesses wird das Blut zentrifugiert, während der Plasmalyt A eingeführt wird, um das Blut zu waschen. Dieser Schritt konzentriert und wäscht das Blut.
2. Geben Sie das gewaschene Blut in einen Blutentnahmebeutel zur Übertragung auf das Ex-vivo-Gerät .
3. Fügen Sie das gewaschene Blut gemäß den Richtlinien des Herstellers dem Ex-vivo-Perfusionsgerät hinzu.
4. Bereiten Sie eine Epinephrinlösung vor, indem Sie 0,25 mg Epinephrin und 30 IE Insulin während der Grundierung der Ex-vivo-Maschine in 500 ml 5% Dextrose in Wasser injizieren. Erhöhen Sie die Lösung und entlüften Sie die Leitung, um die Lösung an das Ex-vivo-Gerät zu liefern.
5. Fügen Sie der Ex-vivo-Perfusionsanlage 10.000 HE Heparin hinzu.
6. Fügen Sie 5% Albumin hinzu, um das Blut zu rekonstituieren.
   HINWEIS: Das Volumen von 5% Albumin, das dem Gerät hinzugefügt wird, entspricht der Menge an Plasma, die vom Zellspargerät entfernt wird. Dies geschieht, um einen physiologischen onkotischen Druck und Hämatokrit zu erreichen.
7. Schalten Sie die Pumpe ein, um mit 1-1,5 l / min zu fließen, um den Stromkreis mit dem klaren Prime, den Medikamenten und dem Blut, das in das Reservoir verabreicht wird, anzukurbeln. Nachdem Sie den Pumpenstrom eingeschaltet und die Prime durch das Perfusionsmodul umgewälzt haben, stellen Sie sicher, dass die Leitungen des Kreislaufs luftfrei sind.
   HINWEIS: Das endgültige Volumen der Wartungslösung beträgt zusätzlich zum Volumen des gewaschenen Blutes 1000 ml.
8. Erhalten Sie mit dem POC-Testgerät eine Perfusat-POC-Chemie und Laktat. Elektrolyte nach Bedarf auffüllen.
   1. Fügen Sie genügend Dextrose hinzu, um einen minimalen Glukosespiegel von 100 mg / dl aufrechtzuerhalten.
   2. Fügen Sie genügend Natriumbicarbonat hinzu, um ein minimales pH-Ziel von 7,4 aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Wichtig ist, dass zugesetztes Natriumbicarbonat nicht aus dem Perfusat entfernt werden kann. Überschüssige Natriumspiegel tragen dazu bei, dass das Herz ödematös wird und muss vermieden werden. Bei der Behandlung des Basisdefizits ist Vorsicht geboten, da das Herz bei der Reanimation beginnt, das Basisdefizit zu korrigieren.
   3. Fügen Sie genügend Calciumgluconat hinzu, um einen minimalen ionisierten Calciumspiegel von 0,8 mmol / L aufrechtzuerhalten.
9. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
10. Stellen Sie den Gasdurchsatz auf 150 ml/min ein und passen Sie ihn nach Bedarf an, um einen_{physiologischen pCO 2-Wert} zu erreichen.
11. Setzen Sie das mittlere arterielle Druckziel (MAP) auf 60-70 mmHg.
12. Verringern Sie den Pumpendurchfluss auf 0,6 l/min.

7. Backtable Vorbereitung des Spenderherzens und Reanimation des Herzens

1. Übernähen Sie den SVC. Legen Sie vier verpfändete, Größe: 4-0, Polypropylennähte in einer einfachen horizontalen Matratzenweise um die Innenseite der distalen Aorta, 5 mm unter der Schnittkante und binden Sie sie fest.
2. Während Sie die 4, Größe: 4-0, verpfändete Aortennähte hochhalten, stecken Sie den Aortenverbinder in die Aorta und binden Sie ein Nabelband um die Aorta, um den Stecker zu sichern.
3. Legen Sie eine Größe: 4-0, Polypropylen-Geldbörsenschnur um die distale Schnittkante der Haupt-PA. Setzen Sie die PA-Kanüle ein und binden Sie die Enden der Geldbörse fest, um die Kanüle zu sichern.
4. Nehmen Sie das vorbereitete Transplantat vom Backtable zum Ex-vivo-Perfusionsgerät und schließen Sie den Aortenstecker an das Gerät an. Stellen Sie sicher, dass Sie den Aorten-/Aortenanschluss entlüften, bevor Sie das Herz am Gerät befestigen.
5. Starten Sie die Perfusionsuhr, halten Sie den Pumpendurchfluss um 0,6 l/min und senken Sie den Temperatursollwert auf 34 °C.
6. Starten Sie das Adrenalin und die Wartungstropfen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
7. Verbinden Sie die PA-Kanüle mit dem PA-Anschluss am Gerät und sichern Sie sie mit einer Krawatte.
8. Platzieren Sie den Abfluss des linken Ventrikels (LV) durch die ungebundene Lungenvene in den linken Vorhof und über die Mitralklappe in den LV. Befestigen Sie die Entlüftung mit einem einzigen Stich, um sie richtig zu verankern.
9. Platzieren Sie zwei Herzschrittmacher auf die LV-freie Wand.
10. Überprüfen Sie stündlich Laktat, ABG, CBC und BMP. Verabreichen Sie Kalium, 50% Dextrose und Kalzium nach Bedarf, um ein normales physiologisches Niveau aufrechtzuerhalten.
    HINWEIS: Eine häufigere Laktatprobenahme kann während der frühen Stabilisierung angebracht sein, um eine ausreichende Perfusion auf der Grundlage von Laktat festzustellen.
11. Wenn Pacing erforderlich ist, stellen Sie das ventrikuläre Tempo auf 80 Schläge pro Minute bei 10 mA ein (Vorhof-Pacing wird normalerweise nicht verwendet).
12. Wenn eine Defibrillation erforderlich ist, beginnen Sie bei 10 J, nachdem die Temperatur am Gerät 34 ° C erreicht hat. Überschreiten Sie nicht 50 J.
    HINWEIS: Der durchschnittliche Gesamtdurchfluss beträgt 600 ml/min und der durchschnittliche koronare Durchfluss 400 ml/min.

8. Verabreichung des therapeutischen

1. Ziehen Sie das Therapeutikum steril in eine Spritze.
2. Entlüften Sie den Kardioplegie-Port, indem Sie eine sterile 3-ml-Spritze verwenden, um Blut durch den Port zu ziehen. Verabreichen Sie das Therapeutikum in den Kardioplegie-Port (oder gleichwertig), so dass das Therapeutikum direkt in die Aortenwurzel eingeführt wird.
3. Spülen Sie den Port mit dem Volumen des gesammelten Blutes, das in Schritt 8.2 entnommen wurde, wenn Sie den Port entlüften. Achten Sie darauf, keine Luft damit zu spülen.
   HINWEIS: Dies dient dazu, sicherzustellen, dass das Therapeutikum in die Aortenwurzel des Herzens verabreicht wird.
   HINWEIS: Dieser Abschnitt wurde zuvor ausführlich in Bishawi et al . beschrieben. Einführung viraler Vektoren für Luciferase-Ausdruck¹⁵.
4. Perfundieren Sie das Transplantat auf dem Gerät für 2 Stunden nach dem Einführen des Therapeutikums.

9. Vorbereitung des Empfängers und Laparotomie mit vaskulärer Exposition

1. Sobald das Herzallotransplantat am Gerät befestigt ist und das Therapeutikum in den Kreislauf eingeführt wird, beginnen Sie mit der Induktion der Anästhesie und der präoperativen Vorbereitung, wie in Abschnitt 2 für das Empfängerschwein beschrieben.
2. Initiieren Sie die Infusion der Immunsuppressionsmedikamente: Cyclosporin 50 mg / kg insgesamt als langsame Tropfinfusion während des gesamten Verfahrens und Methylprednisolon 1 g IV Bolus.
3. Verabreichen Sie Antibiotika: Enrofloxacin IM (5 mg/kg) und Cefazolin 1 g IV Bolus.
4. Führen Sie einen Foley-Katheter in die Blase ein.
   HINWEIS: Die Dekomprimierung der Blase hilft bei der optimalen Exposition der infrarenalen Aorta und IVC.
5. Markieren Sie die abdominale Mittellinie vom Mittelbauch bis zum Schambein mit einem sterilen chirurgischen Marker. Rasieren Sie alle Haare von der Website mit einer Haarschneidemaschine und sterilisieren Sie den Bereich mit 4% Chlorhexidin für insgesamt 3 Sterilisationsrunden. Tragen Sie ein steriles chirurgisches Tuch um die unmittelbare Operationsstelle an.
   HINWEIS: Chirurgen müssen Hände und Arme mit einer alkohol- oder jodbasierten Wäsche waschen und sterile Kittel und Handschuhe anziehen.
6. Verwenden Sie eine 10-Klinge, um die Haut zu schneiden (20-30 cm Einschnitt) und wechseln Sie zur Elektrokauterisation, um bis zur Faszie zu sezieren.
7. Mit zwei Kocher-Klemmen heben Sie Faszie und Peritoneum an und machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt (1 cm) in die Peritonealhöhle mit einer Metzenbaum-Schere.
8. Verlängern Sie die peritoneale Öffnung für die gesamte Länge des Einschnitts mit Elektrokauterisation und legen Sie einen Finger darunter, um die darunter liegenden Eingeweide zu schützen. Platzieren Sie einen Balfour-Retraktor, um die Belichtung zu optimieren. Ziehen Sie den Dünndarm schädelfest und mit nassen Handtüchern zurück.
9. Öffnen Sie den retroperitonealen Raum, der den Nieren unterlegen ist, mit Sorgfalt, um die Harnleiter zu identifizieren und Verletzungen zu vermeiden.
10. Tragen Sie die Dissektion bis zur Bauchaorta und IVC. Ligatieren Sie die Lymphgefäße mit mittleren und großen Clips.
11. Sezieren Sie die Gefäße umlaufend und legen Sie ein Segment frei, das groß genug ist, um eine große Satinsky-Klemme um jedes Gefäß zu passen. Achten Sie darauf, Störungen der lumbalen arteriellen Äste zu vermeiden, die sich vom hinteren Teil der Aorta lösen. Platzieren Sie zwei Gefäßschleifen um die Aorta und IVC an den proximalen und distalen Enden der Exposition.

10. Endgültiger Stillstand und Entfernen des Herzens aus der Ex-vivo-Perfusionsvorrichtung

1. Schließen Sie am Ende der 2 Stunden Ex-vivo-Perfusion die Heiz-Kühler-Maschine an das Ex-vivo-Gerät an. Stellen Sie die Temperatur des Heizungskühlers auf 34 °C ein.
2. Schließen Sie die entlüftete Kardioplegie-Verabreichungsleitung steril und luftfrei an das Ex-vivo-Gerät am Aortenzugangsport an.
3. Schalten Sie den Temperatursollwert am Ex-vivo-Gerät auf Aus.
4. Reduzieren Sie die Temperatur des Heizungskühlers auf 24 °C und verringern Sie den Pumpendurchfluss , um MAP zwischen 60 und 70 mmHg zu halten (typischerweise eine Änderung des Pumpendurchflusses von 1 l/min auf 0,9 l/min).
5. Sobald der Temperaturmesswert an der Ex-vivo-Perfusionsvorrichtung 24-26 °C erreicht hat, reduzieren Sie die Temperatur des Heizheizkühlers weiter auf 14 °C und verringern Sie den Pumpendurchfluss weiter um 100 ml/min.
6. Sobald die Temperatur 14-16 ° C erreicht hat, trennen Sie die PA-Kanüle vom PA-Port, starten Sie die Lieferung von antegrade del Nido (500 ml), schließen Sie das AO-Leitungsventil, stoppen Sie die Pumpe und klemmen Sie schnell die AO-Entlüftungsleitung.
   HINWEIS: Der Kardioplegie-Abgabedruck muss titriert werden, um einen mittleren Förderdruck von 45-65 mmHg aufrechtzuerhalten, wie er auf dem Ex-vivo-Gerätemonitor angezeigt wird.
7. Entfernen Sie das Herz von der Ex-vivo-Perfusionsvorrichtung, indem Sie die PA-Kanüle und den Aortenstecker trennen und die Schrittmacherdrähte durchtrennen.
8. Legen Sie das Herz in einen Eimer, der mit sterilem Eismatsch gefüllt ist.
9. Auf dem Rückentisch die Lungenvene / linke Atriotomie übernähen, wo die LV-Entlüftung eingeführt wurde. Trimmen (1 oder 2 mm) des distalen Aspekts der Aorta und PA, wo die Befestigung an den Kanülen das Gewebe zerquetscht haben könnte.
   HINWEIS: Das Herz ist jetzt bereit für die intraabdominale, heterotope Implantation.

11. Heterotope Implantation des Herztransplantats

1. Bevor Sie die Satinsky-Klemmen einsetzen, verabreichen Sie dem Empfängerschwein 300 U/kg IV-Heparin.
2. Platzieren Sie eine Satinsky-Klemme auf dem IVC und erstellen Sie eine Längsvenotomie von ~ 1,5 cm mit einer 11-Klinge und der Pott-Schere.
3. Anastomose der Transplantat-PA auf die infrarenale IVC des Empfängers in einer End-to-Side-Weise mit einer laufenden Polypropylennaht der Größe: 4-0. Führen Sie zuerst den inneren Teil der Anastomose durch und verstärken Sie sie bei Bedarf mit unterbrochenen Nähten, bevor Sie den äußeren Teil der Anastomose abschließen.
   HINWEIS: Die PA-zu-IVC-Anastomose wird zuerst durchgeführt, und die Aorta-zu-Aorta-Anastomose wird zuletzt durchgeführt, um die Dauer des Aortenverschlusses zu verkürzen.
4. Legen Sie eine Satinsky-Klemme auf die Aorta und erstellen Sie eine Längsaortotomie mit einer 11-Klinge und einer Pott-Schere, die ~ 1,5 cm misst.
   HINWEIS: Holen Sie sich vor dem Einsetzen der Klemme ein ABG ein. Überprüfen Sie es sofort nach dem Lösen der Klemme und erneut 15-30 Minuten später, um Veränderungen der Hyperkaliämie, Hyperlaktatämie oder Azidämie zu beurteilen, die auf eine ischämische Verletzung beim Empfänger hinweisen.
5. Anastomose der Pfropfaorta auf die infrarenale Aorta des Empfängers in einer End-to-Side-Art und Weise mit einer laufenden, Größe: 4-0, Polypropylen-Naht. Führen Sie zuerst den inneren Teil der Anastomose durch und verstärken Sie sie bei Bedarf mit unterbrochenen Nähten, bevor Sie den äußeren Teil der Anastomose abschließen.
6. Entfernen Sie die Satinsky-Klemmen, um das Herz zu reperfusionieren. Entfernen Sie zuerst die IVC-Klemme, gefolgt von der Aortenklemme.
7. Legen Sie einen 18 G Angiocath in die LV-Spitze des Transplantats, um die Luft zu entlüften. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Angiokathen und schließen Sie die Stelle mit einer verpfändeten Naht.
8. Überprüfen Sie die Anastomosen sorgfältig auf Blutungen.
9. Platzieren Sie das Herz vorsichtig in den rechten retroperitonealen Raum, so dass es keine Spannung auf die Anastomosen und kein Knicken der Gefäße gibt. Ersetzen Sie den Dünndarm.

12. Abschluss der Laparotomie

1. Schließen Sie die Faszie mit geschlungener, Größe: 0, Maxon-Naht in einer laufenden Art und Weise beginnend von beiden Enden des Einschnitts und Binden in der Mitte. Achten Sie darauf, jegliche Verletzung des Darms zu vermeiden.
2. Schließen Sie die tiefe Hautschicht mit der Größe: 2-0, Vicryl in laufender Manier und die Haut mit der Größe: 4-0, Monocryl in einer laufenden Art und Weise.
3. Reinigen Sie den Hautschnitt und tragen Sie Hautkleber auf.

13. Postoperative Behandlung und Euthanasie

1. Schalten Sie nach Abschluss der Operation den Isofluranfluss aus und überwachen Sie das Schwein auf die Rückkehr des Muskeltonus und der neuromuskulären Reflexe (Hornhautreflex, Entzug schmerzhafter Reize, Schlucken).
2. Nachdem Sie die Wiederherstellung dieser Funktionen bestätigt haben, schalten Sie die mechanische Beatmung aus und beobachten Sie die spontane Atmung. Wenn es spontane Atmung gibt, entfernen Sie den Endotrachealtubus; Wenn dies nicht der Fall ist, schließen Sie den Endotrachealtubus wieder an die mechanische Beatmung an.
3. Bringen Sie das Schwein vom Operationstisch in ein isoliertes Gehege, wo seine Vitalfunktionen (Rektaltemperatur, Blutdruck, Herzfrequenz) genau überwacht werden können. Verwenden Sie eine Heizlampe, um das Schwein nach Bedarf zu erwärmen. Stellen Sie einen intravenösen Flüssigkeitsbolus von 250 ml Lactated Ringer-Lösung bei der Einstellung von Hypotonie (systolischer Blutdruck < 100 mmHg) bereit. Überwachen Sie das Schwein weiter, bis es die sternale Liegefähigkeit aufrechterhalten kann und die Vitalfunktionen vollständig normalisiert sind.
   HINWEIS: Das Tier wird nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat. Darüber hinaus wird das Tier erst dann in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn es vollständig genesen ist.
4. Zur Schmerzbehandlung eine einmalige Dosis von Buprenorphin (verzögerte Freisetzung) subkutane Injektion 0,12 mg/kg für 72 h Analgesie verabreichen.
5. Am Ende der Versuchsperiode euthanasieren Sie das Schwein zur Explantation des einheimischen (Thorax-) Herzens und des Allotransplantat-Herzens (abdominal).
   1. Bereiten Sie das Schwein wie in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben für das Verfahren vor. Bereiten Sie zwei Beutel del Nido und zwei Kardioplegielinien vor, um jedes Herz zu stoppen.
   2. Legen Sie das Brustherz frei, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Sobald Sie fertig sind, fahren Sie mit einer Laparotomie fort, wie in Abschnitt 9 beschrieben.
   3. Sobald die Aortenaorten- und PA-IVC-Anastomosen exponiert sind, legen Sie eine Satinsky-Klemme auf die Empfängeraorta und eine weitere auf die Empfänger-IVC, um das Allotransplantat aus dem systemischen Kreislauf zu isolieren.
   4. Führen Sie eine pädiatrische 4-Fr-Aortenwurzelkanüle in die Aortenwurzel des Allotransplantats ein und verbinden Sie eine Kardioplegielinie mit dem Katheter. Verabreichen Sie 500 ml del Nido Kardioplegie in die Wurzel bei einem Druck von 100-150 mmHg mit einem Druckbeutel. Nachdem die Infusion begonnen hat, verwenden Sie eine Metzenbaum-Schere, um einen 2-cm-Schnitt auf der Ebene der PA-IVC-Anastomose vorzunehmen, um das Allotransplantat zu entlüften.
   5. Sobald das Allotransplantat festsitzt, fahren Sie fort, das Allotransplantat zu exstituieren, indem Sie Metzenbaum-Schere verwenden, um auf der Ebene der Aortosaspurose und des Rests der PA-IVC-Anastomose zu entfernen. Entfernen Sie keine der Satinsky-Klemmen.
   6. Fahren Sie mit der Entfernung des Brustherzens fort, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
      HINWEIS: Der einzige signifikante Unterschied besteht darin, dass die Lungenvenen nicht sorgfältig ligiert werden müssen und stattdessen bei der Durchführung der Cardiektomie mit einer Metzenbaum-Schere grob seziert werden können.

Ergebnisse

Diese Gruppe hat je nach Studiendesign 9 Schweine zwischen 5 und 35 Tagen nach dem hier vorgestellten Protokoll erfolgreich überlebt. Von 10 Schweinen, die dieses Protokoll durchlaufen haben, starb nur 1 vorzeitig an chirurgischen Komplikationen, was zu einer Überlebensrate von 90% führte. In Abbildung 2 ist ein Diagramm der Konfiguration eines heterotopen Herzens dargestellt, das in die intraabdominale Position eines Schweins transplantiert wurde. Wählen Sie bei der Bestimmung der Stell...

Diskussion

Die Abgabe von Therapeutika während der Ex-vivo-Perfusion bei der Herztransplantation bietet eine Strategie zur Modifikation des Allotransplantats und zur potenziellen Verbesserung der Transplantationsergebnisse. Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet die hochmoderne normotherme ex vivo sanguinöse Perfusionslagerung und bietet vielversprechendes Potenzial, die isolierte Abgabe von Zell-, Gen- oder Immuntherapien an das Allotransplantat^11,12,13

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Looped Maxon suture	Covidien	GMM-341L	Used to close fascia of the laparotomy incision
0 Silk ties	Medtronic, Inc	S346
18 G Angiocath	BD	381144	Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation
20 Fr LV vent	Medtronic, Inc	12002
2-0 Silk sutures	Ethicon, Inc.	SA11G
2-0 Silk ties	Ethicon, Inc.	SA65H
2-0 Vicryl suture	Ethicon, Inc.	J259H
24 Fr venous cannula	Medtronic, Inc	68124
3-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8522
4-0 Monocryl suture	Ethicon, Inc.	Y469G
4-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8521
Animal hair cutting clipper	Wahl	8786-452
Aortic clamp	V. Mueller	CH6201
Army Navy retractor	V. Mueller	SU3660
ATF 40, Cell saver disposable set	Fresenius Kabi	9108494	Cell saver device insert
Balfour retractor	V. Mueller	SU3042	Used as an abdominal wall retractor
C.A.T.S cell saver	Fresenius Kabi	ES0019	Cell saver device used to wash donor blood
Cardiac defibrillator	Zoll	M Series	Cardiac defibrillator
Castro needle holder	V. Mueller	CH8589
CG4 iStat cartridges	Abbott	03P85-25	POC testing
CG8 iStat cartridges	Abbott	03P88-25	POC testing
DeBakey forceps	V. Mueller	CH5902
Electrocautery disposable pencil	Covidien	E2450H
Gerald forceps	V. Mueller	NL1451
Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater	Cincinnati Sub-Zero	86022	Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device
iSTAT 1	Abbott	04P75-03	POC testing device
Kocher clamp	V. Mueller	SU2790
Large clip applier	Sklar	50-4300
Large clips	Teleflex	4200
Large soft pledgets	Covidien	8886867901
Medium clip applier	Sklar	50-4335
Medium clips	Teleflex	2200
Metzenbaum scissor	V. Mueller	CH2006-001
No. 10 scalpel blade	Swann-Mortan	301	Used for skin incision
No. 11 scalpel blade	Kiato Plus	18111	Used for vascular incision
OCS device with base	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device
OCS disposable	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits
Pacing cable	Remington Medical	FL-601-97
Pediatric cardioplegia catheter (4Fr)	Medtronic, Inc	10218	Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root
Pediatric Foley catheter	Teleflex	RSH170003080	Placed pre-op to decompress the recipient's bladder
Potts scissors	V. Mueller	CH13038
Pressure bag x2 (1,000 mL)	Novaplus	V4010H	Used to deliver cardioplegia at a set pressure
Satinsky clamp	V. Mueller	CH7305	Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels
Scissors	Felco	FELCO 200A-50	Used to perform sternotomy
Small hard pledgets	Covidien	8886867701
Sternal retractor	V. Mueller	CH6950-007
Temporary cardiac pacing wires	Ethicon, Inc.	TPW32
Temporary dual chamber pacemaker	Medtronic, Inc	5388	Cardiac pacing device
Tourniquet kit	Medtronic, Inc	79005	Rummel tourniquets
Umbilical tape	Covidien	8886861903
Vessel loops	Covidien	31145686