Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

Resumo

A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.

Resumo

Neuropeptídeos são moléculas de sinalização que regulam quase todos os processos fisiológicos e comportamentais, como desenvolvimento, reprodução, ingestão de alimentos e resposta a estressores externos. No entanto, os mecanismos bioquímicos e o complemento completo dos neuropeptídeos e seus papéis funcionais permanecem mal compreendidos. A caracterização desses peptídeos endógenos é dificultada pela imensa diversidade dentro dessa classe de moléculas sinalizadoras. Além disso, neuropeptídeos são bioativos em concentrações 100x - 1000x inferiores aos neurotransmissores e são propensos à degradação enzimática após a liberação sináptica. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta analítica altamente sensível que pode identificar, quantificar e localizar analitos sem conhecimento a priori abrangente. É adequado para traçar neuropeptídeos globalmente e ajudar na descoberta de novos peptídeos. Devido à baixa abundância e alta diversidade química desta classe de peptídeos, vários métodos de preparação de amostras, parâmetros de aquisição de EM e estratégias de análise de dados foram adaptados a partir de técnicas de proteômica para permitir a caracterização ideal do neuropeptídeo. Aqui, são descritos métodos para isolar neuropeptídeos de tecidos biológicos complexos para caracterização, quantitação e localização de sequências usando cromatografia líquida (LC)-MS e desorpção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)-MS. Um protocolo para preparar um banco de dados de neuropeptídeo do caranguejo azul, Callinectes sapidus, um organismo sem informações genômicas abrangentes, está incluído. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para estudar outras classes de peptídeos endógenos em diferentes espécies usando uma variedade de instrumentos.

Introdução

O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de aminoácidos, que determina mobilidade, interação receptora e afinidade¹. Técnicas como a histoquímica, importante porque os neuropeptídeos podem ser sintetizados, armazenados e liberados em diferentes regiões do tecido, e a eletrofisiologia têm sido empregadas para investigar a estrutura e função do neuropeptídeo ^2,3,4, mas esses métodos são limitados pelo throughput e especificidade para resolver a vasta diversidade sequencial de neuropeptídeos.

A espectrometria de massa (MS) permite a análise de alto rendimento da estrutura e abundância do neuropeptídeo. Isso pode ser realizado através de diferentes técnicas de EM, mais comumente cromatografia-eletrospraização líquida MS (LC-ESI-MS)⁵ e desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS)⁶. Utilizando medidas de massa de alta precisão e fragmentação de MS, a MS fornece a capacidade de atribuir sequência de aminoácidos e status de modificação pós-translacional (PTM) a neuropeptídeos de misturas complexas sem conhecimento a priori para ajudar na verificação de sua função ^7,8. Além das informações qualitativas, a MS permite informações quantitativas de neuropeptídeos por meio de quantitação sem rótulos (LFQ) ou métodos baseados em rótulos, como rotulagem isotópica ou isobárica⁹. As principais vantagens do LFQ incluem sua simplicidade, baixo custo de análise e diminuição das etapas de preparação da amostra que podem minimizar a perda de amostras. No entanto, as desvantagens do LFQ incluem o aumento dos custos de tempo do instrumento, pois requer múltiplas réplicas técnicas para lidar com o erro quantitativo da variabilidade run-to-run. Isso também leva a uma diminuição da capacidade de quantificar com precisão pequenas variações. Os métodos baseados em rótulos são submetidos a uma variação menos sistemática, pois várias amostras podem ser rotuladas diferencialmente usando uma variedade de isótopos estáveis, combinados em uma amostra, e analisados através de espectrometria de massa simultaneamente. Isso também aumenta o rendimento, embora rótulos isotópicos possam ser demorados e caros para sintetizar ou comprar. A complexidade espectral do espectro de massa de varredura completa (MS1) também aumenta à medida que o multiplexing aumenta, o que diminui o número de neuropeptídeos únicos capazes de ser fragmentados e, portanto, identificados. Por outro lado, a rotulagem isobárica não aumenta a complexidade espectral no nível MS1, embora introduza desafios para analitos de baixa abundância, como neuropeptídeos. Como a quantitação isobárica é realizada no nível de espectro de massa de íons de fragmento (MS2), neuropeptídeos de baixa abundância podem ser incapazes de ser quantificados, pois componentes matriciais mais abundantes podem ser selecionados para fragmentação e aqueles selecionados podem não ter abundância alta o suficiente para serem quantificados. Com rotulagem isotópica, a quantitação pode ser realizada em todos os peptídeos identificados.

Além da identificação e quantificação, as informações de localização podem ser obtidas pela MS através de imagens MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Ao rasterar um laser através de uma superfície de amostra, os espectros ms podem ser compilados em uma imagem de mapa de calor para cada valor m/z . Mapear a intensidade do sinal de neuropeptídeo transitório em diferentes regiões em condições pode fornecer informações valiosas para a determinação da função¹¹. A localização de neuropeptídeos é especialmente importante porque a função neuropeptídeo pode diferir dependendo do local¹².

Neuropeptídeos são encontrados em menor abundância in vivo do que outras moléculas de sinalização, como neurotransmissores, e assim requerem métodos sensíveis para detecção¹³. Isso pode ser alcançado através da remoção de componentes de matriz de maior abundância, como lipídios^11,14. Considerações adicionais para a análise de neuropeptídeos precisam ser feitas quando comparadas aos fluxos de trabalho proteômicos comuns, principalmente porque a maioria das análises neuropeptidômicas omitem a digestão enzimática. Isso limita as opções de software para análise de dados de neuropeptídeos, pois a maioria foi construída com algoritmos baseados em dados de proteômica e correspondências de proteínas informadas pela detecção de peptídeos. No entanto, muitos softwares como o PEAKS¹⁵ são mais adequados à análise de neuropeptídeos devido às suas capacidades de sequenciamento de novo. Vários fatores precisam ser considerados para a análise de neuropeptídeos a partir do método de extração à análise de dados em MS.

Os protocolos descritos aqui incluem métodos para preparação de amostras e rotulagem isotópica de dimetila, aquisição de dados e análise de dados de neuropeptídeos por LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MS. Através de resultados representativos de vários experimentos, demonstra-se a utilidade e a capacidade desses métodos de identificar, quantificar e localizar neuropeptídeos de caranguejos azuis, Callinectes sapidus. Para entender melhor o sistema nervoso, os sistemas de modelos são comumente usados. Muitos organismos não têm um genoma totalmente sequenciado disponível, o que impede a descoberta abrangente de neuropeptídeos no nível do peptídeo. Para mitigar esse desafio, está incluído um protocolo de identificação de novos neuropeptídeos e mineração de transcriptome para gerar bancos de dados para organismos sem informações completas do genoma. Todos os protocolos aqui apresentados podem ser otimizados para amostras de neuropeptídeos de qualquer espécie, bem como aplicados para a análise de quaisquer peptídeos endógenos.

Protocolo

Todas as amostras de tecido descritas foram realizadas em conformidade com as diretrizes da Universidade de Wisconsin-Madison.

1. Análise LC-ESI-MS de neuropeptídeos

1. Extração e desalamento de neuropeptídeos
   1. Antes da aquisição de tecidos, prepare o metanol acidificado (acMeOH) (90:9:1 MeOH:água:ácido acético) como descrito em¹⁶.
   2. Colete tecido cerebral do crustáceo¹⁷ e use fórceps para colocar imediatamente um tecido cada um em um tubo de 0,6 mL contendo 20 μL de acMeOH.
      NOTA: Os protocolos de dissecção de tecidos variam muito para diferentes animais e diferentes tipos de tecidos. O leitor é encaminhado ao protocolo¹⁷ para uma descrição detalhada sobre como dissecar tecido cerebral e vários outros tipos de tecido do crustáceo. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses). Os volumes descritos são usados para um único cérebro de Callinectes sapidus. Os volumes devem ser dimensionados para o tamanho do tecido. O tecido pode ser congelado imediatamente sem solvente, embora isso não seja recomendado, pois enzimas proteolíticas endógenas não serão inibidas e permanecerão ativas, embora a uma taxa mais lenta quando frias.
   3. Adicione 150 μL de acMeOH à amostra. Defina o tempo total de sônica para 24 s, o tempo de pulso para 8 s, o tempo de pausa para 15 s e a amplitude para 50% em um homogeneizador ultrassônico e homogeneize as amostras no gelo.
      NOTA: Existem diferentes sistemas de homogeneização disponíveis. Ajuste as configurações e condições de acordo com o tipo de amostra e o equipamento.
   4. Centrifugar a amostra a 4 °C a 20.000 x g por 20 min. Com uma pipeta, transfira o supernasal em um tubo e seque-o em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
      NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses). O aquecimento do concentrador de vácuo deve ser realizado com cautela. Enquanto o calor encurta o tempo seco, a amostra deve ser removida do concentrador imediatamente depois de todo o líquido ter evaporado para minimizar a degradação do peptídeo. Para evitar isso, o aquecimento pode ser omitido desta e de todas as etapas subsequentes.
   5. Para desalar, reconstitua a amostra de tecido extraído em 20 μL de ácido fórmico (FA), vórtice bem e sonicato em banho-maria à temperatura ambiente por 1 min.
      NOTA: Existem diferentes materiais de desalhados disponíveis. Ajuste as soluções e volumes de acordo com a identidade de resina e a quantidade de neuropeptídeo. A quantidade total de peptídeo pode ser estimada usando um ensaio comercial de quantitação de peptídeos (ver Tabela de Materiais) .
   6. Aplique 0,5 μL de amostra em uma tira de pH para confirmar que pH < 4. Se o pH for maior, adicione 1 μL alíquotas de FA de 10% até que o pH < 4.
   7. Siga o protocolo do fabricante para desalar¹⁸. Prepare uma solução de molhar contendo 100 μL de acetonitrilo de 50% (ACN), solução de equilíbrio contendo 100 μL de 0,1% fa, solução de lavagem contendo 100 μL de FA de 0,1% e soluções de eluição contendo 20 μL de 25% ACN/0,1% FA, 20 μL de 50% ACN/0,1% FA e 20 μL de 75% ACN/0,1% FA.
   8. Obtenha uma ponta de desalh de 10 μL com resina C18 (ver Tabela de Materiais).
   9. Coloque a ponta de desalar em uma pipeta de 20 μL que está definida para 15 μL. Uma vez que a ponta de desalada esteja molhada, evite que o ar passe mantendo a pipeta deprimida quando estiver fora de solução até que seja descartada.
   10. Aspire a ponta 3x com solução de molhar e 3x com solução de equilíbrio. Aspirar na amostra 10x seguido de lavar 3x na solução de lavagem, descartando cada lavagem. Elute aspirando 10x em cada uma das soluções de elução para aumentar a ACN.
       NOTA: As frações de elução podem ser mantidas separadas ou combinadas para análises posteriores.
   11. Descarte a ponta de desalamento usada e seque os neuropeptídeos elucidos em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
       NOTA: Pode ser armazenado a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses).
2. Rotulagem isotópica de neuropeptídeos no extrato de tecido
   NOTA: Esta etapa é opcional e só é usada quando deseja a quantificação.
   1. Prepare a solução de rotulagem de dimetil isotópica de 2 plex em um capô de fumaça: 1% CH₂OH₂ (13,5 μL de estoque 37 percentual de peso/peso (wt. %) na solução de água em 486,5 μL de água), 1% CH₂OD₂ (25 μL de estoque 20 wt. % solução em 475 μL de água) e 0,03 M borane pyridina (3,75 μL de estoque 8 M solução em 996,25 μL de água).
      ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico, por isso todas as soluções devem ser mantidas em um capô ventilado. Use luvas, jaleco, proteção ocular e calçados impermeáveis. As lentes de contato não devem ser usadas ao trabalhar com este material.
      NOTA: Existem diferentes reagentes isotópicos; selecione os apropriados com base no tipo de amostra e no número de canais de rotulagem desejados.
   2. Dissolver extrato de neuropeptídeo bruto em 10 μL de água e sonicato por 10 minutos.
   3. Adicione 10 μL de uma solução de formaldeído isotópica diferente (ou seja, CH₂OH₂, CH₂OD₂, etc.) a cada condição experimental diferente a ser medida quantitativamente. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
   4. Adicione 10 μL de 0,03 M de piraidina de borano a cada tubo de amostra. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
   5. Incubar as amostras por 15 min a 37 °C em banho-maria.
   6. Remova as amostras do banho de água e adicione 10 μL de 100 mM de bicarbonato de amônio. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
   7. Combine as amostras rotuladas para uma amostra de 2 plex e seque os neuropeptídeos em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
   8. Desaltar os neuropeptídeos rotulados reperformando as etapas 1.1.5 - 1.1.10 e armazená-las até estar pronta para aquisição de dados.
3. Aquisição de Dados
   1. Reconstitua os neuropeptídeos secos dessaptídeos em 12 μL de 3% ACN/0,1% FA, bem vórtice, sonicato em banho de água de 37 °C por 1 min, e brevemente centrífuga a 2.000 x g. Transfira cada amostra em frascos de autosampler.
      NOTA: Ajuste o volume da amostra de acordo com a quantidade de neuropeptídeo para uma concentração de ~1 μg de peptídeo por μL. A quantidade total de peptídeo pode ser estimada usando um ensaio comercial de quantitação de peptídeo (ver Tabela de Materiais) .
   2. Use um autosampler para injetar 1 μL de amostra em um instrumento nano-LC-MS/MS de alta resolução (ver Tabela de Materiais).
   3. Use uma coluna C18 de fase invertida de aproximadamente 15 cm de comprimento (RP) (ver Tabela de Materiais) para executar a amostra com 0,1% fa na água como fase móvel A e 0,1% FA na ACN como fase móvel B. Execute as amostras com um gradiente de 3% - 95% de B a uma taxa de 300 nL/min por mais de 11 min.
   4. Para o instrumento MS utilizado aqui, utilize condições comuns de MS de 2,00 kV para tensão de pulverização e 275 °C para temperatura capilar.
   5. Adquirir espectros MS na faixa de 200 - 2.000 m/z com resolução de 60.000, controle automático de ganho (AGC) alvo de 1 x 10⁶, e tempo máximo de injeção de íons (TI) de 150 ms.
   6. Selecione os 15 íons mais intensos (intensidade mínima de 3,2 x 10⁴) para fragmentação de colisão de maior energia (HCD) utilizando uma energia de colisão normalizada de 30, janela de isolamento de 2,0 m/z, resolução de 15.000, uma meta AGC de 2 x 10⁵, e TI máxima de 250 ms.
   7. Defina uma janela de exclusão dinâmica de 30 s. Exclua íons com carga de 1 ou ≥ 8 e íons com estados de carga não reconhecidos.
4. Identificação e quantificação do neuropeptídeo
   NOTA: Muitos softwares para pesquisa de banco de dados e quantificação de peptídeos (tanto de código aberto quanto comercial) estão disponíveis. Aqui, o PEAKS Studio (software proteômica)¹⁵ será usado.
   1. Realize a pesquisa de banco de dados usando as etapas descritas em 1.4.2 - 1.4.6.
   2. Crie um novo projeto e adicione os dados LC-MS selecionando Nenhum para a enzima, Orbitrap para o instrumento, HCD para o fragmento e aquisição dependente de dados (DDA) para aquisição.
      NOTA: Selecione os parâmetros apropriados com base nos parâmetros de aquisição de dados.
   3. Selecione Identificações e selecione Apenas Precursor Correto [DDA] e Massa.
   4. Selecione Pesquisa de banco de dados e defina uma tolerância de erro de 20,0 ppm usando massa monoisotópica para massa precursora e 0,02 Da para massa de íons fragmentados, Nenhum para tipo enzim, inespecífico para modo de digestão, 100 para decotes máximos perdidos e as seguintes PTMs variáveis com a variável máxima permitida PTM por peptídeo de 3: Amidação, Oxidação (M), Pyro-glu de, Eglu e Pyro-glu de Q.
   5. Selecione o Banco de Dados de Neuropeptídeos, estime a taxa de descoberta falsa (FDR) com fusão de isca.
      NOTA: O erro de tolerância em massa deve ser ajustado para corresponder aos dados coletados. Use o banco de dados apropriado para o tipo de amostra. Quando nenhuma enzima é selecionada, o parâmetro máximo de decotes perdidos não afeta a pesquisa. No entanto, um grande número de decotes perdidos é necessário se o software não tiver o modo de digestão não especificado como uma opção.
   6. Se for desejada quantificação sem rótulo, selecione Quantificação, selecione Label-Free e defina uma tolerância de erro de 20,0 ppm e tolerância ao tempo de retenção de 1,0 min.
   7. Realize a quantificação de íons precursores se a etapa 1.2 para rotulagem isotópica for realizada.
      1. Selecione Quantificação, selecione Quantificação de Íon Precursor, use um intervalo de tempo de retenção de 1,0 min e use um limiar FDR de 1%..
      2. Selecione um método de quantificação predefinido ou personalizado no menu suspenso Do método Select .
      3. Para criar um novo método personalizado, clique em Configuração de > de janela > Método Q de rótulo > novo. Nomeie o novo método e selecione Quantificação de Íon Precursor para Tipo de Método. Selecione Adicionar linha e selecione modificação na lista de opções PTM.
      4. Adicione os dados LC-MS e selecione Condição de Referência para ser a modificação dos neuropeptídeos da condição de controle do experimento.
   8. Avalie os resultados da pesquisa conforme descrito nas etapas 1.4.9 - 1.4.11.
   9. Filtre os resultados através da guia de resumo para peptídeos e proteínas com -10lgP ≥ 20, selecione ≥ 1 peptídeo exclusivo e selecione caixa rotulada com Peptídeos Significativos.
   10. Avalie os resultados de pesquisa do banco de dados onde a Protein.csv representa identificações de neuropeptídeos e Peptídeo.csv representa identificações de fragmentos de neuropeptídeos.
   11. Inspecione a pesquisa do banco de dados por escores de proteínas e peptídeos, precisão em massa e cobertura de sequência.
       NOTA: Cada software de pesquisa de banco de dados usa algoritmos de pontuação únicos e pode precisar ser avaliado de acordo. As identificações podem ser avaliadas inspecionando manualmente os espectros observados para peptídeos identificados contendo a série completa de íons de fragmento.

2. ANÁLISE DE MANCHAS MALDI-MS de neuropeptídeos

1. Preparação da amostra
   1. Siga o passo 1.1 ou as etapas 1.1 - 1.2 se a quantificação for desejada, excluindo a etapa 1.2.8 (a desalagem após a rotulagem isotópica não é necessária antes da análise MALDI-MS).
   2. Reconstitua os neuropeptídeos secos dessacados em 5 μL de 0,1% FA, bem vórtice, sonicato em um banho de água de 37 °C por 1 min, e brevemente centrífuga a 2.000 x g.
   3. Para detectar neuropeptídeos em tecidos crustáceos, prepare 150 mg/mL 2,5-dihidroxibenóico ácido (DHB) em 50% de metanol (MeOH)/0,1% FA (v/v) como matriz.
   4. Pipeta uma gotícula de 3 μL de amostra em uma película hidrofóbica (ver Tabela de Materiais) e pipeta 3 μL da matriz diretamente na gotícula da amostra. Pipeta para cima e para baixo para misturar.
   5. Pipeta 1 μL da amostra 1:1: mistura matricial em um poço da placa de aço inoxidável MALDI. Use a ponta da pipeta para espalhar cada mistura para as bordas da amostra bem. A amostra deve tocar as bordas da gravura do poço para facilitar a distribuição uniforme (Figura 4A).
   6. Ponto 1 μL de 1:1 calibrante:mistura de matriz (mistura comercial ou personalizada de calibração, materiais de polímero (ou seja, fósforo vermelho dissolvido em MeOH), ou íons comuns de aglomerados de matriz)¹² em um poço perto da amostra.
      NOTA: O fósforo vermelho não precisa ser misturado com matriz antes de detectar.
2. Aquisição de dados
   1. Insira a placa-alvo contendo manchas de amostra seca no instrumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (ver Tabela de Materiais).
   2. Para a matriz DHB, defina a potência laser para 95%, selecione O Ganho Automático do Detector Ideal e o modo de movimento do portador da amostra inteligente - amostra completa . Adquira espectros ms na faixa de 200 a 3200 m/z e adicione vários espectros de cada ponto juntos para aumentar a relação sinal-ruído de neuropeptídeo.
      NOTA: Otimize a porcentagem de potência a laser, o ganho do detector e selecione o modo de movimento adequado do portador da amostra para que cada aquisição cubra aproximadamente todo o local e as aquisições subsequentes não vão para as posições anteriores.
   3. Calibrar o instrumento.
      NOTA: Ajuste a faixa de massa para abranger a faixa de neuropeptídeo desejada.
3. Análise de dados
   1. Abra o arquivo MALDI-MS no software de análise de dados (ver Tabela de Materiais) e clique em Subtração de Linha de Base para o software usado aqui.
   2. Execute a escolha de pico clicando em "Encontrar lista de massas". Se houver poucos picos, edite a lista de massa manualmente selecionando Editar lista de massas e clique em picos no espectro para adicioná-los à lista de massa.
   3. Execute uma correspondência de massa precisa comparando a lista de massa com o banco de dados de neuropeptídeos contendo valores [M+H]⁺ m/z (± erro de 200 ppm).
      NOTA: Adutos comuns de sal, como [M+K]⁺, [M+Na]⁺, e [M+NH₄]⁺, também devem ser incluídos na lista de alvos de correspondência de massa precisa.
   4. Para verificar os picos identificados, gere uma lista de m/z de interesse e realize experimentos de MS/MS.

3. ANÁLISE DE IMAGEM MALDI-MS de neuropeptídeos

1. Preparação da amostra
   NOTA: As etapas de incorporação e secção não são necessárias para que os tecidos muito finos sejam seccionados.
   1. Encha meio copo criostat com gelatina (37 °C, 100 mg/mL em água deionizada) e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Mantenha a gelatina líquida restante quente em um banho de água de 37 °C.
   2. Colete tecido neuronal desejado do animal e use fórceps para mergulhar imediatamente o tecido em um tubo de 0,6 mL contendo água deionizada para 1 s.
      NOTA: Consulte a etapa 1.1.2 NOTA para dissecção do tecido neuronal.
   3. Coloque o tecido em cima da gelatina sólida e encha o resto do copo criostat com gelatina líquida. Use fórceps para posicionar o tecido.
   4. Coloque o copo criostat em uma superfície plana e congele com gelo seco.
      NOTA: Armazene amostras a -80 °C até usar (idealmente dentro de 6 meses).
   5. Para a preparação da secção, separe a amostra embutida de gelatina do molde criostat, cortando o molde.
   6. Monte o tecido incorporado em um mandril criostat, canalizado uma gota de 1 mL de água desionizada no mandril e pressione imediatamente o tecido incorporado na gotícula.
   7. Uma vez congelada, a pipeta mais água deionizada ao redor do tecido para fixá-lo ainda mais no mandril. Execute estas etapas dentro da caixa criostat (ver Tabela de Materiais) definida a -20 °C.
   8. Se sectionia o tecido em uma espessura aproximada de uma célula (8-20 μm dependendo do tipo de amostra) e descongele montar cada seção em um deslizamento de vidro revestido de óxido de lata de índio (ITO) colocando um lado da lâmina perto da seção e colocando um dedo do outro lado da lâmina para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.
      NOTA: As seções teciduais também podem ser montadas com degelo, pegando uma borda da gelatina com pinças (refrigerada a -20 °C), colocando-a no slide de vidro revestido de ITO e colocando um dedo do outro lado do slide para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.
   9. Localizá-lo como calibrante (ver passo 2.1.6 para opções calibrantes) desenhando um pequeno círculo perto da seção de tecido usando uma caneta hidrofóbica e detectando o calibrador dentro do círculo.
   10. Marque cada canto do slide com uma caneta branca com uma pequena forma contendo bordas afiadas (ou seja, x) para ser usada como pontos de ensino.
   11. Coloque o deslizamento de vidro na placa do adaptador de slides MALDI e faça uma varredura óptica de imagem óptica de alta resolução (≥2400 DPI) usando um scanner.
   12. Matriz de pulverização na seção de tecido usando um pulverizador automatizado (consulte Tabela de Materiais para obter detalhes e instruções do pulverizador).
   13. Para o MSI de neuropeptídeos em tecidos crustáceos use 40 mg/mL DHB em 50% de metanol/0,1% FA (v/v) como matriz, definir a temperatura do bocal para 80 °C, velocidade para 1.250 mm/min, vazão para 0,1 mL/min, número de passes para 12 e 30 s entre cada passe para o pulverizador automático.
2. Aquisição de dados
   1. Insira a placa alvo completamente seca contendo seções de tecido montadas com degelo que foram pulverizadas com a matriz.
   2. Configure os parâmetros do arquivo de aquisição de imagens MS para que o diâmetro do laser seja menor do que o tamanho do passo raster.
   3. Carregue a imagem óptica digitalizada e calibrar a placa de amostra usando os pontos de ensino x. Defina as áreas de interesse do tecido a serem medidas ligeiramente maiores do que a seção de tecido real para incluir também áreas que contenham apenas matriz.
   4. Calibrar o instrumento e adquirir espectros na faixa de 200 a 3200 m/z. Ajuste a faixa de massa para abranger a faixa de neuropeptídeo desejada.
3. Análise de dados
   1. Para processar dados, importe o conjunto de dados de imagem MS no software desejado, selecione um algoritmo de remoção de linha de base e normalize os dados usando a Contagem total de íons.
      NOTA: A seleção de diferentes algoritmos de normalização, como o valor médio, o valor médio médio do quadrado (RMS) ou a intensidade de um valor de referência m/z , provavelmente alterará a distribuição espacial de muitos valores de m/z . Escolha o algoritmo de normalização mais adequado para analitos desejados.
   2. Para gerar uma imagem para cada valor m/z a partir de uma lista de picos teóricos, carregue um arquivo de valores separados por címula (CSV) contendo neuropeptídeo [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+NH₄]⁺, etc. Obtenha valores m/z clicando em Arquivo > Importar > Lista de Pico. Diga o nome da lista de picos.
   3. Para estimar o limiar de erro ppm apropriado, primeiro identifique manualmente um pico de neuropeptídeo no espectro de MS e compare-o com a massa teórica do neuropeptídeo. Calcule o erro ppm e clique em Propriedades de arquivo > arquivo > largura de intervalo e erro de ppm de entrada.
   4. Selecione a lista de picos no menu suspenso e clique em Criar imagens m/z para cada intervalo da lista de picos.
   5. Salve cada imagem m/z clicando em Salvar captura de tela de cada m/z imagem.
      NOTA: A identificação de neuropeptídeos putativos pode ser realizada identificando imagens m/z onde o sinal de analito é localizado apenas dentro do tecido e não na matriz circundante.
   6. Para verificar a identidade máxima, gere uma lista de m/z de interesse e realize experimentos de MS/MS.

4. Descobrir novos neuropeptídeos putativos usando de novo sequenciamento

1. Realizar etapas 1.4.2 - 1.4.5.
2. Exportação de novo apenas peptídeos.csv do software PEAKS com uma pontuação média de confiança local (ALC) de ≥ 75.
   NOTA: Existem muitos softwares disponíveis para realizar o novo sequenciamento, cada um com seus próprios algoritmos de pontuação e deve ser avaliado de acordo.
3. Pesquise na lista de peptídeos por motivos de sequência conhecidos indicativos de neuropeptídeos pertencentes a famílias específicas de neuropeptídeos¹⁹.
   NOTA: Embora os motivos sejam comumente bem conservados entre as espécies, os motivos pesquisados devem ser selecionados com consideração ao organismo amostral.

5. Mineração de transcriptome para sequências de neuropeptídeos previstas

NOTA: Esta etapa é opcional e usada apenas para adicionar a um banco de dados de neuropeptídeo existente ou construir um novo banco de dados de neuropeptídeos.

1. Escolha uma sequência de aminoácidos préprohormone conhecida de interesse e use tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
   _LOC=blasthome) para pesquisar a sequência de préprohormona de consulta em bancos de dados incluindo nr/nt, Refseq_genomes, EST e TSA.
   NOTA: Para pesquisar sequências de consultas contra banco de dados de proteínas, use BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
   _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
   1. Selecione o organismo alvo (id fiscal) e altere os parâmetros do algoritmo Expect Threshold para 1000 para incluir alinhamentos de pontuação baixa.
   2. Execute o programa BLAST e, em seguida, verifique os resultados para obter altos escores de escoologia entre consulta e sequências de assunto produzindo alinhamentos significativos. Salve o arquivo FASTA contendo sequência de nucleotídeos.
      NOTA: Se houver várias sequências de sujeitos com pontuações de escoologia semelhantes, realize um alinhamento MAFFT para reduzir as sequências putativas^20,21.
2. Traduza a sequência de nucleotídeos préprohormona em sequências de peptídeos préprohormone usando a ferramenta Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Para C. sapidus, selecione Invertebrado Mitocondrial para código genético.
3. Verifique se há sequência de peptídeos de sinal e locais de decote de prohormone nas sequências de peptídeos usando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
   NOTA: A homologia de esquemas de processamento préprohormone conhecidos também pode ser usada para identificar locais de decote prohormone. Possíveis modificações pós-translacionais para peptídeos de sinal podem ser previstas se desejarem. Sulfinador (https://web.expasy.org/sulfinator/) pode ser usado para prever o estado de sulfação de resíduos de tyrosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) pode ser usado para prever a conectividade de ligação de dissulfeto.

Resultados

O fluxo de trabalho para preparação da amostra e análise de MS é retratado na Figura 1. Após a dissecção do tecido neuronal, a homogeneização, extração e dessacração são realizadas para purificar amostras de neuropeptídeos. Se a quantificação isotópica à base de rótulo for desejada, as amostras ão então rotuladas e desálvadas mais uma vez. A amostra resultante é analisada através de LC-MS/MS para identificação e quantificação de neuropeptídeos.

Discussão

A identificação precisa, quantificação e localização de neuropeptídeos e peptídeos endógenos encontrados no sistema nervoso são cruciais para entender sua função^23,24. A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que pode permitir que tudo isso seja realizado, mesmo em organismos sem um genoma totalmente sequenciado. A capacidade deste protocolo de detectar, quantificar e localizar neuropeptídeos a partir de tecido coletado de C. sapidus

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix	Supelco	39319
Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A955-500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Borane pyridine	Sigma-Aldrich	179752
Bruker peptide calibration mix	Bruker Daltonics	NC9846988
Capillary	Polymicro	1068150019	to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup	Sigma-Aldrich	E6032	any cup or mold should work
Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30108434
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Formaldehyde - D2	Sigma-Aldrich	492620
Formic acid Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A117-50
Gelatin	Difco	214340	place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen	Vector Labs	15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials	Thermo	TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade	Fisher Chemical	A456-500
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Hydrophobic film
pH-Indicator strips	Supelco	109450
Red phosphorus clusters	Sigma-Aldrich	343242
Reversed phase C18 material	Waters	186002350	manually packed into nanoflow column
Wite-out pen	BIC	150810
ZipTip	Millipore	Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5	HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R	Eppendorf	05-401-205
Cryostat- HM 550	Thermo Fisher Scientific	956564A
Desiccant	Drierite	2088701
Forceps	WPI	501764
MALDI stainless steel target plate	Bruker Daltonics	8280781
Pipet-Lite XLS	Rainin	17014391	200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100	Savant	SVC-100D
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	2510R-MTH	for sonication
Ultrasonic homogenizer	Fisher Scientific	FB120110	FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer	Corning	6775
Water bath (37C) - Isotemp 110	Fisher Scientific	15-460-10
Data Analysis Software
Expasy	https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis	Bruker Daltonics
FlexControl	Bruker Daltonics
FlexImaging	Bruker Daltonics
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab	https://scils.de/
SignalP 5.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome