Визуализация сдвигов на схеме Нейрон-Глия с помощью метода визуализации кальция

Резюме

Клеточная кальциевая визуализация является универсальной методологией для изучения динамической сигнализации отдельных клеток, на смешанных популяциях в культуре или даже на пробужденных животных, основанной на экспрессии кальциевых проницаемых каналов / рецепторов, которая дает уникальные функциональные сигнатуры.

Аннотация

Здесь мы сообщаем о селективных моделях in vitro цепей на основе глии (астроциты, олигодендроциты и микроглия) и / или нейронов из периферических (ганглии дорсальных корней) и центральных тканей (кора, субвентрикулярная зона, органоид), которые динамически изучаются с точки зрения сдвигов кальция. Модель, выбранная для иллюстрации результатов, представляет собой сетчатку, простую ткань со сложными клеточными взаимодействиями. Кальций является универсальным мессенджером, участвующим в большинстве важных клеточных ролей. Мы объясняем в пошаговом протоколе, как нейронно-глиальные клетки сетчатки в культуре могут быть подготовлены и оценены, предвидя сдвиги кальция. В этой модели мы дифференцируем нейроны от глии на основе их селективного ответа на KCl и ATP. Кальциевые проницаемые рецепторы и каналы избирательно экспрессируются в разных компартментах. Для анализа реакции кальция мы используем ратиометрические флуоресцентные матрицы, такие как Fura-2. Этот зонд количественно оценивает концентрацию свободного ^{Ca2 +} на основе ^{Ca2 +} свободных и ^{Ca2 +} связанных форм, представляя два разных пика, основанных на интенсивности флуоресценции, воспринимаемой на двух длинах волн.

Введение

Благодаря универсальным свойствам кальция как второго мессенджера, этот ион участвует в огромном количестве сигнальных активностей: транскрипции генов, рождении и смерти, пролиферации, миграции и дифференцировке, синаптической передаче и пластичности. Следовательно, метод, способный отслеживать динамику активации кальция с точностью и ловкостью, обеспечит способ наблюдения уникальных пространственно-временных реакций. Таким методом является метод визуализации клеточного кальция, который коррелирует функциональные данные сдвигов кальция с конкретными фенотипами клеток на основе их различных реакций.

Зонды ^Ca2+ были впервые разработаны в 1980-х годах, а более поздние улучшения позволили использовать эти молекулы в анализах живых ^{клеток1}. В качестве химического показателя Fura-2 считается стандартом для количественных измерений [^Ca2+]_i. Эфир ацетоксиметила (AM) этого показателя (т.е. Fura-2 AM) легко проникает в клеточную мембрану и может достигать внутриклеточных концентраций, в 20 раз превышающих инкубационное разбавление (например, [5 мкМ]_o/[100 мкМ]_i). Еще одним преимуществом Fura-2 является то, что он обладает хорошей устойчивостью к фотоотбеливанию; таким образом, визуализация этого индикатора в течение более длительных периодов времени не будет сильно влиять на его флуоресцентные возможности. Наконец, Fura-2 чувствителен к широкому диапазону уровней кальция, от ~100 нМ до ~100 мкМ, и имеет _Kd ~145 нМ, что сопоставимо с покоящимся [^Ca2+]_i2. Позже была разработана визуализация кальция клеток с использованием лучших флуоресцентных микроскопов и методов вычислений вместе с ратиометрическими зондами, на которые не влияет нагрузка красителя.

Каждая клетка экспрессирует различные устройства кальция (насосы, транспортеры, рецепторы и каналы), которые способствуют конечному ответу в качестве определенной сигнатуры. Важным советом является поиск селективных реакций различных типов клеток, коррелирующих с их фенотипической экспрессией. Соответственно, существует, по крайней мере, два различных рецептора, которые действуют через сдвиги кальция: ионотропные рецепторы, которые пронизывают ^{Ca2 +} в быстром режиме, и медленные метаботропные рецепторы, связанные с сигнальными путями и внутриклеточными запасами, которые высвобождают ^{Ca2 +}, активируемые вторыми мессенджерами, такими как инозитолтрифосфат и циклическая ADP-рибоза3.

Например, клетки-предшественники экспрессируют нестин в незрелой сетчатке и показывают рецепторы _ГАМК, деполяризованные ГАМК (или мусцимолом)⁴. Это происходит из-за ^{Cl-электрохимического} градиента с высоким внутриклеточным уровнем Cl⁻; по мере развития ткани транспортеры KCC2 переключаются с возбуждения на предшественниках на ингибирование на зрелых ГАМКергических ^{нейронах5}. С другой стороны, стволовые клетки, которые экспрессируют sox-2 в незрелой субвентрикулярной зоне (SVZ) постнатальных грызунов, также представляют метаботропные рецепторы H1, активированные гистамином, медленно увеличивающим ^Ca2+.6. Второй метаботропный рецептор из семейства протеазно-активированных рецепторов-1 (PAR-1), активированный тромбином и нисходящий к G(q/11) и фосфолипазе C (PLC), дает медленные сдвиги ^Ca2+ в олигодендроцитах (которые экспрессируют O4 и PLP), генерируемых мультипотентными нервными стволовыми клетками ^SVZ7.

В целом, нейроны экспрессируют зависимые от напряжения кальциевые каналы, а также основные рецепторы нейротрансмиттеров, проницаемые для ^Ca2+, как глутаматергические (AMPA, NMDA, kainate) и периферические и центральные никотиновые рецепторы. Хлорид калия обычно используется в качестве деполяризующего агента для активации периферических нейронов, как ганглиозные нейроны дорсального ^корня8 или центральные нейроны, как из субвентрикулярной ^зоны9 или сетчатки10. С другой стороны, АТФ признан основным глиотрансмиттером (в дополнение к D-серину), который активирует селективные ^Ca2+ проницаемые члены P2X, такие как P2X7 и P2X4. Оба рецептора представляют эквивалентные токи ^Ca2+, аналогичные тем, которые показаны NMDA-рецепторами, признанными крупнейшими токами ^Ca2+, активируемыми передатчиками11. Рецепторы P2X7 высоко экспрессируются на микроглии, но при более низкой плотности на астроцитах и олигодендроцитах, играя роль в высвобождении провоспалительных ^{цитокинов12}. Рецепторы P2X7 также экспрессируются на клетках ^{Шванна13} и глии Мюллера в сетчатке14,15.

Известно, что сетчатка показывает почти все передатчики, наблюдаемые в мозге. Например, вертикальная ось (фоторецепторы, биполярные и ганглиозные клетки сетчатки) в основном глутаматергическая, с кальциепроницаемыми ampA или кайнатными рецепторами, экспрессируемыми в OFF-биполярных клетках и mgluR6, экспрессируемыми в ON-биполярных ^{клетках16}. Любопытно, что все три рецептора также обнаружены в глии Мюллера, которые связаны с путями кальция и инозитолтрифосфата17,18. Горизонтальная тормозная ось, состоящая из горизонтальных и амакриновых клеток, секретирует не только ГАМК, но и дофамин, ацетилхолин и другие классические нейромедиаторы. Амакриновые клетки являются основными типами клеток, обнаруженных в культурах птичьей сетчатки, показывая несколько типов кальциевых каналов, таких как глутаматергические, пуринергические, никотиновые и зависимые от напряжения кальциевые каналы. По этой причине это отличная модель для оценки различных свойств сдвигов кальция между нейронами и глией.

Таким образом, комбинация различных рецепторов и каналов, суммируемых с селективными фенотипическими маркерами во время развития с различными паттернами ответа агониста, позволяет создавать уникальные сигнатуры в стволе, предшественнике, нейроне, астроците, олигодендроците и микроглии, которые работают через селективные сигнальные устройства.

протокол

Все эксперименты с участием животных были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Федерального университета Рио-де-Жанейро, в соответствии с «Принципами ухода за лабораторными животными» (NIH, Bethesda, США); номер разрешения IBCCF-035 на оплодотворенные куриные яйца White Leghorn.

1. Приготовление растворов

1. Готовят раствор Кребса: (132 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1,4 мМ _MgCl2, 2,5 мМ _CaCl2, 6 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, рН 7,4, 373 мОсм).
2. Приготовьте физиологический буфер (свободный раствор ^Ca2+ и ^Mg2+ - CMF): 76,55 г/л NaCl, 3,05 г/л KCl, 1,65 г/л _Na2HPO4, 0,610 г/л _KH2PO4, 21,95 г/л глюкозы и 7,90 г/л NaHCO3.
3. Приготовить инкубационный раствор (с Фура-2 в растворе Кребса:) 5 мкМ Fura-2-ацетоксиметиловый эфир (Fura-2), 0,1% без жирных кислот бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,02% полоксамера 407.
4. Для смешанной популяции или культуры глии готовят DMEM/F12 с 10% сывороткой для телят плода (FCS) и 40 мг/л гентамицина в качестве среды.
5. Для культуры, обогащенной нейронами, готовят DMEM/F12 с 1% FCS, добавкой культуры нейрональных клеток, 40 мг/л и гентамицином в качестве среды.

2. Рассечение сетчатки и подготовка клеточной культуры

1. Откройте яйцеклетку 8-дневного эмбриона цыпленка (E8), где находится воздушная клетка.
2. Извлеките содержимое яйца в чашку Петри и приступайте к эвтаназии эмбриона путем обезглавливания парой пинцета.
3. Поднесите голову к чистой чашке Петри и влейте немного раствора без кальция и магния (CMF), чтобы вымыть ее.
4. Удалите глаза, позаботившись о том, чтобы не повредить их в процессе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь избегать разрезания или измельчения слоев глаза, прежде чем удалять его из глазной полости.
5. Поднесите глаза к чистой чашке Петри, содержащей CMF.
6. Начните рассечение глаз с удаления хрусталика.
7. Сделайте 3 или 4 продольных разреза в глазу, начиная с отверстия, оставленного хрусталиком. Делайте надрезы, вытягивая пинцет, удерживая глазную склеру в противоположных направлениях.
8. Удаляйте прозрачное стекловидное тело с осторожностью, следя за тем, чтобы сетчатка не была привязана к нему.
9. Отделите сетчатку от пигментированного эпителия и удалите все оставшиеся ткани.
10. Разрежьте прозрачную сетчатку небольшими кусочками.
11. Перенесите сетчатку к другому реципиенту и ненадолго центрифугируйте (~1 800 х г в течение 1 мин) ее для удаления CMF.
12. Ферментативно диссоциируют сетчатку 1 мл 0,25% трипсина, инкубируя его при 37 °C в течение 10 мин.
13. Остановить реакцию можно добавлением 1 мл среды, содержащей 10% ФКС.
14. Промыть сетчатку 2 или 3 раза средой. Промывка состоит из циклов добавления среды и удаления ее центрифугированием (~1 800 х г в течение 1 мин).
15. Добавьте 2 мл полной среды на сетчатку и осторожно механически диссоциируйте сетчатку, пипетируя ее вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь исследователи могут выбрать, какой тип культуры будет подготовлен. Для обогащенной нейрональной культуры используйте DMEM-F12 + нейронную добавку + 1% FCS + антибиотики. Для смешанной популяции или очищенной глии используйте DMEM-F12 + 10% FCS + антибиотики.
16. Подсчитайте клетки и разбавьте их до нужной плотности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале это должна быть культура низкой плотности с ~ 2 x ¹⁰⁶ клетками или менее.
17. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии к каждому крышке.
18. Обработка чехла
    1. Инкубировать крышки в течение не менее 1 ч (в идеале на ночь) в 1 мл 10-50 мкг/мл поли-L-лизина в стерилизованной очищенной воде при 37 °C.
    2. Удалить раствор поли-L-лизина и промыть крышки стерилизованной очищенной водой 2-3 раза.
    3. Дайте чехлам высохнуть в шкафу безопасности с включенными ультрафиолетовыми огнями. В этот момент храните их в герметичном контейнере при 4 °C в течение 1 месяца.
    4. Необязательный этап: Для культур, обогащенных нейронами, добавляют 50 мкл 10-20 нг/мл ламинина в PBS или среде к каждому покровному листу в течение 2 ч при 37 °C. После инкубации удалите избыток раствора ламинина и крышка готова к использованию.
19. Инкубируйте ячейки при 37 °C в атмосфере _CO2 5% до тех пор, пока они не прикрепятся к стеклу. Это должно занять около 1-2 ч.
20. Добавьте в каждую лунку по 1 мл полной среды и верните пластину в инкубатор до дня эксперимента. При необходимости меняйте среду каждые 2-3 дня.

3. Загрузочные ячейки с Fura-2 AM

1. Восстановите флакон 50 мкг Fura-2 AM с 50 мкл DMSO.
2. Для приготовления рабочего раствора Фура-2 АМ добавляют 3 мкл 10% полоксамера 407, 7,5 мкл Фура-2 АМ в ДМСО и растворе Кребса q.s.p. до 1,5 мл.
3. Настаивайте смесь ультразвуком в течение 7 мин на водяной бане.
4. Промыть крышку с клеточной культурой 3x раствором Кребса перед инкубацией в Fura-2.
5. Инкубировать при 37 °C и 5% _CO2 в течение 30 мин.
6. После инкубации снова промыть его 3 раза и перенести другому получателю, содержащему Кребс и защищенному от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор Fura-2 AM остается стабильным в течение 24 часов, если он защищен от света.

4. Кальциевая визуализация клеток

1. Перед каждым запуском добавляйте кремний в опору и камеру крышки, чтобы избежать утечки во время эксперимента.
2. Промойте нижнюю часть крышки дистиллированной водой, чтобы избежать кристаллизации соли на линзе микроскопа.
3. Положите крышку на опору, осторожно прижав края.
4. Прикрепите опору и камеру к микроскопу и начните перфузию клеток раствором Кребса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия клеток во время экспериментов по визуализации кальция в одной клетке калибруется до скорости потока 0,5 мл / мин, и для полной замены раствора платформы требуется 8-10 с.
5. Взгляните на ячейки и выберите соответствующее поле зрения.
6. Вручную выделите клеточные тела на основе их различной морфологии.
7. Прежде чем применять какой-либо стимул, дождитесь стабилизации исходного уровня. Каждый стимул должен занимать около 30 секунд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все решения непосредственно перед каждым экспериментом.
8. Оцените вариации в [^Ca2+]_i путем количественной оценки соотношения флуоресценции, излучаемой при 510 нм после переменного возбуждения (750 миллисекунд) при 340 и 380 нм.
9. Обрабатывайте полученные значения с помощью программного обеспечения для флуоресцентного анализа.
10. Выражайте экспериментальные результаты в таблице, где каждая строка представляет отдельную ячейку, а каждая строка — точку времени.

5. Обработка данных

1. Используя программное обеспечение для работы с электронными таблицами, постройте график изменения значений коэффициента флуоресценции Fura-2 отдельных ячеек по отдельности или всех из них одновременно.
2. Чтобы количественно оценить количество реакционноспособных клеток для определенного стимула, установите отсечение на 30% увеличения базовых уровней кальция

Результаты

Здесь мы использовали клетки сетчатки в культуре эмбриональных цыплят 8-го дня, чтобы исследовать, как нейроны и глия сигнализируют с точки зрения сдвигов кальция. Культуры готовили по существу так^{, как описано15,19} как смешанные нейронно-глиальные клетки (...

Обсуждение

Мы использовали ткань сетчатки, чтобы показать, что реакции кальция, опосредованные KCl или АТФ, четко разделены на нейронные и глиальные реакции соответственно (рисунок 1). Хотя некоторые данные в литературе подразумевают, что рецепторы P2X7 экспрессируются в нейронах, кот...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mm coverslip	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Cell suport
510 nm long-pass filter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital camera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Cell culture medium
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence Microscope	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molecular Probes	F1221	Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate	Calbiochem	1405-41-0	antibiotics
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 apparatus	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Help cell adhesion
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nonionic, surfactant
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056	Dissociation enzyme