הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

Summary

הדמיית סידן תאים היא מתודולוגיה רב-תכליתית לחקר איתות דינמי של תאים בודדים, על אוכלוסיות מעורבות בתרבית או אפילו על בעלי חיים מתעוררים, המבוססת על הביטוי של ערוצים / קולטנים חדירים לסידן המעניקים חתימות פונקציונליות ייחודיות.

Abstract

כאן, אנו מדווחים על מודלים סלקטיביים במבחנה של מעגלים המבוססים על גליה (אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה) ו / או נוירונים מציוד היקפי (גרעיני שורש הגב) ורקמות מרכזיות (קליפת המוח, אזור תת-חדרי, אורגנויד) הנחקרים באופן דינמי במונחים של שינויי סידן. המודל שנבחר כדי להמחיש את התוצאות הוא הרשתית, רקמה פשוטה עם אינטראקציות תאיות מורכבות. סידן הוא שליח אוניברסלי המעורב ברוב התפקידים התאיים החשובים. אנו מסבירים בפרוטוקול שלב אחר שלב כיצד תאי נוירון-גליה ברשתית בתרבית יכולים להיות מוכנים ומוערך, לדמיין שינויי סידן. במודל זה, אנו מבדילים נוירונים מגליה בהתבסס על התגובה הסלקטיבית שלהם ל- KCl ו- ATP. קולטנים חדירים סידן וערוצים באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתאים שונים. כדי לנתח תגובות סידן, אנו משתמשים במתים פלואורסצנטיים יחסיים כגון Fura-2. בדיקה זו מכמתת ריכוז ^Ca2+ חופשי המבוסס על צורות ^{Ca2+ ללא Ca2} + ו- ^{Ca2 +} מאוגדות, ומציגה שתי פסגות שונות, המבוססות על עוצמת הפלואורסצנטיות הנתפסת בשני אורכי גל.

Introduction

בשל התכונות האוניברסליות של סידן כשליח שני, יון זה מעורב במספר עצום של פעילויות איתות: שעתוק גנים, לידה ומוות, התפשטות, הגירה ובידול, שידור סינפטי ופלסטיות. לפיכך, שיטה המסוגלת לעקוב אחר דינמיקת הפעלת הסידן בנאמנות וזריזות תספק דרך להתבונן בתגובות מרחביות-זמניות ייחודיות. שיטה כזו היא טכניקת הדמיית הסידן התאית, אשר מתאמת סידן מעביר נתונים פונקציונליים עם פנוטיפים ספציפיים של התא בהתבסס על התגובות הייחודיות שלהם.

בדיקות ^Ca2+ פותחו לראשונה בשנות השמונים, עם שיפורים מאוחרים יותר המאפשרים שימוש במולקולות אלה בבדיקות תאים ^חיים1. כאינדיקטור כימי, Fura-2 נחשב לסטנדרט למדידות כמותיות [^Ca2+]_i. אסתר האצטוקסימתיל (AM) של מחוון זה (כלומר, Fura-2 AM) מחלחלת בקלות לקרום התא ויכולה להגיע לריכוזים תאיים גדולים פי 20 מדילול הדגירה (למשל, [5 μM]_o/[100 μM]_i). יתרון נוסף של Fura-2 הוא שיש לו התנגדות טובה להלבנה פוטו; לפיכך, הדמיית אינדיקטור זה לפרקי זמן ארוכים יותר לא תשפיע רבות על יכולות הפלואורסצנטיות שלה. לבסוף, Fura-2 רגיש למגוון רחב של רמות סידן, מ ~ 100 nM כדי ~ 100 מיקרומטר, ויש לו _Kd של ~ 145 nM, אשר דומה למנוחה [^{Ca2 +}]_i2. מאוחר יותר, הדמיית סידן התא פותחה עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים טובים יותר ושיטות חישוב, יחד עם בדיקות יחס שאינן מושפעות מטעינת צבע.

כל תא מבטא התקני סידן שונים (משאבות, מובילים, קולטנים וערוצים) התורמים לתגובה הסופית כחתימה מסוימת. הטיפ החשוב הוא למצוא תגובות סלקטיביות של סוגים שונים של תאים בקורלציה עם הביטוי הפנוטיפי שלהם. בהתאם לכך, ישנם לפחות שני קולטנים שונים הפועלים באמצעות משמרות סידן: קולטנים יונוטרופיים המחלחלים ^{Ca2 +} במצב מהיר וקולטנים מטבוטרופיים איטיים בשילוב מסלולי איתות ומלאי תאיים המשחררים ^{Ca2 +} מופעל על ידי שליחים שניים, כגון אינוזיטול טריפוספט ו ADP-ריבוז ^{מחזורי3}.

לדוגמה, תאי אב מבטאים nestin ברשתית לא בוגרת ולהראות קולטני _GABAA depolarized על ידי גאבא (או muscimol)⁴. זה קורה בשל שיפוע Cl^- אלקטרוכימי ^{עם רמות Cl} − תאיות גבוהות; כמו הרקמה מתפתחת, מובילי KCC2 לעבור עירור על אבות לעיכוב על נוירונים GABAergic ^בוגר5. מצד שני, תאי גזע המבטאים sox-2 באזור תת-חדרי לא בוגר (SVZ) של מכרסמים לאחר הלידה מציגים גם קולטני H1 מטבוטרופיים המופעלים על ידי היסטמין הגדלת ^{Ca2 +} בצורה ^איטית6. קולטן מטבוטרופי שני ממשפחת קולטן-1 המופעלת על ידי פרוטאז (PAR-1), המופעל על ידי תרומבין ובמורד הזרם ל- G(q/11) ופוספוליפאז C (PLC), נותן משמרות ^{Ca2 +} איטיות באוליגודנדרוציטים (המבטאים O4 ו- PLP) הנוצרים מתאי עצב גזע SVZ ^{מרובים7}.

באופן כללי, נוירונים מבטאים ערוצי סידן תלויי מתח, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר עיקריים חדיר ^{Ca2 +}, כמו גלוטמטרגי (אמפא, NMDA, kainate) וקולטנים היקפיים ומרכזיים nicotinic. אשלגן כלורי משמש בדרך כלל כסוכן depolarizing להפעלת נוירונים היקפיים, כמו נוירונים גנגליון שורש ^הגב8 או נוירונים מרכזיים, כמו מאזור subventricular9 או ^רשתית10. מצד שני, ATP מוכר כמו gliotransmitter העיקרי (בנוסף D-serine), אשר מפעיל חברי ^{Ca2 +} חדירים סלקטיביים P2X, כמו P2X7 ו P2X4. שני הקולטנים מציגים זרמי ^Ca2+ מקבילים, בדומה לאלה המוצגים על ידי קולטני NMDA המוכרים כזרמי ^{Ca2 +} הגדולים ביותר המופעלים על ידי ^{משדרים11}. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי מאוד על מיקרוגליה, אבל בצפיפות נמוכה יותר על אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, שיש להם תפקיד בשחרור של ציטוקינים ^{פרו-דליקים12}. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי גם על תאי ^Schwann13 ו Müller גליה ^{ברשתית14,15}.

הרשתית ידועה להראות כמעט את כל המשדרים שנראו במוח. לדוגמה, הציר האנכי (קולטני אור, תאי גנגליון דו קוטביים ורשתית) הוא בעיקר גלוטמטרגי, עם קולטני אמפא חדירים לסידן או kainate המתבטאים בתאים OFF-דו-קוטביים ו- mgluR6 המתבטאים בתאים דו-קוטביים ¹⁶. באופן מוזר, כל שלושת הקולטנים נמצאים גם מולר גליה, אשר מצמידים סידן ואינוזיטול טריפוספט ^{מסלולים17,18}. ציר מעכב אופקי, שנעשו על ידי תאים אופקיים amacrine, להפריש לא רק גאבא, אלא גם דופמין, אצטילכולין, נוירוטרנסמיטורים קלאסיים אחרים. תאי Amacrine הם הסוגים העיקריים של תאים שנמצאו בתרביות רשתית העופות, מראה מספר סוגים של ערוצים המופעלים על ידי סידן, כמו glutamatergic, purinergic, ניקוטיני ומתח תלוי סידן תעלות סידן. מסיבה זו, זהו מודל מצוין להערכת תכונות שונות של סידן משתנה בין נוירונים גליה.

לכן, השילוב של קולטנים וערוצים שונים הסתכם סמנים פנוטיפיים סלקטיביים במהלך הפיתוח עם דפוסי תגובה אגוניסטיים ברורים מאפשר חתימות ייחודיות גזע, אב, נוירון, אסטרוציט, אוליגודנדרוציטים, ומיקרוגליה הפועלים באמצעות התקני איתות סלקטיביים.

Protocol

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים אושרו ובוצעו על ידי ובוצעו בעקבות ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, בעקבות "עקרונות הטיפול בבעלי חיים במעבדה" (NIH, Bethesda, ארה"ב); מספר היתר IBCCF-035 עבור ביצי עוף לגהורן לבן מופרות.

1. הכנת פתרונות

1. הכן פתרון קרבס: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM _MgCl2, 2.5 mM _CaCl2, 6 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
2. הכן מאגר מלוחים (^Ca2+ ו ^{Mg2 +} פתרון חינם - CMF): 76.55 גרם / L NaCl, 3.05 גרם / L KCl, 1.65 גרם / L _Na2HPO4, 0.610 g / L _KH2PO4, 21.95 גרם / ליטר גלוקוז, ו 7.90 גרם / L NaHCO3.
3. הכן פתרון דגירה (עם Fura-2 בפתרון קרבס:) 5 μM Fura-2-acetoxymethyl אסתר (Fura-2), 0.1% אלבומין סרום בקר ללא חומצות שומן (BSA), ו 0.02% פולוקסמר 407.
4. לאוכלוסייה מעורבת או לתרבות גליה, הכינו DMEM/F12 עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו-40 מ"ג/ליטר גנטמיצין כאמצעי.
5. עבור תרבות מועשרת נוירונים, להכין DMEM / F12 עם 1% FCS, תוספת תרבית התא העצבי, 40 מ"ג / L וגנטמיצין כמו המדיום.

2. כריתת רשתית והכנה תרבית תאים

1. פתחו את ביצת העובר בן ה-8 ימים (E8) שבה נמצא תא האוויר.
2. מוציאים את תכולת הביצית לצלחת פטרי וממשיכים עם המתת החסד העוברית על ידי עריפת ראש עם זוג פינצטה.
3. מביאים את הראש לצלחת פטרי נקייה ויוצקים קצת תמיסה נטולת סידן ומגנזיום (CMF) כדי לשטוף אותה.
4. הסר את העיניים, הקפדה לא לפגוע בו בתהליך.
   הערה: נסו להימנע מחיתוך או גריסה של שכבות העין לפני הסרתן מחלל העין.
5. הביאו את העיניים לצלחת פטרי נקייה המכילה CMF.
6. התחל את ניתוח העין על ידי הסרת העדשה.
7. בצע 3 או 4 חתכים אורך בעין, החל על ידי החור שנותר על ידי העדשה. לעשות חתכים על ידי משיכת פינצטה, מחזיק את סקלרה העין בכיוונים מנוגדים.
8. הסר את הגוף הזגוגי השקוף בזהירות, לוודא כי הרשתית אינה קשורה אליו.
9. לנתק את הרשתית מן האפיתל פיגמנטי ולהסיר כל רקמה שנותרה.
10. חותכים את הרשתית הברורה לחתיכות קטנות.
11. העבר את הרשתית לנמען אחר וצנטריפוגה לזמן קצר (~ 1,800 x g למשך דקה אחת) כדי להסיר את ה- CMF.
12. באופן אנזימטי לנתק את הרשתית עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, על ידי דגירה זה ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
13. עצור את התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל של בינוני המכיל 10% FCS.
14. לשטוף את הרשתית 2 או 3 פעמים עם בינוני. הכביסה מורכבת ממחזורים של הוספת בינוני והסרתו על ידי צנטריפוגה (~ 1,800 x גרם במשך דקה אחת).
15. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום מלא לכל רשתית ומנתקים בעדינות את הרשתית באופן מכני על ידי הזרמתה למעלה ולמטה.
    הערה: כאן, חוקרים יכולים לבחור איזה סוג של תרבות יהיה מוכן. לתרבות עצבית מועשרת, יש להשתמש ב-DMEM-F12 + תוסף עצבי + 1% FCS + אנטיביוטיקה. לאוכלוסייה מעורבת או גליה מטוהרת, יש להשתמש ב-DMEM-F12 + 10% FCS + אנטיביוטיקה.
16. לספור את התאים ולדלל אותם לצפיפות הרצויה.
    הערה: באופן אידיאלי, זה צריך להיות תרבות בצפיפות נמוכה עם ~ 2 x ¹⁰⁶ תאים או פחות.
17. הוסף 50 μL של השעיית התא לכל כיסוי כיסוי.
18. טיפול בכיסוי
    1. דגירה מכסה לפחות 1 שעות (באופן אידיאלי לילה) ב 1 מ"ל של 10-50 מיקרוגרם / מ"ל פולי-L-ליזין במים מטוהרים מעוקרים ב 37 °C (37 °F).
    2. הסר את תמיסת פולי-L-ליזין ולשטוף כיסויים עם מים מטוהרים מעוקרים 2-3 פעמים.
    3. אפשר לכסותים להתייבש בארון בטיחות עם אורות UV דולקים. בשלב זה, לאחסן אותם במיכל אטום ב 4 °C (65 °F) עד חודש אחד.
    4. שלב אופציונלי: עבור תרביות מועשרות נוירונים, להוסיף 50 μL של 10-20 ng /mL למינין ב- PBS או בינוני לכל כיסוי עבור 2 שעות ב 37 °C (37 °F). לאחר הדגירה, להסיר למינין פתרון עודף ואת כיסוי מוכן לשימוש.
19. תאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% _CO2 עד שהם מתחברים לזכוכית. זה צריך לקחת בערך 1-2 שעות.
20. מוסיפים 1 מ"ל של מדיום מלא לכל באר ומחזירים את הצלחת לאינקובטור עד יום הניסוי. במידת הצורך, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.

3. טעינת תאים עם פורה-2 AM

1. לשחזר בקבוקון 50 מיקרוגרם של פורה-2 AM עם 50 μL של DMSO.
2. כדי להכין פתרון פורה-2 AM עובד, להוסיף 3 μL של 10% Poloxamer 407, 7.5 μL של Fura-2 AM ב DMSO ו Krebs פתרון q.s.p. ל 1.5 מ"ל.
3. Sonicate התערובת במשך 7 דקות באמבט מים.
4. לשטוף את כיסוי עם תרבית התא 3x עם פתרון קרבס לפני הדגירה אותו Fura-2.
5. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2 למשך 30 דקות.
6. לאחר הדגירה, לשטוף אותו 3x שוב ולהעביר אותו לנמען אחר המכיל קרבס ומוגן מפני האור.
   הערה: פתרון Fura-2 AM עובד נשאר יציב במשך 24 שעות אם מוגן מפני האור.

4. הדמיית סידן של תאים

1. לפני כל ריצה, הוסיפו סיליקון לתמיכה ולתמיכת כיסוי כדי למנוע דליפה במהלך הניסוי.
2. לשטוף את החלק התחתון של כיסוי עם מים מזוקקים כדי למנוע התגבשות מלח על עדשת המיקרוסקופ.
3. שים את כיסוי על התמיכה, בעדינות לחיצה על הגבולות.
4. חבר את התמיכה והתא למיקרוסקופ ולהתחיל לתזקף תאים עם פתרון קרבס.
   הערה: זלוף תאים במהלך ניסויים הדמיית סידן תא יחיד מכויל לקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה, וזה לוקח 8-10 s עבור פתרון הפלטפורמה להיות מוחלף באופן מלא.
5. הבט בתאים ובחר שדה ראייה מתאים.
6. בחר ידנית את גופי התא בהתבסס על המורפולוגיה הייחודית שלהם.
7. לפני החלת כל גירוי, לחכות ייצוב בסיסי. כל גירוי צריך לקחת בערך 30 שניות.
   הערה: הכינו את כל הפתרונות מיד לפני כל ניסוי.
8. הערך את הווריאציות ב- [^Ca2+]_i על-ידי כימות היחס בין הפלואורסצנטיות הנפלטת ב- 510 ננומטר לאחר עירור חלופי (750 אלפיות השניה) ב- 340 ו- 380 ננומטר.
9. עבד ערכים שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח פלואורסצנטיות.
10. תוצאות ניסיוניות מפורשות בטבלה שבה כל שורה מייצגת תא בודד, וכל שורה היא נקודת זמן.

5. עיבוד נתונים

1. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, להתוות את הווריאציה של Fura-2 ערכי יחס פלואורסצנטיות של תאים יחידים בנפרד או של כולם בו זמנית.
2. כדי לכמת את מספר התאים תגובתיים לגירוי שנקבע, הגדר ניתוק של 30% עלייה ברמות הבסיס של הסידן

תוצאות

כאן, השתמשנו בתאי רשתית בתרבית מגוזלי היום העוברי 8 כדי לחקור כיצד נוירונים וגליה מאותתים במונחים של משמרות סידן. תרביות הוכנו למעשה כפי שתואר ^15,19 כתאי נוירון-גליה מעורבים (בצפיפות של ≥ 1 x ¹⁰⁶ תא / צלחת) בשלב של 7 ימים במבחנה (איור 1A). לחלופי...

Discussion

השתמשנו ברקמת הרשתית כדי להראות שתגובות הסידן בתיווך KCl או ATP ממודרות בבירור לתגובות עצביות וגליות, בהתאמה (איור 1). למרות כמה נתונים בספרות לרמוז כי קולטני P2X7 באים לידי ביטוי נוירונים, אשר לווסת את הפעילות העצבית ואת שחרור נוירוטרנסמיטר סינפטי ²⁰, מחברים אחרים מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mm coverslip	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Cell suport
510 nm long-pass filter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital camera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Cell culture medium
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence Microscope	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molecular Probes	F1221	Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate	Calbiochem	1405-41-0	antibiotics
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 apparatus	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Help cell adhesion
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nonionic, surfactant
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056	Dissociation enzyme