Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

Resumen

La caracterización espectrométrica de masas de neuropéptidos proporciona información de secuencia, cuantificación y localización. Este flujo de trabajo optimizado no solo es útil para estudios de neuropéptidos, sino también para otros péptidos endógenos. Los protocolos proporcionados aquí describen la preparación de muestras, la adquisición de EM, el análisis de EM y la generación de neuropéptidos en bases de datos utilizando LC-ESI-MS, maldi-MS spotting e imágenes MALDI-MS.

Resumen

Los neuropéptidos son moléculas de señalización que regulan casi todos los procesos fisiológicos y conductuales, como el desarrollo, la reproducción, la ingesta de alimentos y la respuesta a los factores estresantes externos. Sin embargo, los mecanismos bioquímicos y el complemento completo de los neuropéptidos y sus funciones funcionales siguen siendo poco conocidos. La caracterización de estos péptidos endógenos se ve obstaculizada por la inmensa diversidad dentro de esta clase de moléculas de señalización. Además, los neuropéptidos son bioactivos en concentraciones 100x - 1000x más bajas que las de los neurotransmisores y son propensos a la degradación enzimática después de la liberación sináptica. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta analítica altamente sensible que puede identificar, cuantificar y localizar analitos sin un conocimiento exhaustivo a priori . Es muy adecuado para perfilar neuropéptidos a nivel mundial y ayudar en el descubrimiento de nuevos péptidos. Debido a la baja abundancia y la alta diversidad química de esta clase de péptidos, se han adaptado varios métodos de preparación de muestras, parámetros de adquisición de EM y estrategias de análisis de datos a partir de técnicas proteómicas para permitir una caracterización óptima de neuropéptidos. Aquí, se describen métodos para aislar neuropéptidos de tejidos biológicos complejos para la caracterización de secuencias, cuantificación y localización mediante cromatografía líquida (LC)-MS y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)-MS. Se incluye un protocolo para preparar una base de datos de neuropéptidos a partir del cangrejo azul, Callinectes sapidus, un organismo sin información genómica completa. Estos flujos de trabajo se pueden adaptar para estudiar otras clases de péptidos endógenos en diferentes especies utilizando una variedad de instrumentos.

Introducción

El sistema nervioso es complejo y requiere una red de neuronas para transmitir señales a través de un organismo. El sistema nervioso coordina la información sensorial y la respuesta biológica. Las interacciones intrincadas y enrevesadas involucradas en la transmisión de señales requieren muchas moléculas de señalización diferentes, como neurotransmisores, esteroides y neuropéptidos. Como los neuropéptidos son las moléculas de señalización más diversas y potentes que desempeñan un papel clave en la activación de las respuestas fisiológicas al estrés y otros estímulos, es de interés determinar su papel específico en estos procesos fisiológicos. La función neuropeptídica está relacionada con su estructura de aminoácidos, que determina la movilidad, la interacción del receptor y la afinidad¹. Técnicas como la histoquímica, que es importante porque los neuropéptidos se pueden sintetizar, almacenar y liberar en diferentes regiones del tejido, y la electrofisiología se han empleado para investigar la estructura y función de los neuropéptidos ^2,3,4, pero estos métodos están limitados por el rendimiento y la especificidad para resolver la vasta diversidad de secuencias de los neuropéptidos.

La espectrometría de masas (EM) permite el análisis de alto rendimiento de la estructura y abundancia de neuropéptidos. Esto se puede realizar a través de diferentes técnicas de EM, más comúnmente cromatografía líquida-ionización electrospray MS (LC-ESI-MS)⁵ y MS de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS)⁶. Utilizando mediciones de masa de alta precisión y fragmentación de EM, la EM proporciona la capacidad de asignar la secuencia de aminoácidos y el estado de modificación post-traduccional (PTM) a neuropéptidos de mezclas complejas sin conocimiento a priori para ayudar a determinar su función ^7,8. Además de la información cualitativa, la EM permite la información cuantitativa de neuropéptidos a través de la cuantificación sin etiquetas (LFQ) o métodos basados en etiquetas, como el etiquetado isotópico o isobárico⁹. Las principales ventajas de LFQ incluyen su simplicidad, bajo costo de análisis y disminución de los pasos de preparación de la muestra que pueden minimizar la pérdida de muestras. Sin embargo, las desventajas de LFQ incluyen un aumento de los costos de tiempo del instrumento, ya que requiere múltiples réplicas técnicas para abordar el error cuantitativo de la variabilidad de ejecución a ejecución. Esto también conduce a una disminución de la capacidad de cuantificar con precisión pequeñas variaciones. Los métodos basados en etiquetas se someten a una variación menos sistemática, ya que múltiples muestras pueden etiquetarse diferencialmente utilizando una variedad de isótopos estables, combinados en una muestra y analizados a través de espectrometría de masas simultáneamente. Esto también aumenta el rendimiento, aunque las etiquetas isotópicas pueden llevar mucho tiempo y ser costosas de sintetizar o comprar. La complejidad espectral de los espectros de masas de exploración completa (MS1) también aumenta a medida que aumenta la multiplexación, lo que disminuye el número de neuropéptidos únicos capaces de fragmentarse y, por lo tanto, identificarse. Por el contrario, el etiquetado isobárico no aumenta la complejidad espectral a nivel de MS1, aunque introduce desafíos para los analitos de baja abundancia, como los neuropéptidos. Como la cuantificación isobárica se realiza a nivel de espectros de masas de iones de fragmento (MS2), los neuropéptidos de baja abundancia pueden no poder cuantificarse, ya que se pueden seleccionar componentes de matriz más abundantes para la fragmentación y los seleccionados pueden no tener una abundancia lo suficientemente alta como para ser cuantificados. Con el etiquetado isotópico, la cuantificación se puede realizar en cada péptido identificado.

Además de la identificación y cuantificación, la información de localización puede ser obtenida por MS a través de imágenes MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Al rasterizar un láser a través de una superficie de muestra, los espectros MS se pueden compilar en una imagen de mapa de calor para cada valor m / z . El mapeo de la intensidad de la señal neuropeptídica transitoria en diferentes regiones a través de las condiciones puede proporcionar información valiosa para la determinación de la función¹¹. La localización de neuropéptidos es especialmente importante porque la función del neuropéptido puede diferir dependiendo de la ubicación¹².

Los neuropéptidos se encuentran en menor abundancia in vivo que otras moléculas de señalización, como los neurotransmisores, y por lo tanto requieren métodos sensibles para la detección¹³. Esto se puede lograr mediante la eliminación de componentes de la matriz de mayor abundancia, como los lípidos^11,14. Es necesario realizar consideraciones adicionales para el análisis de neuropéptidos en comparación con los flujos de trabajo proteómicos comunes, principalmente porque la mayoría de los análisis neuropeptidómicos omiten la digestión enzimática. Esto limita las opciones de software para el análisis de datos de neuropéptidos, ya que la mayoría se construyeron con algoritmos basados en datos de proteómica y coincidencias de proteínas informadas por la detección de péptidos. Sin embargo, muchos programas como PEAKS¹⁵ son más adecuados para el análisis de neuropéptidos debido a sus capacidades de secuenciación de novo. Se deben considerar varios factores para el análisis de neuropéptidos desde el método de extracción hasta el análisis de datos de EM.

Los protocolos descritos aquí incluyen métodos para la preparación de muestras y el etiquetado isotópico de dimetilo, adquisición de datos y análisis de datos de neuropéptidos por LC-ESI-MS, MALDI-MS y MALDI-MSI. A través de resultados representativos de varios experimentos, se demuestra la utilidad y la capacidad de estos métodos para identificar, cuantificar y localizar neuropéptidos de cangrejos azules, Callinectes sapidus. Para comprender mejor el sistema nervioso, los sistemas modelo se utilizan comúnmente. Muchos organismos no tienen un genoma completamente secuenciado disponible, lo que impide el descubrimiento integral de neuropéptidos a nivel de péptidos. Con el fin de mitigar este desafío, se incluye un protocolo para la identificación de nuevos neuropéptidos y la minería de transcriptomas para generar bases de datos para organismos sin información completa del genoma. Todos los protocolos presentados aquí pueden optimizarse para muestras de neuropéptidos de cualquier especie, así como aplicarse para el análisis de cualquier péptido endógeno.

Protocolo

Todos los muestreos de tejido descritos se realizaron de conformidad con las directrices de la Universidad de Wisconsin-Madison.

1. Análisis LC-ESI-MS de neuropéptidos

1. Extracción y desalinización de neuropéptidos
   1. Antes de la adquisición de tejidos, prepare metanol acidificado (acMeOH) (90:9:1 MeOH:agua:ácido acético) como se describe en¹⁶.
   2. Recolecte tejido cerebral del crustáceo¹⁷ y use fórceps para colocar inmediatamente un tejido cada uno en un tubo de 0,6 ml que contenga 20 μL de acMeOH.
      NOTA: Los protocolos de disección de tejidos varían mucho para diferentes animales y diferentes tipos de tejidos. Se remite al lector al protocolo¹⁷ para obtener una descripción detallada sobre cómo diseccionar el tejido cerebral y muchos otros tipos de tejido del crustáceo. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses). Los volúmenes descritos se utilizan para un solo cerebro de Callinectes sapidus. Los volúmenes deben escalarse para el tamaño del tejido. El tejido puede congelarse inmediatamente sin disolvente, aunque esto no se recomienda ya que las enzimas proteolíticas endógenas no se inhibirán y permanecerán activas, aunque a un ritmo más lento cuando están frías.
   3. Añadir 150 μL de acMeOH a la muestra. Establezca el tiempo total de sonicación en 24 s, el tiempo de pulso en 8 s, el tiempo de pausa en 15 s y la amplitud en un homogeneizador ultrasónico y homogeneice las muestras en hielo.
      NOTA: Existen diferentes sistemas de homogeneización disponibles. Ajuste los ajustes y las condiciones de acuerdo con el tipo de muestra y el equipo.
   4. Centrifugar la muestra a 4 °C a 20.000 x g durante 20 min. Con una pipeta, transfiera el sobrenadante en un tubo y séquelo en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
      NOTA: Las muestras secas se pueden almacenar a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses). El calentamiento del concentrador de vacío debe realizarse con precaución. Si bien el calor acorta el tiempo de secado, la muestra debe retirarse del concentrador inmediatamente después de que todo el líquido se haya evaporado para minimizar la degradación peptídica. Para evitar esto, el calentamiento puede omitirse de este y todos los pasos posteriores.
   5. Para la desalinización, reconstituir la muestra de tejido extraída en 20 μL de ácido fórmico (FA) al 0,1%, pozo de vórtice y sonicar en un baño de agua a temperatura ambiente durante 1 min.
      NOTA: Hay diferentes materiales de desalinización disponibles. Ajuste las soluciones y los volúmenes de acuerdo con la identidad de la resina y la cantidad de neuropéptidos. La cantidad total de péptidos puede estimarse utilizando un ensayo comercial de cuantificación de péptidos (ver Tabla de Materiales).
   6. Aplique 0,5 μL de muestra a una tira de pH para confirmar que el pH < 4. Si el pH es más alto, agregue 1 μL de alícuotas de 10% de FA hasta que el pH < 4.
   7. Siga el protocolo del fabricante para desalinizar¹⁸. Prepare una solución humectante que contenga 100 μL de acetonitrilo al 50% (ACN), una solución de equilibrio que contenga 100 μL de FA al 0,1%, una solución de lavado que contenga 100 μL de FA al 0,1% y soluciones de elución que contengan 20 μL de ACN/0,1% FA al 25%, 20 μL de ACN al 50% /0,1% FA y 20 μL de ACN/0,1% FA.
   8. Obtener una punta desalinizante de 10 μL con resina C18 (ver Tabla de Materiales).
   9. Coloque la punta de desalinización en una pipeta de 20 μL que esté ajustada a 15 μL. Una vez que la punta de desalinización esté húmeda, evite que pase el aire manteniendo la pipeta presionada cuando esté fuera de la solución hasta que se deseche.
   10. Aspire la punta 3x con solución humectante y 3x con solución de equilibrio. Aspirar en la muestra 10x seguido de lavar 3x en solución de lavado, desechando cada lavado. Elute aspirando 10x en cada una de las soluciones de elución en orden de aumento de ACN.
       NOTA: Las fracciones de elución se pueden mantener separadas o combinadas para análisis adicionales.
   11. Deseche la punta desalinizante utilizada y seque los neuropéptidos eluidos en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
       NOTA: Esto se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses).
2. Etiquetado isotópico de neuropéptidos en extracto tisular
   NOTA: Este paso es opcional y solo se utiliza cuando se desea la cuantificación.
   1. Preparar la solución de etiquetado de dimetilo isotópico de 2 plex en una campana extractora de humos: 1% CH₂OH₂ (13,5 μL de stock 37 porcentaje peso/peso (wt. %) en solución de agua en 486,5 μL de agua), 1% CH₂OD₂ (25 μL de stock 20 % en peso de solución en 475 μL de agua) y 0,03 M de piridina de borano (3,75 μL de solución de stock de 8 M en 996,25 μL de agua).
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico, por lo que todas las soluciones deben mantenerse en una campana ventilada. Use guantes, una bata de laboratorio, protección ocular y calzado impermeable. No se deben usar lentes de contacto cuando se trabaja con este material.
      NOTA: Existen diferentes reactivos isotópicos; seleccione los apropiados en función del tipo de muestra y el número de canales de etiquetado deseados.
   2. Disolver el extracto crudo de neuropéptidos en 10 μL de agua y sonicato durante 10 min.
   3. Añadir 10 μL de una solución de formaldehído isotópico diferente (es decir, CH₂OH₂, CH₂OD₂, etc.) a cada condición experimental diferente que se medirá cuantitativamente. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
   4. Añadir 10 μL de 0,03 M de borano piridina a cada tubo de muestra. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
   5. Incubar las muestras durante 15 min a 37 °C en un baño de agua.
   6. Retire las muestras del baño de agua y agregue 10 μL de bicarbonato de amonio de 100 mM. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
   7. Combine las muestras etiquetadas para una muestra de 2 plexos y seque los neuropéptidos en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
   8. Desalar los neuropéptidos etiquetados volviendo a realizar los pasos 1.1.5 - 1.1.10 y almacenarlos hasta que estén listos para la adquisición de datos.
3. Adquisición de datos
   1. Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en 12 μL de ACN al 3%/0,1% FA, bien de vórtice, sonicar en baño de agua a 37 °C durante 1 min, y centrifugar brevemente a 2.000 x g. Transfiera cada muestra a viales de automuestreador.
      NOTA: Ajuste el volumen de la muestra de acuerdo con la cantidad de neuropéptidos a una concentración de ~ 1 μg de péptido por μL. La cantidad total de péptidos puede estimarse utilizando un ensayo comercial de cuantificación de péptidos (consulte la Tabla de materiales).
   2. Utilice un muestreador automático para inyectar 1 μL de muestra en un instrumento nano-LC-MS/MS de alta resolución (consulte la Tabla de materiales).
   3. Utilice una columna C18 de fase invertida (RP) de aproximadamente 15 cm de largo (consulte la Tabla de materiales) para ejecutar la muestra con 0,1% de FA en agua como fase móvil A y 0,1% de FA en ACN como fase móvil B. Ejecute las muestras con un gradiente de 3% - 95% de B a una velocidad de 300 nL / min durante más de 11 min.
   4. Para el instrumento MS utilizado aquí, use condiciones comunes de MS de 2.00 kV para el voltaje de pulverización y 275 ° C para la temperatura capilar.
   5. Adquirir espectros MS en el rango de 200 - 2.000 m/z con una resolución de 60.000, objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 1 x 10⁶ y tiempo máximo de inyección de iones (IT) de 150 ms.
   6. Seleccione los 15 iones más intensos (intensidad mínima de 3,2 x 10⁴) para la fragmentación de disociación por colisión (HCD) de mayor energía utilizando una energía de colisión normalizada de 30, una ventana de aislamiento de 2,0 m/z, una resolución de 15.000, un objetivo AGC de 2 x 10⁵ y una TI máxima de 250 ms.
   7. Establezca una ventana de exclusión dinámica de 30 s. Excluya los iones con una carga de 1 o ≥ 8 y los iones con estados de carga no reconocidos.
4. Identificación y cuantificación de neuropéptidos
   NOTA: Muchos programas para la búsqueda de bases de datos y la cuantificación de péptidos (tanto de código abierto como comerciales) están disponibles. Aquí se utilizará PEAKS Studio (software de proteómica)¹⁵ .
   1. Realice búsquedas en la base de datos siguiendo los pasos descritos en 1.4.2 - 1.4.6.
   2. Cree un nuevo proyecto y agregue los datos lc-MS seleccionando Ninguno para la enzima, Orbitrap para el instrumento, HCD para el fragmento y Adquisición dependiente de datos (DDA) para la adquisición.
      NOTA: Seleccione los parámetros apropiados en función de los parámetros de adquisición de datos.
   3. Seleccione Identificaciones y seleccione Correcto precursor [DDA] y Masa solamente.
   4. Seleccione Búsqueda en la base de datos y establezca una tolerancia de error de 20.0 ppm usando masa monoisotópica para la masa precursora y 0.02 Da para la masa de iones fragmento, Ninguno para el tipo de enzima, Inespecífico para el modo de digestión, 100 para las escisiones máximas perdidas y los siguientes PTM variables con la variable ptM máxima permitida por péptido de 3: Amidación, Oxidación (M), Pyro-glu de E, y Pyro-glu de Q.
   5. Seleccione la base de datos de neuropéptidos, estime la tasa de descubrimiento falso (FDR) con señuelo-fusión.
      NOTA: El error de tolerancia de masa debe ajustarse para que coincida con los datos recopilados. Utilice la base de datos adecuada para el tipo de ejemplo. Cuando no se selecciona ninguna enzima, el parámetro de escisión máxima omitida no afecta a la búsqueda. Sin embargo, se requiere una gran cantidad de divisiones perdidas si el software no tiene el modo de resumen no especificado como opción.
   6. Si desea una cuantificación sin etiquetas, seleccione Cuantificación, seleccione Sin etiquetas y establezca una tolerancia de error de 20,0 ppm y una tolerancia de tiempo de retención de 1,0 min.
   7. Realizar la cuantificación de iones precursores si se realizó el paso 1.2 para el etiquetado isotópico.
      1. Seleccione Cuantificación, seleccione Cuantificación de iones precursores, utilice un intervalo de tiempo de retención de 1,0 min y utilice un umbral FDR del 1%.
      2. Seleccione un método de cuantificación preestablecido o personalizado en el menú desplegable Seleccionar método .
      3. Para crear un nuevo método personalizado, haga clic en Configuración de > de ventana > Etiqueta Q Método > Nuevo. Asigne un nombre al nuevo método y seleccione Cuantificación de iones precursores para Tipo de método. Seleccione Agregar fila y seleccione modificación en la lista Opciones de PTM.
      4. Agregue los datos de LC-MS y seleccione Condición de referencia para que sea la modificación en neuropéptidos de la condición de control del experimento.
   8. Evalúe los resultados de la búsqueda como se describe en los pasos 1.4.9 a 1.4.11.
   9. Filtre los resultados a través de la pestaña de resumen de péptidos y proteínas con -10lgP ≥ 20, seleccione ≥ 1 péptido único y seleccione la casilla etiquetada con péptidos significativos.
   10. Evalúe los resultados de búsqueda de la base de datos donde Proteína.csv representa identificaciones de neuropéptidos y Péptido.csv representa identificaciones de fragmentos de neuropéptidos.
   11. Inspeccione la búsqueda de la base de datos para obtener puntuaciones de proteínas y péptidos, precisión de masa y cobertura de secuencia.
       NOTA: Cada software de búsqueda de bases de datos utiliza algoritmos de puntuación únicos y es posible que deba evaluarse en consecuencia. Las identificaciones se pueden evaluar inspeccionando manualmente los espectros observados en busca de péptidos identificados que contengan la serie completa de iones de fragmentos.

2. Análisis de manchas MALDI-MS de neuropéptidos

1. Preparación de muestras
   1. Siga el paso 1.1 o los pasos 1.1 a 1.2 si se desea la cuantificación, excluyendo el paso 1.2.8 (no se requiere desalinización después del etiquetado isotópico antes del análisis MALDI-MS).
   2. Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en 5 μL de FA al 0,1%, bien de vórtice, sonicar en un baño de agua a 37 °C durante 1 min, y centrifugar brevemente a 2.000 x g.
   3. Para el manchado de neuropéptidos en tejidos de crustáceos, prepare 150 mg / ml de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) en metanol al 50% (MeOH) / 0.1% FA (v / v) como matriz.
   4. Pipetear una gota de muestra de 3 μL sobre una película hidrofóbica (ver Tabla de Materiales) y pipetear 3 μL de la matriz directamente sobre la gota de muestra. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
   5. Pipeta 1 μL de la muestra 1:1: mezcla de matriz en un pozo de la placa diana de acero inoxidable MALDI. Use la punta de la pipeta para extender cada mezcla a los bordes del pozo de muestra. La muestra debe tocar los bordes del pozo de grabado para facilitar una distribución uniforme (Figura 4A).
   6. Punto 1 μL de calibrante 1:1: mezcla de matriz (mezcla de calibración comercial o personalizada, materiales poliméricos (es decir, fósforo rojo disuelto en MeOH) o iones de racimo de matriz común)¹² en un pozo cerca de la muestra.
      NOTA: El fósforo rojo no necesita mezclarse con la matriz antes de mancharse.
2. Adquisición de datos
   1. Inserte la placa objetivo que contiene puntos de muestra secos en el instrumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (consulte la Tabla de materiales).
   2. Para la matriz DHB, ajuste la potencia del láser al 95%, seleccione Ganancia óptima automática del detector y Modo de movimiento del portador de muestra Inteligente - Muestra completa . Adquiera espectros de MS en el rango de 200 a 3200 m / z y agregue múltiples espectros de cada punto juntos para aumentar la relación señal-ruido del neuropéptido.
      NOTA: Optimice el porcentaje de potencia del láser, la ganancia del detector y seleccione el modo de movimiento portador de muestra apropiado para que cada adquisición cubra aproximadamente todo el punto y las adquisiciones posteriores no vayan a las posiciones anteriores.
   3. Calibrar el instrumento.
      NOTA: Ajuste el rango de masa para abarcar el rango de neuropéptidos deseado.
3. Análisis de datos
   1. Abra el archivo MALDI-MS en el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en Resta de línea base para el software utilizado aquí.
   2. Realice la selección máxima haciendo clic en Buscar lista de masas. Si hay muy pocos picos, edite la lista de masas manualmente seleccionando Editar lista de masas y haga clic en los picos del espectro para agregarlos a la lista de masas.
   3. Realice una coincidencia de masa precisa comparando la lista de masas con la base de datos de neuropéptidos que contiene valores [M + H] ⁺ m / z (± error de 200 ppm). 
      NOTA: Los aductos de sal comunes, como [M + K] ⁺, [M + Na] ⁺ y [M + NH₄] ⁺ , también deben incluirse en la lista de objetivos de coincidencia de masa precisa.
   4. Para verificar los picos identificados, genere una lista de m/z de interés y realice experimentos de MS/MS.

3. Análisis de imágenes MALDI-MS de neuropéptidos

1. Preparación de muestras
   NOTA: Los pasos de incrustación y seccionamiento no son necesarios para los tejidos que son demasiado delgados para ser seccionados.
   1. Llene media taza de criostato con gelatina (37 °C, 100 mg/ml en agua desionizada) y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Mantenga caliente la gelatina líquida sobrante en un baño de agua a 37 °C.
   2. Recoja el tejido neuronal deseado del animal y use fórceps para sumergir inmediatamente el tejido en un tubo de 0,6 ml que contiene agua desionizada durante 1 s.
      NOTA: Consulte el Paso 1.1.2 NOTA para la disección del tejido neuronal.
   3. Coloque el tejido sobre la gelatina sólida y llene el resto de la taza de criostato con gelatina líquida. Use fórceps para colocar el tejido.
   4. Coloque la copa de criostato sobre una superficie plana y congele con hielo seco.
      NOTA: Guarde las muestras a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses).
   5. Para la preparación de la sección, separe la muestra incrustada en gelatina del molde de criostato cortando el molde.
   6. Monte el tejido incrustado en un mandril criostato pipeteando una gota de 1 ml de agua desionizada sobre el mandril e inmediatamente presionando el tejido incrustado sobre la gota.
   7. Una vez congelado, pipetee más agua desionizada alrededor del tejido para asegurarlo aún más al mandril. Realice estos pasos dentro de la caja de criostatos (consulte la Tabla de materiales) establecida a -20 °C.
   8. Seccione el tejido a un grosor aproximado de una celda (8-20 μm dependiendo del tipo de muestra) y descongele monte cada sección en un portaobjetos recubierto de óxido de indio y estaño (ITO) colocando un lado de la diapositiva cerca de la sección y colocando un dedo en el otro lado de la diapositiva para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue a la diapositiva.
      NOTA: Las secciones de tejido también se pueden montar descongelando recogiendo un borde de la gelatina con pinzas (refrigerado a -20 ° C), colocándolo en el portaobjetos de vidrio recubierto de ITO y colocando un dedo en el otro lado del portaobjetos para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue al portaobjetos.
   9. Detecte la muestra que se utilizará como calibrante (consulte el paso 2.1.6 para conocer las opciones de calibrante) dibujando un pequeño círculo cerca de la sección de tejido con una pluma hidrofóbica y detectando el calibrante dentro del círculo.
   10. Marque cada esquina de la diapositiva con un lápiz blanco con una forma pequeña que contenga bordes afilados (es decir, x) para usarlos como puntos de enseñanza.
   11. Coloque la diapositiva de vidrio en la placa adaptadora de diapositiva MALDI y realice un escaneo óptico de imagen de alta resolución (≥2400 DPI) con un escáner.
   12. Matriz de pulverización en la sección de tejido con un pulverizador automático (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles e instrucciones sobre el pulverizador).
   13. Para MSI de neuropéptidos en tejidos de crustáceos use 40 mg / ml de DHB en 50% de metanol / 0.1% FA (v / v) como matriz, ajuste la temperatura de la boquilla a 80 ° C, la velocidad a 1,250 mm / min, la tasa de flujo a 0.1 mL / min, el número de pasadas a 12 y 30 s entre cada pasada para el pulverizador automático.
2. Adquisición de datos
   1. Inserte la placa objetivo completamente seca que contiene secciones de tejido montadas en descongelación que se rociaron con la matriz.
   2. Configure los parámetros del archivo de adquisición de imágenes de MS para que el diámetro del láser sea menor que el tamaño del paso ráster.
   3. Cargue la imagen óptica escaneada y calibre la placa de muestra utilizando los x puntos de enseñanza. Defina las áreas de tejido de interés que se medirán ligeramente más grandes que la sección de tejido real para incluir también áreas que contengan solo matriz.
   4. Calibra el instrumento y adquiere espectros en el rango de 200 - 3200 m/z. Ajuste el rango de masa para abarcar el rango de neuropéptidos deseado.
3. Análisis de datos
   1. Para procesar datos, importe el conjunto de datos de imágenes de MS en el software deseado, seleccione un algoritmo de eliminación de línea base y normalice los datos utilizando el recuento total de iones.
      NOTA: La selección de diferentes algoritmos de normalización, como la mediana, el valor del cuadrado medio raíz (RMS) o la intensidad de un valor de referencia m/z , probablemente cambiará la distribución espacial de muchos valores m/z . Elija el algoritmo de normalización más adecuado para los analitos deseados.
   2. Para generar una imagen para cada valor m/z de una lista teórica de picos, cargue un archivo de valores separados por comas (CSV) que contenga el neuropéptido [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+NH₄]⁺, etc. Obtenga valores m/z haciendo clic en Archivo > Importar > lista de picos. Asigne un nombre a la lista de picos.
   3. Para estimar el umbral de error de ppm apropiado, primero identifique manualmente un pico de neuropéptido en el espectro de EM y compárelo con la masa teórica del neuropéptido. Calcule el error ppm y haga clic en Archivo > Propiedades del archivo > Ancho de intervalo e ingrese el error ppm.
   4. Seleccione la lista de picos en el menú desplegable y haga clic en Crear imágenes m/z para cada intervalo de la lista de picos.
   5. Guarde cada imagen m/z haciendo clic en Guardar captura de pantalla de cada imagen m/z.
      NOTA: La identificación de neuropéptidos putativos se puede realizar mediante la identificación de imágenes m / z donde la señal del analito solo se localiza dentro del tejido y no en la matriz circundante.
   6. Para verificar la identidad máxima, genere una lista de m/z de interés y realice experimentos de MS/MS.

4. Descubriendo nuevos neuropéptidos putativos utilizando la secuenciación de novo

1. Realice los pasos 1.4.2 - 1.4.5.
2. Exporte solo péptidos de novo.csv del software PEAKS con una puntuación media de confianza local (ALC) de ≥ 75.
   NOTA: Hay muchos programas disponibles para realizar secuenciación de novo , cada uno con sus propios algoritmos de puntuación y deben evaluarse en consecuencia.
3. Busque en la lista de péptidos motivos de secuencia conocidos indicativos de neuropéptidos pertenecientes a familias específicas de neuropéptidos¹⁹.
   NOTA: Si bien los motivos se conservan comúnmente bien en todas las especies, los motivos buscados deben seleccionarse teniendo en cuenta el organismo de la muestra.

5. Minería del transcriptoma para secuencias de neuropéptidos predichas

NOTA: Este paso es opcional y solo se usa para agregar a una base de datos de neuropéptidos existente o crear una nueva base de datos de neuropéptidos.

1. Elija una secuencia conocida de aminoácidos preprohormonas de interés y use tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
   _LOC=blasthome) para buscar la secuencia de preprohormonas de consulta en bases de datos que incluyen nr/nt, Refseq_genomes, EST y TSA.
   Nota : para buscar secuencias de consulta en la base de datos de proteínas, utilice BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
   _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
   1. Seleccione el organismo objetivo (número de identificación fiscal) y cambie los parámetros del algoritmo Expect Threshold a 1000 para incluir alineaciones de puntuación baja.
   2. Ejecute el programa BLAST y luego verifique los resultados para obtener puntuaciones de homología altas entre las secuencias de consulta y de sujeto que producen alineaciones significativas. Guarde el archivo FASTA que contiene la secuencia de nucleótidos.
      NOTA: Si hay varias secuencias de sujetos con puntuaciones de homología similares, realice una alineación MAFFT para reducir las secuencias putativas^20,21.
2. Traduzca la secuencia de nucleótidos preprohormonas en secuencias de péptidos preprohormonas utilizando la herramienta Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Para C. sapidus, seleccione Invertebrado mitocondrial para el código genético.
3. Compruebe si hay secuencia de péptidos de señal y sitios de escisión de prohormonas en las secuencias de péptidos utilizando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
   NOTA: La homología con esquemas conocidos de procesamiento de preprohormonas también se puede utilizar para identificar los sitios de escisión de la prohormona. Si se desea, se pueden predecir posibles modificaciones post-traduccionales para péptidos señal. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) se puede utilizar para predecir el estado de sulfatación de los residuos de tirosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) se puede utilizar para predecir la conectividad del enlace disulfuro.

Resultados

El flujo de trabajo para la preparación de muestras y el análisis de EM se muestra en la Figura 1. Después de la disección del tejido neuronal, se realiza la homogeneización, extracción y desalinización para purificar muestras de neuropéptidos. Si se desea una cuantificación isotópica basada en etiquetas, las muestras se etiquetan y desalan una vez más. La muestra resultante se analiza a través de LC-MS/MS para la identificación y cuantificación de neuropéptidos.

Discusión

La identificación, cuantificación y localización precisas de los neuropéptidos y péptidos endógenos que se encuentran en el sistema nervioso son cruciales para comprender su función^23,24. La espectrometría de masas es una técnica poderosa que puede permitir que todo esto se logre, incluso en organismos sin un genoma completamente secuenciado. Se demuestra la capacidad de este protocolo para detectar, cuantificar y localizar neuropéptidos a partir de tej...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix	Supelco	39319
Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A955-500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Borane pyridine	Sigma-Aldrich	179752
Bruker peptide calibration mix	Bruker Daltonics	NC9846988
Capillary	Polymicro	1068150019	to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup	Sigma-Aldrich	E6032	any cup or mold should work
Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30108434
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Formaldehyde - D2	Sigma-Aldrich	492620
Formic acid Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A117-50
Gelatin	Difco	214340	place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen	Vector Labs	15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials	Thermo	TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade	Fisher Chemical	A456-500
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Hydrophobic film
pH-Indicator strips	Supelco	109450
Red phosphorus clusters	Sigma-Aldrich	343242
Reversed phase C18 material	Waters	186002350	manually packed into nanoflow column
Wite-out pen	BIC	150810
ZipTip	Millipore	Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5	HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R	Eppendorf	05-401-205
Cryostat- HM 550	Thermo Fisher Scientific	956564A
Desiccant	Drierite	2088701
Forceps	WPI	501764
MALDI stainless steel target plate	Bruker Daltonics	8280781
Pipet-Lite XLS	Rainin	17014391	200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100	Savant	SVC-100D
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	2510R-MTH	for sonication
Ultrasonic homogenizer	Fisher Scientific	FB120110	FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer	Corning	6775
Water bath (37C) - Isotemp 110	Fisher Scientific	15-460-10
Data Analysis Software
Expasy	https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis	Bruker Daltonics
FlexControl	Bruker Daltonics
FlexImaging	Bruker Daltonics
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab	https://scils.de/
SignalP 5.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome