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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) pertenecen a la familia de las proteasas de metzincina con funciones centrales en la degradación y remodelación de la matriz extracelular (ECM), así como interacciones con varios factores de crecimiento y citoquinas. La sobreexpresión de MMP específicos es responsable en varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares. Los MMP han sido el centro de atención recientemente como objetivos para desarrollar terapias que puedan tratar enfermedades correlacionadas con la sobreexpresión de MMP.
Para estudiar el mecanismo MMP en solución, se necesitan métodos de expresión y purificación de proteínas recombinantes más fáciles y robustos para la producción de MMP activos y solubles. Sin embargo, el dominio catalítico de la mayoría de las MMP no se puede expresar en Escherichia coli (E. coli) en forma soluble debido a la falta de maquinaria posttraduccional, mientras que los sistemas de expresión de mamíferos suelen ser costosos y tienen rendimientos más bajos. Los cuerpos de inclusión MMP deben someterse al tedioso y laborioso proceso de purificación y repliega extensos, reduciendo significativamente el rendimiento de las MMP en la conformación nativa. Este artículo presenta un protocolo que utiliza células Rosetta2(DE3)pLysS (en adelante, R2DP) para producir el dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz (MMP-3cd), que contiene una etiqueta His-terminal N seguida de pro-dominio (Hisx6-pro-MMP-3cd) para su uso en la purificación de afinidad. Las células R2DP mejoran la expresión de proteínas eucariotas a través de un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones normalmente raros en los sistemas de expresión bacteriana. En comparación con la línea celular tradicional de elección para la expresión de proteínas recombinantes, BL21 (DE3), la purificación con esta nueva cepa mejoró el rendimiento de Hisx6-pro-MMP-3cd purificado. Tras la activación y desalinización, el dominio pro se divide junto con la etiqueta His-tag N-terminal, proporcionando MMP-3cd activo para uso inmediato en innumerables aplicaciones in vitro . Este método no requiere equipos costosos o proteínas de fusión complejas y describe la producción rápida de MMP humanos recombinantes en bacterias.
La mayoría de las proteínas eucariotas complejas sufren elaboradas modificaciones posttraduccionales después de la expresión, requiriendo un plegamiento de proteínas altamente asistido y cofactores para ser funcionales1. La producción de grandes cantidades de proteína humana soluble en un huésped bacteriano sigue siendo un desafío importante debido a los altos costos y la falta de métodos robustos de expresión y purificación, incluso para experimentos de laboratorio a menor escala2,3. Las MMP, endopeptidasas humanas con gran peso molecular, generalmente se expresan como cuerpos de inclusión insolubles cuando se expresan en E. coli. La extracción de MMP humanas solubles a menudo conduce a un laborioso y lento proceso de solubilización y repliega4.
Las MMP tienen funciones críticas tanto en procesos fisiológicos como patógenos. Las MMP humanas son una familia de 23 endopeptidasas de zinc, categorizadas por estructura y especificidad de sustrato, y expresadas diferencialmente a pesar de un dominio catalítico altamente conservado5,6. Las MMP se secretan como zimogenas inactivas, reguladas a través de la activación posttraduccional y sus inhibidores endógenos, inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP)7,8,9,10. Aunque inicialmente se reconocieron por su papel en el recambio de ECM, las MMP también se han implicado en el desarrollo, la morfogénesis, la reparación de tejidos y la remodelación8. La desregulación de las MMP se ha relacionado notablemente con el cáncer junto con las enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y fibróticas, entre otras enfermedades5,7.
El desarrollo de métodos robustos de producción de MMP a gran escala es fundamental para garantizar el éxito de futuros estudios de mecanismos de MMP a través de ensayos bioquímicos y basados en células. Varias MMP se han expresado previamente en bacterias11, incluidas las MMP marcadas con Hisx6, sin alterar la actividad de MMP12,13,14,15. Sin embargo, estos métodos incluyen pasos tediosos y largos que pueden ser difíciles de replicar.
Las células de mamíferos también se pueden utilizar para expresar muchas proteínas humanas diferentes al tiempo que garantizan las modificaciones posttraduccionales adecuadas16. Aunque el sistema de expresión de mamíferos es una opción ideal para producir proteínas humanas recombinantes con modificaciones post-traduccionales adecuadas, las principales desventajas de este método son los bajos rendimientos iniciales, los costosos medios de crecimiento y reactivos, los largos plazos para alcanzar líneas de expresión estables y el riesgo de contaminación con otras especies como hongos o bacterias2,11 . Además, la producción de MMP en líneas celulares de mamíferos produce impurezas a partir de proteínas celulares asociadas como TIMPs o fibronectinas11. A diferencia del lento crecimiento celular observado en las células de mamíferos, el sistema de expresión bacteriana ofrece una producción de proteínas a gran escala en un corto período de tiempo junto con medios y requisitos de crecimiento más simples. Sin embargo, debido a la falta de otras proteínas celulares asociadas (es decir, TIMP) en los sistemas de expresión bacteriana, las MMP activas a concentraciones más altas están sujetas a degradación a través de la autoproteólisis, lo que resulta en un rendimiento deficiente de MMP17.
Este artículo describe un método detallado para la expresión bacteriana, purificación y activación de Hisx6-pro-MMP-3cd recombinante utilizando E. coli como huésped de expresión debido a su asequibilidad, simplicidad y éxito en la producción de mayores rendimientos de MMPs2,3,18. Dado que E. coli carece de la maquinaria de plegamiento de proteínas y el procesamiento posttraduccional requerido para las MMP recombinantes y otras proteínas complejas, muchas cepas de E. coli han sido diseñadas para superar estas limitaciones, haciendo de E. coli un huésped más adecuado para la expresión de MMP-3cd humano recombinante,19,20 . Por ejemplo, la cepa R2DP utilizada en este estudio mejora la expresión eucariota al suministrar un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones raramente utilizados en E. coli.
Como se describe en este protocolo, después de la sobreexpresión de cuerpos de inclusión relativamente puros del vector pET-3a (Figura 1) en células R2DP, se extraen y desnaturalizan las proteínas del dominio catalítico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd)4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 se purificó mediante cromatografía de etiqueta de afinidad. Tras el repliegue y la diálisis, el pro-MMP-3cd (zymogen) fue activado por acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA), y el análisis SDS-PAGE se utiliza para evaluar los rendimientos y la necesidad de una mayor purificación5,21. Este protocolo describe la expresión, purificación y activación de MMP-3cd soluble como ejemplo. Sin embargo, también se puede utilizar como guía para la expresión de otras MMP y proteasas humanas con expresión similar, y mecanismos de activación (Figura 2). Para otras proteínas distintas de MMP-3cd, se recomienda al lector que determine las composiciones tampón óptimas y los métodos para su proteína objetivo antes de intentar este protocolo.
Figura 1: Mapa plásmido del plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. El vector pET-3a incluye un gen de resistencia a la ampicilina. Una secuencia de etiquetas Hisx6 N-terminal se clona en el vector basado en pET-3a, incluyendo pro-MMP-3cd, para producir la construcción pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd bajo control del promotor T7 entre los sitios de restricción BamHI y NdeI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Expresión bacteriana del plásmido pro-MMP-3cd, purificación, repliegue y activación. 1.1: El plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd se transformó en células BL21(DE3) o R2DP. 1.2: La expresión de la proteína Pro-MMP-3cd se indujo mediante IPTG. 1.3: La lisis química y la sonicación se utilizan para extraer proteínas Hisx6-pro-MMP-3cd que son principalmente insolubles y se encuentran en los cuerpos de inclusión. La urea se utilizó para desnaturalizar y solubilizar proteínas de los cuerpos de inclusión. 2.1. La proteína Hisx6-pro-MMP-3cd desnaturalizada se purificó mediante cromatografía por afinidad. 3. El Hisx6-pro-MMP-3cd eluido se replegó lentamente durante la diálisis a través de la eliminación gradual de la urea del tampón. 4. Finalmente, la proteína MMP-3cd replegada se activó utilizando APMA mediante la eliminación del dominio propéptido N-terminal. APMA se elimina más tarde de la solución a través de la desalinización. Los números corresponden a las secciones del protocolo que describen estos pasos. Abreviaturas: MMP-3cd = Dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz; APMA = acetato de 4-aminofenilmercúrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Expresión MMP
2. Purificación y repliegue MMP
3. Repliegue de proteínas
NOTA: Para volúmenes más pequeños, los casetes de diálisis se pueden usar con un menor riesgo de pérdida de muestra. Se requieren tubos de diálisis si se utilizan volúmenes más grandes (consulte la Tabla de materiales).
4. Activación
Al ejecutar muestras en SDS-PAGE, debido a que la proteína se expresa en forma de cuerpos de inclusión insolubles, las fracciones lisadas y sonicadas deben contener poco o ningún extracto de Hisx6-pro-MMP-3cd, ya que la proteína aún no se ha resuelto en urea. La Figura 3 compara las fracciones de elución de purificación his-tag de Hisx6-pro-MMP-3cd de células BL21(DE3) y células R2DP. Las fracciones de elución se agruparon por separado para las células BL21(DE3) y R2DP antes de la...
La producción a gran escala de MMP solubles, humanos y recombinantes sigue siendo una tarea desafiante. Las células de mamíferos pueden expresar MMP funcionales a altos costos y largos tiempos de espera, mientras que E. coli produce rápidamente altas cantidades de cuerpos de inclusión MMP que deben ser purificados y replegados11,16. Las células R2DP aumentan significativamente el rendimiento de los cuerpos de inclusión MMP, lo que permite un proce...
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Evette Radisky y Alexandra Hockla en la Clínica Mayo en Jacksonville, Florida, por proporcionar el plásmido pET-3a-pro-MMP-3cd como la plantilla para clonar el gen Hisx6pro-MMP-3cd, y sus comentarios, junto con el Dr. Paul Hartley del Centro de Genómica de Nevada en la Universidad de Nevada, Reno, para la secuenciación del ADN. Los autores también desean agradecer a Cassandra Hergenrader por ayudar con parte de la expresión de proteínas. M.R.-S. desea agradecer la subvención NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience y el PREMIO UNR R&D mICRO SEED Grant Award.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm sterile filter | Sigma Aldrich | SLGP033RS | Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging |
1 L Erlenmeyer flasks | Thermo Fisher Scientific | S76106F | n/a |
1 L glass bottles | Thermo Fisher Scientific | 06-414-1D | n/a |
1.5 mL microfuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | n/a |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | n/a |
18 G, 1-in. beveled needle | Amazon | B07S7VBHM2 | Used in combination with the dialysis casette |
2 mL desalting column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | Removes APMA following activation |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Thermo Fisher Scientific | AAA1610422 | n/a |
250 mL conical bottle cushions | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53A | Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation |
250 mL conical bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-538-53 | n/a |
400 mL stirred cell | Sigma Aldrich | UFSC40001 | Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit |
4-aminophenylmercuric acetate (APMA) | Sigma Aldrich | A9563-5G | Activates MMP-3 by cleaving the propeptide |
5 mL syringe | Thermo Fisher Scientific | NC0829167 | Used in combination with the dialysis casette |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Used for storage in many purification steps |
50 mL re-concentration tube | Sigma Aldrich | UFC901024D | Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-500 | Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media |
BamHI | NEB | R3136S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
Calcium chloride (CaCl2) | Thermo Fisher Scientific | 600-30-23 | The calcium ion stabilizes MMP structure |
Cell spreaders | Thermo Fisher Scientific | 50-189-7544 | Can be used to spread cells across a petri dish after transformation |
Chloramphenicol | Thermo Fisher Scientific | 22-055-125GM | Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media |
Dialysis Buffer 1 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea. |
Dialysis Buffer 2 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea. |
Dialysis Buffer 3 | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2. |
Dialysis clips | Thermo Fisher Scientific | 68011 | Used in combination with snakeskin dialysis tubing |
Dialysis tubing | Thermo Fisher Scientific | 88243 | Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss |
Digest buffer | NEB | B7204S | Buffer used in digesting the pET3a vector |
Disposable cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 21-200-257 | Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | D107125G | Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds |
DNA assembly mix | NEB | E2621S | Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector |
DNase I | NEB | M0303S | Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A995-4 | n/a |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | J15694-AE | Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds |
Gel recovery kit | Promega | A9281 | Isolates and purifies DNA from agarose gels |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-500 | Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C |
Gravity flow column | BioRad | 7321010 | Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins |
High-transformation efficiency cells | NEB | C2987 | High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct |
HT Elution Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
HT Equilibration Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4 |
HT Regeneration Buffer | n/a | n/a | 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0 |
HT Wash Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4 |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | A144C-212 | Used to pH buffers |
Imidazole | Thermo Fisher Scientific | AAA1022122 | Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein |
Inclusion Body Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | FERR0392 | A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C |
LB Amp CamR media | n/a | n/a | To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
LB Amp CamR plates | n/a | n/a | To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL |
LB Broth | Thermo Fisher Scientific | BP1426-2 | Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride |
Lysis Buffer | n/a | n/a | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0 |
Lysozyme | MP Biomedicals | 195303 | Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls |
Miniprep kit | Promega | A1330 | If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants |
NdeI | NEB | R0111S | Restriction enzyme to be used with the pET3a vector |
Ni-NTA resin | Thermo Fisher Scientific | PI88221 | Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole |
Nonionic surfactant | Thermo Fisher Scientific | PI28316 | Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity. |
PCR mix | NEB | M0492S | A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector |
pET plasmid | Addgene | n/a | The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers |
Petri dishes | VWR | 25384-342 | Used for plating transformants on LB agar media |
R2DP cells | Novagen | 714033 | BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli |
SOC growth media | NEB | B9020S | Non-selective growth media for rapid growth during transformation |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | Used in buffers and helps with protein stability |
Sodium deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | PI89905 | Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls |
Solubilization Buffer | n/a | n/a | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0 |
Tris base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | M1122980101 | Detergent used for cell lysis |
Urea | Thermo Fisher Scientific | AAJ75826A7 | First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure |
Zinc chloride (ZnCl2) | Thermo Fisher Scientific | AAA162810E | Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3 |
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