Indagine spettrometrica di massa sfaccettata di neuropeptidi in Callinectes sapidus

Riepilogo

La caratterizzazione spettrometrica di massa dei neuropeptidi fornisce informazioni di sequenza, quantificazione e localizzazione. Questo flusso di lavoro ottimizzato non è utile solo per gli studi sui neuropeptidi, ma anche per altri peptidi endogeni. I protocolli forniti qui descrivono la preparazione del campione, l'acquisizione della SM, l'analisi della SM e la generazione di neuropeptidi nel database utilizzando LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting e MALDI-MS imaging.

Abstract

I neuropeptidi sono molecole di segnalazione che regolano quasi tutti i processi fisiologici e comportamentali, come lo sviluppo, la riproduzione, l'assunzione di cibo e la risposta a fattori di stress esterni. Tuttavia, i meccanismi biochimici e il pieno complemento dei neuropeptidi e i loro ruoli funzionali rimangono poco compresi. La caratterizzazione di questi peptidi endogeni è ostacolata dall'immensa diversità all'interno di questa classe di molecole di segnalazione. Inoltre, i neuropeptidi sono bioattivi a concentrazioni 100x - 1000x inferiori a quelle dei neurotrasmettitori e sono soggetti a degradazione enzimatica dopo il rilascio sinaptico. La spettrometria di massa (MS) è uno strumento analitico altamente sensibile in grado di identificare, quantificare e localizzare analiti senza una conoscenza a priori completa. È adatto per profilare globalmente i neuropeptidi e aiutare nella scoperta di nuovi peptidi. A causa della bassa abbondanza e dell'elevata diversità chimica di questa classe di peptidi, diversi metodi di preparazione del campione, parametri di acquisizione della SM e strategie di analisi dei dati sono stati adattati dalle tecniche di proteomica per consentire una caratterizzazione ottimale dei neuropeptidi. Qui, vengono descritti metodi per isolare i neuropeptidi da tessuti biologici complessi per la caratterizzazione, la quantificazione e la localizzazione della sequenza utilizzando la cromatografia liquida (LC)-MS e il desorbimento / ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)-MS. È incluso un protocollo per la preparazione di un database di neuropeptidi dal granchio blu, Callinectes sapidus, un organismo senza informazioni genomiche complete. Questi flussi di lavoro possono essere adattati per studiare altre classi di peptidi endogeni in diverse specie utilizzando una varietà di strumenti.

Introduzione

Il sistema nervoso è complesso e richiede una rete di neuroni per trasmettere segnali in tutto l'organismo. Il sistema nervoso coordina le informazioni sensoriali e la risposta biologica. Le interazioni intricate e contorte coinvolte nella trasmissione del segnale richiedono molte molecole di segnalazione diverse come neurotrasmettitori, steroidi e neuropeptidi. Poiché i neuropeptidi sono le molecole di segnalazione più diverse e potenti che svolgono un ruolo chiave nell'attivazione delle risposte fisiologiche allo stress e ad altri stimoli, è interessante determinare il loro ruolo specifico in questi processi fisiologici. La funzione neuropeptidica è correlata alla loro struttura aminoacidica, che determina la mobilità, l'interazione del recettore e l'affinità¹. Tecniche come l'istochimica, che è importante perché i neuropeptidi possono essere sintetizzati, immagazzinati e rilasciati in diverse regioni del tessuto, e l'elettrofisiologia sono state impiegate per studiare la struttura e la funzione^dei neuropeptidi ^2,3,4, ma questi metodi sono limitati dal throughput e dalla specificità per risolvere la vasta diversità di sequenze dei neuropeptidi.

La spettrometria di massa (MS) consente l'analisi ad alto rendimento della struttura e dell'abbondanza dei neuropeptidi. Questo può essere eseguito attraverso diverse tecniche di SM, più comunemente cromatografia liquida-ionizzazione elettrospray MS (LC-ESI-MS)⁵ e desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice MS (MALDI-MS)⁶. Utilizzando misurazioni di massa ad alta precisione e frammentazione della SM, MS fornisce la possibilità di assegnare la sequenza di amminoacidi e lo stato di modificazione post-traduzionale (PTM) ai neuropeptidi da miscele complesse senza conoscenza a priori per aiutare ad accertare la loro funzione ^7,8. Oltre alle informazioni qualitative, la SM consente l'informazione quantitativa dei neuropeptidi attraverso la quantificazione senza etichetta (LFQ) o metodi basati su etichette come l'etichettatura isotopica o isobarica⁹. I principali vantaggi di LFQ includono la sua semplicità, il basso costo di analisi e la riduzione delle fasi di preparazione del campione che possono ridurre al minimo la perdita di campioni. Tuttavia, gli svantaggi di LFQ includono l'aumento dei costi di tempo dello strumento in quanto richiede più repliche tecniche per affrontare l'errore quantitativo dovuto alla variabilità run-to-run. Ciò porta anche a una diminuzione della capacità di quantificare con precisione piccole variazioni. I metodi basati su etichette sono soggetti a variazioni meno sistematiche in quanto più campioni possono essere etichettati in modo differenziale utilizzando una varietà di isotopi stabili, combinati in un unico campione e analizzati simultaneamente attraverso la spettrometria di massa. Ciò aumenta anche la produttività, sebbene le etichette isotopiche possano richiedere molto tempo e denaro da sintetizzare o acquistare. Anche la complessità spettrale degli spettri di massa a scansione completa (MS1) aumenta con l'aumentare del multiplexing, il che diminuisce il numero di neuropeptidi unici in grado di essere frammentati e, quindi, identificati. Al contrario, l'etichettatura isobarica non aumenta la complessità spettrale a livello MS1, sebbene introduca sfide per gli analiti a bassa abbondanza come i neuropeptidi. Poiché la quantificazione isobarica viene eseguita a livello degli spettri di massa ionica del frammento (MS2), i neuropeptidi a bassa abbondanza potrebbero non essere in grado di essere quantificati poiché componenti della matrice più abbondanti possono essere selezionati per la frammentazione e quelli selezionati potrebbero non avere un'abbondanza abbastanza elevata da essere quantificati. Con l'etichettatura isotopica, la quantificazione può essere eseguita su ogni peptide identificato.

Oltre all'identificazione e alla quantificazione, le informazioni di localizzazione possono essere ottenute dagli SM tramite l'imaging MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Rasterizzando un laser su una superficie campione, gli spettri MS possono essere compilati in un'immagine della mappa di calore per ogni valore m/z . La mappatura dell'intensità del segnale neuropeptidico transitorio in diverse regioni attraverso le condizioni può fornire informazioni preziose per la determinazione della funzione¹¹. La localizzazione dei neuropeptidi è particolarmente importante perché la funzione del neuropeptide può differire a seconda della posizione¹².

I neuropeptidi si trovano in una minore abbondanza in vivo rispetto ad altre molecole di segnalazione, come i neurotrasmettitori, e quindi richiedono metodi sensibili per il rilevamento¹³. Ciò può essere ottenuto attraverso la rimozione di componenti della matrice a maggiore abbondanza, come i lipidi^11,14. Ulteriori considerazioni per l'analisi dei neuropeptidi devono essere fatte rispetto ai comuni flussi di lavoro di proteomica, principalmente perché la maggior parte delle analisi neuropeptidomiche omettono la digestione enzimatica. Ciò limita le opzioni software per l'analisi dei dati neuropeptidici poiché la maggior parte sono stati costruiti con algoritmi basati su dati proteomici e corrispondenze proteiche informate dal rilevamento di peptidi. Tuttavia, molti software come PEAKS¹⁵ sono più adatti all'analisi dei neuropeptidi grazie alle loro capacità di sequenziamento de novo. Diversi fattori devono essere considerati per l'analisi dei neuropeptidi a partire dal metodo di estrazione all'analisi dei dati della SM.

I protocolli qui descritti includono metodi per la preparazione del campione e l'etichettatura isotopica del dimetilico, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati dei neuropeptidi da parte di LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MSI. Attraverso i risultati rappresentativi di diversi esperimenti, viene dimostrata l'utilità e la capacità di questi metodi di identificare, quantificare e localizzare i neuropeptidi dei granchi blu, Callinectes sapidus. Per comprendere meglio il sistema nervoso, i sistemi modello sono comunemente usati. Molti organismi non hanno un genoma completamente sequenziato disponibile, il che impedisce la scoperta completa di neuropeptidi a livello peptidico. Al fine di mitigare questa sfida, è incluso un protocollo per l'identificazione di nuovi neuropeptidi e l'estrazione di trascrittomi per generare database per organismi senza informazioni complete sul genoma. Tutti i protocolli qui presentati possono essere ottimizzati per campioni di neuropeptidi di qualsiasi specie, nonché applicati per l'analisi di qualsiasi peptide endogeno.

Protocollo

Tutti i prelievi di tessuto descritti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Università del Wisconsin-Madison.

1. Analisi LC-ESI-MS dei neuropeptidi

1. Estrazione e dissalazione di neuropeptidi
   1. Prima dell'acquisizione dei tessuti, preparare metanolo acidificato (acMeOH) (90:9:1 MeOH:acqua:acido acetico) come descritto in¹⁶.
   2. Raccogliere il tessuto cerebrale dal crostaceo¹⁷ e utilizzare una pinza per posizionare immediatamente un tessuto ciascuno in un tubo da 0,6 ml contenente 20 μL di acMeOH.
      NOTA: i protocolli di dissezione dei tessuti variano notevolmente per diversi animali e diversi tipi di tessuto. Il lettore fa riferimento al protocollo¹⁷ per una descrizione dettagliata su come sezionare il tessuto cerebrale e più altri tipi di tessuto dal crostaceo. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi). I volumi descritti sono utilizzati per un singolo cervello da Callinectes sapidus. I volumi devono essere ridimensionati in base alle dimensioni del tessuto. Il tessuto può essere congelato immediatamente senza solvente, anche se questo non è raccomandato in quanto gli enzimi proteolitici endogeni non saranno inibiti e rimarranno attivi, anche se a un ritmo più lento quando sono freddi.
   3. Aggiungere 150 μL di acMeOH al campione. Impostare il tempo totale di sonicazione a 24 s, il tempo di impulso a 8 s, il tempo di pausa a 15 s e l'ampiezza al 50% su un omogeneizzatore ad ultrasuoni e omogeneizzare i campioni su ghiaccio.
      NOTA: Sono disponibili diversi sistemi di omogeneizzazione. Regolare le impostazioni e le condizioni in base al tipo di campione e all'attrezzatura.
   4. Centrifugare il campione a 4 °C a 20.000 x g per 20 min. Con una pipetta, trasferire il surnatante in un tubo e asciugarlo in un concentratore a vuoto (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a circa 35 °C.
      NOTA: I campioni essiccati possono essere conservati a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi). Il riscaldamento del concentratore di vuoto deve essere eseguito con cautela. Mentre il calore riduce il tempo di asciugatura, il campione deve essere rimosso dal concentratore immediatamente dopo che tutto il liquido è evaporato per ridurre al minimo la degradazione del peptide. Per evitare ciò, il riscaldamento può essere omesso da questo e da tutti i passaggi successivi.
   5. Per la desalinizzazione, ricostituire il campione di tessuto estratto in 20 μL di acido formico allo 0,1% (FA), vortice bene e sonicare a bagnomaria a temperatura ambiente per 1 minuto.
      NOTA: Sono disponibili diversi materiali di desalinizzazione. Regolare le soluzioni e i volumi in base all'identità della resina e alla quantità di neuropeptide. La quantità totale di peptidi può essere stimata utilizzando un saggio di quantificazione peptidica commerciale (vedere Tabella dei materiali).
   6. Applicare 0,5 μL di campione su una striscia di pH per confermare che il pH < 4. Se il pH è più alto, aggiungere aliquote di 1 μL del 10% FA fino a quando il pH < 4.
   7. Seguire il protocollo del produttore per la desalinizzazione¹⁸. Preparare una soluzione bagnante contenente 100 μL di acetonitrile al 50% (ACN), una soluzione di equilibratura contenente 100 μL di 0,1% FA, una soluzione di lavaggio contenente 100 μL di 0,1% FA e soluzioni di eluizione contenenti 20 μL di 25% ACN/0,1% FA, 20 μL di 50% ACN/0,1% FA e 20 μL di 75% ACN/0,1% FA.
   8. Ottenere una punta di desalinizzazione da 10 μL con resina C18 (vedere Tabella dei materiali).
   9. Posizionare la punta di dissalazione su una pipetta da 20 μL impostata su 15 μL. Una volta che la punta di dissalazione è bagnata, evitare il passaggio dell'aria mantenendo la pipetta depressa quando è fuori soluzione fino a quando non verrà scartata.
   10. Aspirare la punta 3x con soluzione bagnante e 3x con soluzione di equilibratura. Aspirare nel campione 10x seguito da lavare 3x in soluzione di lavaggio, scartando ogni lavaggio. Eluire aspirando 10 volte in ciascuna delle soluzioni di eluizione in ordine di aumento ACN.
       NOTA: Le frazioni di eluizione possono essere tenute separate o combinate per ulteriori analisi.
   11. Scartare la punta di dissalazione utilizzata e asciugare i neuropeptidi eluiti in un concentratore sotto vuoto (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a circa 35 °C.
       NOTA: Questo può essere conservato a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi).
2. Marcatura isotopica dei neuropeptidi nell'estratto tissutale
   NOTA: questo passaggio è facoltativo e viene utilizzato solo quando si desidera la quantificazione.
   1. Preparare la soluzione isotopica di etichettatura dimetilica 2-plex in una cappa aspirante: 1_{% CH2 OH 2} (13,5 μL di stock 37 percentuale peso/peso (wt. %) in soluzione acquosa in 486,5 μL di acqua), 1% CH₂OD₂ (25 μL di stock 20 wt. % soluzione in 475 μL di acqua) e 0,03 M di piridina borano (3,75 μL di soluzione stock 8 M in 996,25 μL di acqua).
      ATTENZIONE: La formaldeide è tossica, quindi tutte le soluzioni devono essere conservate in un cappuccio ventilato. Indossare guanti, un cappotto da laboratorio, protezione per gli occhi e calzature impermeabili. Le lenti a contatto non devono essere indossate quando si lavora con questo materiale.
      NOTA: Esistono diversi reagenti isotopici; selezionare quelli appropriati in base al tipo di campione e al numero di canali di etichettatura desiderati.
   2. Sciogliere l'estratto di neuropeptide grezzo in 10 μL di acqua e sonicare per 10 min.
   3. Aggiungere 10 μL di una diversa soluzione isotopica di formaldeide (ad esempio, CH₂OH₂, CH₂OD₂, ecc.) a ciascuna diversa condizione sperimentale da misurare quantitativamente. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
   4. Aggiungere 10 μL di 0,03 M di borano piridina a ciascuna provetta campione. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
   5. Incubare i campioni per 15 minuti a 37 °C a bagnomaria.
   6. Rimuovere i campioni dal bagno d'acqua e aggiungere 10 μL di bicarbonato di ammonio da 100 mM. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
   7. Combinare i campioni etichettati per un campione 2-plex e asciugare i neuropeptidi in un concentratore sotto vuoto (266 x g, 1 x ^10-4 Torr) a circa 35 °C.
   8. Dissalare i neuropeptidi etichettati rieperformando i passaggi 1.1.5 - 1.1.10 e conservarli fino a quando non sono pronti per l'acquisizione dei dati.
3. Acquisizione dati
   1. Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in 12 μL di 3% ACN/0,1% FA, vortice bene, sonicare a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e centrifugare brevemente a 2.000 x g. Trasferire ogni campione in flaconcini autocampionatori.
      NOTA: Regolare il volume del campione in base alla quantità di neuropeptide a una concentrazione di ~ 1 μg di peptide per μL. La quantità totale di peptide può essere stimata utilizzando un saggio di quantificazione peptidico commerciale (vedere Tabella dei materiali).
   2. Utilizzare un autocampionatore per iniettare 1 μL di campione in uno strumento nano-LC-MS/MS ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali).
   3. Utilizzare una colonna C18 a fase inversa (RP) lunga circa 15 cm (vedere Tabella dei materiali) per eseguire il campione con lo 0,1% di FA in acqua come fase mobile A e lo 0,1% di FA in ACN come fase B mobile. Eseguire i campioni con un gradiente del 3% - 95% di B ad una velocità di 300 nL / min per oltre 11 minuti.
   4. Per lo strumento MS qui utilizzato, utilizzare condizioni MS comuni di 2,00 kV per la tensione di spruzzo e 275 °C per la temperatura capillare.
   5. Acquisisci spettri MS nell'intervallo da 200 a 2.000 m/z con una risoluzione di 60.000, target AGC (Automatic Gain Control) di 1 x 10⁶ e tempo massimo di iniezione ionica (IT) di 150 ms.
   6. Selezionare i 15 ioni più intensi (intensità minima di 3,2 x 10⁴) per la frammentazione della dissociazione di collisione (HCD) ad alta energia utilizzando un'energia di collisione normalizzata di 30, una finestra di isolamento di 2,0 m/z, una risoluzione di 15.000, un target AGC di 2 x 10⁵ e un IT massimo di 250 ms.
   7. Impostare una finestra di esclusione dinamica di 30 s. Escludere gli ioni con una carica di 1 o ≥ 8 e gli ioni con stati di carica non riconosciuti.
4. Identificazione e quantificazione dei neuropeptidi
   NOTA: Sono disponibili molti software per la ricerca di database e la quantificazione dei peptidi (sia open source che commerciali). Qui verrà utilizzato PEAKS Studio (software di proteomica)¹⁵ .
   1. Eseguire la ricerca nel database utilizzando i passaggi descritti in 1.4.2 - 1.4.6.
   2. Creare un nuovo progetto e aggiungere i dati LC-MS selezionando Nessuno per l'enzima, Orbitrap per lo strumento, HCD per il frammento e acquisizione dipendente dai dati (DDA) per l'acquisizione.
      NOTA: selezionare i parametri appropriati in base ai parametri di acquisizione dati.
   3. Selezionare Identificazioni e selezionare Precursore corretto [DDA] e Solo massa.
   4. Selezionare Ricerca database e impostare una tolleranza di errore di 20,0 ppm utilizzando la massa monoisotopica per la massa del precursore e 0,02 Da per la massa dello ione del frammento, Nessuno per il tipo di enzima, Non specifico per la modalità digest, 100 per le scissioni massime mancate e le seguenti PTM variabili variabili con la variabile massima consentita PTM per peptide di 3: Amidation, Ossidazione (M), Pyro-glu da E, e Pyro-glu di Q.
   5. Selezionare il database Neuropeptide, stimare il tasso di falsa scoperta (FDR) con decoy-fusion.
      NOTA: l'errore di tolleranza di massa deve essere regolato in modo che corrisponda ai dati raccolti. Utilizzare il database appropriato per il tipo di esempio. Quando non viene selezionato alcun enzima, il parametro max mancate scissioni non influisce sulla ricerca. Tuttavia, è necessario un gran numero di scissioni mancate se il software non ha la modalità digest non specificata come opzione.
   6. Se si desidera una quantificazione senza etichetta, selezionare Quantificazione, selezionare Senza etichetta e impostare una tolleranza di errore di 20,0 ppm e una tolleranza del tempo di ritenzione di 1,0 minuti.
   7. Eseguire la quantificazione degli ioni precursori se è stato eseguito il passaggio 1.2 per l'etichettatura isotopica.
      1. Selezionare Quantificazione, selezionare Quantificazione ionica precursore, utilizzare un intervallo di tempo di ritenzione di 1,0 minuti e utilizzare una soglia FDR dell'1%.
      2. Selezionate un metodo di quantificazione preimpostato o personalizzato dal menu a discesa Seleziona metodo .
      3. Per creare un nuovo metodo personalizzato, fare clic su Finestra > configurazione > Etichetta metodo Q > Nuovo. Assegnare un nome al nuovo metodo e selezionare Quantificazione ionica precursore per Tipo di metodo. Selezionate Aggiungi riga (Add Row ) e modifica (Modification) dall'elenco Opzioni PTM (PTM Options).
      4. Aggiungere i dati LC-MS e selezionare Condizione di riferimento per essere la modifica sui neuropeptidi dalla condizione di controllo dell'esperimento.
   8. Valutare i risultati della ricerca come descritto nei passaggi 1.4.9 - 1.4.11.
   9. Filtra i risultati attraverso la scheda di riepilogo per peptidi e proteine con -10lgP ≥ 20, seleziona ≥ 1 peptide univoco e seleziona la casella etichettata Con peptidi significativi.
   10. Valutare i risultati della ricerca nel database in cui Protein.csv rappresenta le identificazioni dei neuropeptidi e Peptide.csv rappresenta le identificazioni dei frammenti di neuropeptide.
   11. Ispeziona la ricerca del database per i punteggi di proteine e peptidi, l'accuratezza della massa e la copertura della sequenza.
       NOTA: ogni software di ricerca di database utilizza algoritmi di punteggio univoci e potrebbe essere necessario valutare di conseguenza. Le identificazioni possono essere valutate ispezionando manualmente gli spettri osservati per i peptidi identificati contenenti la serie completa di ioni frammento.

2. Analisi di spotting MALDI-MS dei neuropeptidi

1. Preparazione del campione
   1. Seguire i passaggi 1.1 o 1.1 - 1.2 se si desidera la quantificazione, escluso il passaggio 1.2.8 (la desalinizzazione dopo l'etichettatura isotopica non è richiesta prima dell'analisi MALDI-MS).
   2. Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in 5 μL di FA allo 0,1%, vortice bene, sonicare a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e centrifugare brevemente a 2.000 x g.
   3. Per l'individuazione di neuropeptidi nei tessuti dei crostacei, preparare 150 mg/mL di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) in metanolo al 50% (MeOH)/0,1% FA (v/v) come matrice.
   4. Pipettare una goccia di campione da 3 μL su un film idrofobo (vedi Tabella dei materiali) e pipettare 3 μL della matrice direttamente sulla goccia del campione. Pipetta su e giù per mescolare.
   5. Pipetta 1 μL del campione 1:1: miscela a matrice in un pozzo della piastra target in acciaio inossidabile MALDI. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire bene ogni miscela ai bordi del campione. Il campione deve toccare i bordi dell'incisione del pozzo per facilitare una distribuzione uniforme (Figura 4A).
   6. Spot 1 μL di miscela calibrante:matrice 1:1 (miscela di calibrazione commerciale o personalizzata, materiali polimerici (ad esempio, fosforo rosso disciolto in MeOH) o ioni cluster di matrice comuni)¹² in un pozzo vicino al campione.
      NOTA: il fosforo rosso non ha bisogno di essere miscelato con la matrice prima di individuare.
2. Acquisizione dati
   1. Inserire la piastra bersaglio contenente punti campione essiccati nello strumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Per la matrice DHB, impostare la potenza del laser su 95%, selezionare Guadagno rilevatore ottimale automatico e Smart - Modalità di movimento del portatore del campione completo. Acquisisci spettri MS nell'intervallo da 200 a 3200 m/z e aggiungi più spettri da ogni punto insieme per aumentare il rapporto segnale-rumore neuropeptide.
      NOTA: ottimizzare la percentuale di potenza del laser, il guadagno del rilevatore e selezionare la modalità di movimento del vettore del campione appropriata in modo che ogni acquisizione copra all'incirca l'intero punto e le acquisizioni successive non vadano alle posizioni precedenti.
   3. Calibrare lo strumento.
      NOTA: Regolare l'intervallo di massa per includere l'intervallo di neuropeptidi desiderato.
3. Analisi dei dati
   1. Aprire il file MALDI-MS nel software di analisi dei dati (vedere Tabella dei materiali) e fare clic su Sottrazione di base per il software utilizzato qui.
   2. Eseguire il prelievo dei picchi facendo clic su Trova elenco di massa. Se ci sono troppo pochi picchi, modifica manualmente l'elenco di massa selezionando Modifica elenco di massa e fai clic sui picchi nello spettro per aggiungerli all'elenco di massa.
   3. Eseguire una corrispondenza di massa accurata confrontando l'elenco di massa con il database di neuropeptidi contenente valori [M + H] ⁺ m / z (± errore di 200 ppm). 
      NOTA: anche gli addotti di sale comuni, come [M + K] ⁺, [M + Na] ⁺ e [M + NH₄] ⁺ - dovrebbero essere inclusi nell'elenco di destinazione di corrispondenza di massa accurata.
   4. Per verificare i picchi identificati, generare un elenco di m/z di interesse ed eseguire esperimenti MS/MS.

3. Analisi di imaging MALDI-MS di neuropeptidi

1. Preparazione del campione
   NOTA: le fasi di incorporamento e sezionamento non sono necessarie per i tessuti troppo sottili per essere sezionati.
   1. Riempire mezza tazza di criostato con gelatina (37 °C, 100 mg/mL in acqua deionizzata) e lasciarla solidificare a temperatura ambiente. Tenere al caldo la gelatina liquida avanzata a bagnomaria a 37 °C.
   2. Raccogliere il tessuto neuronale desiderato dall'animale e utilizzare una pinza per immergere immediatamente il tessuto in un tubo da 0,6 ml contenente acqua deionizzata per 1 s.
      NOTA: Fare riferimento al Passo 1.1.2 NOTA per la dissezione del tessuto neuronale.
   3. Posizionare il tessuto sopra la gelatina solida e riempire il resto della tazza di criostato con gelatina liquida. Utilizzare una pinza per posizionare il tessuto.
   4. Posizionare la tazza criostato su una superficie piana e congelare con ghiaccio secco.
      NOTA: Conservare i campioni a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi).
   5. Per la preparazione del sezionamento, separare il campione incorporato nella gelatina dallo stampo criostato tagliando via lo stampo.
   6. Montare il tessuto incorporato su un mandrino criostato pipettando una goccia da 1 mL di acqua deionizzata sul mandrino e premendo immediatamente il tessuto incorporato sulla goccia.
   7. Una volta congelato, pipettare più acqua deionizzata intorno al tessuto per fissarlo ulteriormente al mandrino. Eseguire questi passaggi all'interno della scatola criostata (vedi Tabella dei materiali) impostata a -20 °C.
   8. Sezionare il tessuto a uno spessore approssimativo di una cella (8-20 μm a seconda del tipo di campione) e scongelare montare ogni sezione su un vetrino rivestito di ossido di indio stagno (ITO) posizionando un lato del vetrino vicino alla sezione e posizionando un dito sull'altro lato del vetrino per riscaldare lentamente il vetro e consentire alla sezione di aderire al vetrino.
      NOTA: le sezioni di tessuto possono anche essere montate sul disgelo raccogliendo un bordo della gelatina con una pinzetta (refrigerata a -20 °C), posizionandola sul vetrino rivestito in ITO e posizionando un dito sull'altro lato del vetrino per riscaldare lentamente il vetro e consentire alla sezione di aderire al vetrino.
   9. Individuare il campione da utilizzare come calibrante (vedere il punto 2.1.6 per le opzioni di calibro) disegnando un piccolo cerchio vicino alla sezione del tessuto usando una penna idrofobica e individuando il calibrante all'interno del cerchio.
   10. Contrassegnare ogni angolo della diapositiva con una penna whiteout con una piccola forma contenente spigoli vivi (ad esempio, x) da utilizzare come punti di insegnamento.
   11. Posizionare il vetrino nella piastra adattatore per diapositive MALDI ed eseguire una scansione ottica dell'immagine ad alta risoluzione (≥2400 DPI) utilizzando uno scanner.
   12. Matrice di spruzzatura sulla sezione del tessuto utilizzando uno spruzzatore automatico (vedere Tabella dei materiali per i dettagli e le istruzioni dello spruzzatore).
   13. Per l'MSI dei neuropeptidi nei tessuti dei crostacei utilizzare 40 mg/mL DHB in 50% metanolo/0,1% FA (v/v) come matrice, impostare la temperatura dell'ugello a 80 °C, la velocità a 1.250 mm/min, la portata a 0,1 ml/min, il numero di passaggi a 12 e 30 s tra ogni passaggio per lo spruzzatore automatico.
2. Acquisizione dati
   1. Inserire la piastra bersaglio completamente essiccata contenente sezioni di tessuto montate sul disgelo che sono state spruzzate con la matrice.
   2. Impostare i parametri del file di acquisizione dell'imaging MS in modo che il diametro del laser sia inferiore alla dimensione del gradino raster.
   3. Caricare l'immagine ottica scansionata e calibrare la piastra campione utilizzando i punti di insegnamento x. Definire le aree tissutali di interesse da misurare leggermente più grandi della sezione tissutale effettiva per includere anche le aree contenenti solo matrice.
   4. Calibrare lo strumento e acquisire spettri nell'intervallo 200 - 3200 m/z. Regolare l'intervallo di massa per includere l'intervallo di neuropeptidi desiderato.
3. Analisi dei dati
   1. Per elaborare i dati, importare il set di dati di imaging MS nel software desiderato, selezionare un algoritmo di rimozione di base e normalizzare i dati utilizzando il conteggio totale degli ioni.
      NOTA: la selezione di diversi algoritmi di normalizzazione, ad esempio la mediana, il valore RMS (Root Mean Square) o l'intensità di un valore m/z di riferimento, probabilmente modificherà la distribuzione spaziale di molti valori m/z . Scegli l'algoritmo di normalizzazione più adatto per gli analiti desiderati.
   2. Per generare un'immagine per ogni valore m/z da un elenco di picchi teorici, carica un file csv (comma-separated values) contenente neuropeptide [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+NH₄]⁺, ecc. Per ottenere i valori m/z , fare clic su File > Importa > elenco di picchi. Assegna un nome all'elenco dei picchi.
   3. Per stimare la soglia di errore ppm appropriata, identificare manualmente un picco neuropeptide nello spettro MS e confrontarlo con la massa teorica del neuropeptide. Calcolare l'errore ppm e fare clic su Proprietà file > file > larghezza intervallo e input ppm errore.
   4. Selezionare l'elenco dei picchi dal menu a discesa e fare clic su Crea immagini m/z per ogni intervallo dell'elenco dei picchi.
   5. Salva ogni immagine m/z facendo clic su Salva screenshot di ogni immagine m/z.
      NOTA: L'identificazione putativa del neuropeptide può essere eseguita identificando immagini m/z in cui il segnale analita è localizzato solo all'interno del tessuto e non nella matrice circostante.
   6. Per verificare l'identità del picco, generare un elenco di m/z di interesse ed eseguire esperimenti MS/MS.

4. Scoprire nuovi neuropeptidi putativi usando il sequenziamento de novo

1. Eseguire i passaggi da 1.4.2 a 1.4.5.
2. Esporta de novo solo peptidi.csv dal software PEAKS con un punteggio medio di fiducia locale (ALC) di ≥ 75.
   NOTA: Ci sono molti software disponibili per eseguire il sequenziamento de novo , ognuno con i propri algoritmi di punteggio e dovrebbe essere valutato di conseguenza.
3. Cerca nell'elenco dei peptidi motivi di sequenza noti indicativi di neuropeptidi appartenenti a specifiche famiglie di neuropeptidi¹⁹.
   NOTA: Mentre i motivi sono comunemente ben conservati tra le specie, i motivi cercati dovrebbero essere selezionati tenendo conto dell'organismo campione.

5. Estrazione del trascrittoma per sequenze neuropeptidiche previste

NOTA: questo passaggio è facoltativo e viene utilizzato solo per aggiungere a un database neuropeptide esistente o creare un nuovo database neuropeptide.

1. Scegli una sequenza di aminoacidi preproormone nota di interesse e usa tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
   _LOC=blasthome) per cercare la sequenza preproormone di query su database tra cui nr/nt, Refseq_genomes, EST e TSA.
   NOTA: per eseguire ricerche nelle sequenze di query nel database delle proteine, utilizzare BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
   _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
   _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
   1. Selezionare l'organismo di destinazione (codice fiscale) e modificare i parametri dell'algoritmo Expect Threshold su 1000 per includere allineamenti a punteggio basso.
   2. Esegui il programma BLAST e quindi controlla i risultati per punteggi di omologia elevati tra sequenze di query e soggetti che producono allineamenti significativi. Salvare il file FASTA contenente la sequenza nucleotidica.
      NOTA: Se ci sono diverse sequenze di soggetti con punteggi di omologia simili, eseguire un allineamento MAFFT per restringere le sequenze putative^20,21.
2. Tradurre la sequenza nucleotidica preproormone in sequenze peptidiche preproormone utilizzando lo strumento Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Per C. sapidus, selezionare Mitocondriale invertebrato per il codice genetico.
3. Verificare la presenza della sequenza peptidica del segnale e dei siti di scissione del proormone nelle sequenze peptidiche utilizzando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
   NOTA: l'omologia agli schemi di elaborazione preproormone noti può anche essere utilizzata per identificare i siti di scissione del proormone. Possibili modifiche post-traduzionali per i peptidi di segnale possono essere previste se lo si desidera. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) può essere utilizzato per prevedere lo stato di solfatazione dei residui di tirosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) può essere utilizzato per prevedere la connettività del legame disolfuro.

Risultati

Il flusso di lavoro per la preparazione dei campioni e l'analisi ms è illustrato nella Figura 1. Dopo la dissezione del tessuto neuronale, vengono eseguite l'omogeneizzazione, l'estrazione e la desalinizzazione per purificare i campioni di neuropeptide. Se si desidera una quantificazione isotopica basata sull'etichetta, i campioni vengono nuovamente etichettati e dissalati. Il campione risultante viene analizzato attraverso LC-MS/MS per l'identificazione e la quantificazione dei neuropeptid...

Discussione

L'identificazione accurata, la quantificazione e la localizzazione di neuropeptidi e peptidi endogeni presenti nel sistema nervoso sono cruciali per comprendere la loro funzione^23,24. La spettrometria di massa è una tecnica potente che può consentire di realizzare tutto questo, anche in organismi senza un genoma completamente sequenziato. Viene dimostrata la capacità di questo protocollo di rilevare, quantificare e localizzare neuropeptidi da tessuti raccolti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix	Supelco	39319
Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A955-500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Borane pyridine	Sigma-Aldrich	179752
Bruker peptide calibration mix	Bruker Daltonics	NC9846988
Capillary	Polymicro	1068150019	to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup	Sigma-Aldrich	E6032	any cup or mold should work
Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30108434
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Formaldehyde - D2	Sigma-Aldrich	492620
Formic acid Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A117-50
Gelatin	Difco	214340	place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen	Vector Labs	15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials	Thermo	TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade	Fisher Chemical	A456-500
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Hydrophobic film
pH-Indicator strips	Supelco	109450
Red phosphorus clusters	Sigma-Aldrich	343242
Reversed phase C18 material	Waters	186002350	manually packed into nanoflow column
Wite-out pen	BIC	150810
ZipTip	Millipore	Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5	HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R	Eppendorf	05-401-205
Cryostat- HM 550	Thermo Fisher Scientific	956564A
Desiccant	Drierite	2088701
Forceps	WPI	501764
MALDI stainless steel target plate	Bruker Daltonics	8280781
Pipet-Lite XLS	Rainin	17014391	200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100	Savant	SVC-100D
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	2510R-MTH	for sonication
Ultrasonic homogenizer	Fisher Scientific	FB120110	FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer	Corning	6775
Water bath (37C) - Isotemp 110	Fisher Scientific	15-460-10
Data Analysis Software
Expasy	https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis	Bruker Daltonics
FlexControl	Bruker Daltonics
FlexImaging	Bruker Daltonics
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab	https://scils.de/
SignalP 5.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome