Visualización de cambios en el circuito Neuron-Glia con la técnica de imágenes de calcio

Resumen

La imagen de calcio celular es una metodología versátil para estudiar la señalización dinámica de células individuales, en poblaciones mixtas en cultivo o incluso en animales despiertos, basada en la expresión de canales / receptores permeables al calcio que dan firmas funcionales únicas.

Resumen

Aquí, informamos sobre modelos selectivos in vitro de circuitos basados en glía (astrocitos, oligodendrocitos y microglía) y / o neuronas de tejidos periféricos (ganglios de la raíz dorsal) y centrales (corteza, zona subventricular, organoide) que se estudian dinámicamente en términos de cambios de calcio. El modelo elegido para ilustrar los resultados es la retina, un tejido simple con interacciones celulares complejas. El calcio es un mensajero universal involucrado en la mayoría de las funciones celulares importantes. Explicamos en un protocolo paso a paso cómo se pueden preparar y evaluar las células neuron-gliales de la retina en cultivo, imaginando cambios de calcio. En este modelo, diferenciamos las neuronas de la glía en función de su respuesta selectiva a KCl y ATP. Los receptores y canales permeables al calcio se expresan selectivamente en diferentes compartimentos. Para analizar las respuestas al calcio, utilizamos matrices fluorescentes ratiométricas como Fura-2. Esta sonda cuantifica la concentración libre de ^Ca2+ en base a formas libres de ^Ca2+ y Unidas a ^Ca2+, presentando dos picos diferentes, basados en la intensidad de fluorescencia percibida en dos longitudes de onda.

Introducción

Debido a las propiedades universales del calcio como segundo mensajero, este ion está involucrado en un gran número de actividades de señalización: transcripción de genes, nacimiento y muerte, proliferación, migración y diferenciación, transmisión sináptica y plasticidad. Por lo tanto, un método capaz de rastrear la dinámica de activación del calcio con fidelidad y agilidad proporcionaría una forma de observar respuestas espacio-temporales únicas. Tal método es la técnica de imágenes de calcio celular, que correlaciona los datos funcionales de los cambios de calcio con fenotipos celulares específicos en función de sus distintas respuestas.

Las sondas de ^Ca2+ se desarrollaron por primera vez en la década de 1980, con mejoras posteriores que permitieron que estas moléculas se utilizaran en ensayos de células ^vivas1. Como indicador químico, Fura-2 se considera el estándar para las mediciones cuantitativas de [^Ca2+]_i. El éster de acetoximetil (AM) de este indicador (es decir, Fura-2 AM) impregna fácilmente la membrana celular y puede alcanzar concentraciones intracelulares 20 veces mayores que la dilución de incubación (por ejemplo, [5 μM]_o/[100 μM]_i). Otra ventaja de Fura-2 es que tiene una buena resistencia al fotoblanqueo; por lo tanto, la obtención de imágenes de este indicador durante períodos de tiempo más largos no afectará en gran medida sus capacidades de fluorescencia. Finalmente, Fura-2 es sensible a una amplia gama de niveles de calcio, desde ~100 nM hasta ~100 μM, y tiene un _Kd de ~145 nM, que es comparable al resto [^Ca2+]_i2. Más tarde, las imágenes de calcio celular se desarrollaron con mejores microscopios fluorescentes y métodos de computación, junto con sondas ratiométricas que no se ven afectadas por la carga de colorante.

Cada célula expresa diferentes dispositivos de calcio (bombas, transportadores, receptores y canales) que contribuyen a la respuesta final como una firma particular. El consejo importante es encontrar respuestas selectivas de diferentes tipos de células correlacionadas con su expresión fenotípica. En consecuencia, hay al menos dos receptores diferentes que operan a través de cambios de calcio: receptores ionotrópicos que impregnan ^{Ca2 +} en un modo rápido y receptores metabotrópicos lentos acoplados a vías de señalización y existencias intracelulares que liberan ^{Ca2 +} activado por segundos mensajeros, como el trifosfato de inositol y el ADP-ribosa ^cíclico3.

Por ejemplo, las células progenitoras expresan nestina en la retina inmadura y muestran receptores _GABAA despolarizados por GABA (o muscimol)⁴. Esto sucede debido al gradiente electroquímico de Cl^- con altos niveles intracelulares ^de Cl−; a medida que el tejido se desarrolla, los transportadores de KCC2 cambian de excitación en progenitores a inhibición en neuronas GABAérgicas ^maduras5. Por otro lado, las células madre que expresan sox-2 en la zona subventricular inmadura (SVZ) de roedores postnatales también presentan receptores metabotrópicos H1 activados por histamina aumentando El ^Ca2+ de forma ^lenta6. Un segundo receptor metabotrópico de la familia de receptores-1 activados por proteasa (PAR-1), activado por trombina y aguas abajo a G(q/11) y fosfolipasa C (PLC), produce cambios lentos de ^Ca2+ en oligodendrocitos (que expresan O4 y PLP) generados a partir de células madre neurales SVZ multipotentes7.

En general, las neuronas expresan canales de calcio dependientes del voltaje, así como los principales receptores de neurotransmisores permeables a ^Ca2+, como los receptores glutamatérgicos (AMPA, NMDA, kainato) y nicotínicos periféricos y centrales. El cloruro de potasio se suele utilizar como agente despolarizante para activar neuronas periféricas, como las neuronas ganglionares de la raíz ^dorsal8 o neuronas centrales, a partir de la zona ^{subventricular9} o ^retina10. Por otro lado, el ATP es reconocido como el principal gliotransmisor (además de la D-serina), que activa los miembros ^P2X permeables selectivos de Ca2+, como P2X7 y P2X4. Ambos receptores presentan corrientes de ^Ca2+ equivalentes, similares a las mostradas por los receptores NMDA reconocidos como las mayores corrientes de ^Ca2+ activadas por los ^{transmisores11}. Los receptores P2X7 están altamente expresados en microglía, pero a menor densidad en astrocitos y oligodendrocitos, teniendo un papel en la liberación de citoquinas proinflamatorias12. Los receptores P2X7 también se expresan en las células de ^Schwann13 y en la glía de Müller en la ^retina14,15.

Se sabe que la retina muestra casi todos los transmisores que se ven en el cerebro. Por ejemplo, el eje vertical (fotorreceptores, células ganglionares bipolares y retinianas) es principalmente glutamatérgico, con receptores AMPA o kainato permeables al calcio expresados en células OFF-bipolares y mgluR6 expresados en células ON-bipolares16. Curiosamente, los tres receptores también se encuentran en la glía de Müller, que están acoplados a las vías de calcio e inositol ^{trifosfato17,18}. El eje inhibitorio horizontal, hecho por células horizontales y amacrinas, secreta no sólo GABA, sino también dopamina, acetilcolina, y otros neurotransmisores clásicos. Las células amacrinas son los principales tipos de células que se encuentran en los cultivos de retina aviar, mostrando varios tipos de canales operados por calcio, como canales de calcio glutamatérgicos, purinérgicos, nicotínicos y dependientes del voltaje. Por esta razón, este es un excelente modelo para evaluar diferentes propiedades de los cambios de calcio entre las neuronas y la glía.

Por lo tanto, la combinación de diferentes receptores y canales sumados a marcadores fenotípicos selectivos durante el desarrollo con distintos patrones de respuesta agonista permite firmas únicas en el tallo, progenitor, neurona, astrocito, oligodendrocitos y microglia que operan a través de dispositivos de señalización selectiva.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo siguiendo las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, siguiendo los "Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio" (NIH, Bethesda, USA); número de permiso IBCCF-035 para huevos de gallina white leghorn fertilizados.

1. Preparación de soluciones

1. Preparar solución krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM _MgCl2, 2.5 mM _CaCl2, 6 mM glucosa, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
2. Preparar tampón salino (solución libre de ^{Ca2+ y Mg2+} - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L _Na2HPO4, 0,610 g/L _KH2PO4, 21,95 g/L glucosa y 7,90 g/L NaHCO3.
3. Preparar la solución de incubación (con Fura-2 en solución krebs:) 5 μM fura-2-acetoximetil éster (Fura-2), albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos al 0,1% (BSA) y poloxámero 407 al 0,02%.
4. Para la población mixta o el cultivo de glía, prepare DMEM / F12 con suero fetal de terneros (FCS) al 10% y 40 mg / L de gentamicina como medio.
5. Para el cultivo enriquecido con neuronas, prepare DMEM / F12 con 1% FCS, suplemento de cultivo de células neuronales, 40 mg / L y gentamicina como medio.

2. Disección de la retina y preparación del cultivo celular

1. Abra el óvulo de embrión de pollito (E8) de 8 días de edad donde se encuentra la célula de aire.
2. Retire el contenido del huevo a una placa de Petri y proceda con la eutanasia embrionaria por decapitación con un par de pinzas.
3. Lleve la cabeza a una placa de Petri limpia y vierta un poco de solución libre de calcio y magnesio (CMF) para lavarla.
4. Retire los ojos, teniendo cuidado de no dañarlos en el proceso.
   NOTA: Trate de evitar cortar o triturar las capas del ojo antes de retirarlo de la cavidad ocular.
5. Lleve los ojos a una placa de Petri limpia que contenga CMF.
6. Comience la disección ocular quitando el cristalino.
7. Realice 3 o 4 cortes longitudinales en el ojo, comenzando por el orificio dejado por la lente. Haga cortes tirando de las pinzas, sosteniendo la esclerótica del ojo en direcciones opuestas.
8. Retire el cuerpo vítreo transparente con precaución, asegurándose de que la retina no esté unida a él.
9. Separe la retina del epitelio pigmentado y elimine cualquier tejido restante.
10. Cortar la retina clara en trozos pequeños.
11. Transfiera la retina a otro receptor y centrífique brevemente (~ 1,800 x g durante 1 min) para eliminar el CMF.
12. Disociar enzimáticamente la retina con 1 mL de tripsina al 0,25%, incubándola a 37 °C durante 10 min.
13. Detenga la reacción agregando 1 ml de medio que contenga 10% de FCS.
14. Lavar la retina 2 o 3 veces con medio. El lavado consiste en ciclos de adición de medio y extracción por centrifugación (~1.800 x g durante 1 min).
15. Agregue 2 ml de medio completo por retina y disocie suavemente mecánicamente la retina pipeteándola hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Aquí, los investigadores pueden elegir qué tipo de cultivo se preparará. Para un cultivo neuronal enriquecido, use DMEM-F12 + suplemento neuronal + 1% FCS + antibióticos. Para la población mixta o la glía purificada, use DMEM-F12 + 10% FCS + antibióticos.
16. Cuente las células y diluya a la densidad deseada.
    NOTA: Idealmente, este debería ser un cultivo de baja densidad con ~ 2 x ¹⁰⁶ células o menos.
17. Añadir 50 μL de la suspensión celular a cada funda.
18. Tratamiento de coverslip
    1. Incubar los recubiertos durante al menos 1 h (idealmente durante la noche) en 1 ml de 10-50 μg/ml de poli-L-lisina en agua purificada esterilizada a 37 °C.
    2. Retire la solución de poli-L-lisina y lave las fundas con agua purificada esterilizada 2-3 veces.
    3. Deje que las fundas se sequen en un armario de seguridad con las luces UV encendidas. En este punto, guárdelos en un recipiente sellado a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    4. Paso opcional: Para cultivos enriquecidos con neuronas, agregue 50 μL de laminina de 10-20 ng / ml en PBS o medio a cada funda durante 2 h a 37 ° C. Después de la incubación, retire el exceso de solución de laminina y el estuche estará listo para usar.
19. Incubar las células a 37 °C a una atmósfera de _CO2 al 5% hasta que se adhieran al vidrio. Esto debería tomar alrededor de 1-2 h.
20. Agregue 1 ml de medio completo a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora hasta el día del experimento. Si es necesario, cambie el medio cada 2-3 días.

3. Células de carga con Fura-2 AM

1. Reconstituir un vial de 50 μg de Fura-2 AM con 50 μL de DMSO.
2. Para preparar la solución de Trabajo de Fura-2 AM, agregue 3 μL de Poloxamer 407 al 10%, 7.5 μL de Fura-2 AM en DMSO y solución de Krebs q.s.p. a 1.5 mL.
3. Sonicar la mezcla durante 7 min en un baño de agua.
4. Lave el coverslip con el cultivo celular 3x con solución de Krebs antes de incubarlo en Fura-2.
5. Incubar a 37 °C y 5% de _CO2 durante 30 min.
6. Después de la incubación, lávelo 3 veces más y transfiéralo a otro recipiente que contenga Krebs y esté protegido de la luz.
   NOTA: La solución Fura-2 AM de trabajo permanece estable durante 24 horas si está protegida de la luz.

4. Imágenes de calcio de las células

1. Antes de cada ejecución, agregue silicio al soporte de la cubierta y a la cámara para evitar fugas durante el experimento.
2. Lave la parte inferior de la funda con agua destilada para evitar la cristalización de sal en la lente del microscopio.
3. Coloque el cubrehojas en el soporte, presionando suavemente los bordes.
4. Conecte el soporte y la cámara al microscopio y comience a perfundir las células con la solución de Krebs.
   NOTA: La perfusión celular durante los experimentos de imágenes de calcio de una sola célula se calibra a una velocidad de flujo de 0.5 ml / min, y se necesitan de 8 a 10 s para que la solución de la plataforma se reemplace por completo.
5. Eche un vistazo a las celdas y seleccione un campo de visión apropiado.
6. Seleccionar manualmente los cuerpos celulares en función de su morfología distinta.
7. Antes de aplicar cualquier estímulo, espere la estabilización basal. Cada estímulo debe tomar unos 30 segundos.
   NOTA: Prepare todas las soluciones inmediatamente antes de cada experimento.
8. Evalúe las variaciones en [^Ca2+]_i cuantificando la relación de la fluorescencia emitida a 510 nm después de la excitación alternativa (750 milisegundos) a 340 y 380 nm.
9. Procesar los valores adquiridos utilizando un software de análisis de fluorescencia.
10. Expresar resultados experimentales en una tabla donde cada fila representa una celda individual y cada línea un punto de tiempo.

5. Tratamiento de datos

1. Usando un software de hoja de cálculo, trace la variación de los valores de la relación de fluorescencia Fura-2 de celdas singulares por separado o de todas ellas al mismo tiempo.
2. Para cuantificar el número de células reactivas al estímulo determinado, establezca un límite de aumento del 30% en los niveles basales de calcio.

Resultados

Aquí, utilizamos células de la retina en cultivo de pollitos embrionarios del día 8 para investigar cómo las neuronas y la glía señalan en términos de cambios de calcio. Los cultivos se prepararon esencialmente como se ^{describe15,19} como células mixtas neuron-gliales (a una densidad de ≥ 1 x ¹⁰⁶ célula/plato) en una etapa de 7 días in vitro (Figura 1A). Alternativamente, células neuronales enriquecidas prepara...

Discusión

Hemos utilizado el tejido de la retina para demostrar que las respuestas de calcio mediadas por KCl o ATP están claramente compartimentadas en respuestas neuronales y gliales, respectivamente (Figura 1). Aunque algunos datos de la literatura implican que los receptores P2X7 se expresan en las neuronas, que regulan la actividad neuronal y la liberación de neurotransmisores sinápticos20, otros autores cuestionan la existencia de receptores neuronales P2X7. De hecho, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mm coverslip	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Cell suport
510 nm long-pass filter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital camera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Cell culture medium
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence Microscope	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molecular Probes	F1221	Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate	Calbiochem	1405-41-0	antibiotics
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 apparatus	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Help cell adhesion
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nonionic, surfactant
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056	Dissociation enzyme