Visualizzazione dei cambiamenti sul circuito Neuron-Glia con la tecnica di imaging del calcio

Riepilogo

L'imaging cellulare del calcio è una metodologia versatile per studiare la segnalazione dinamica di singole cellule, su popolazioni miste in coltura o anche su animali risvegliati, basata sull'espressione di canali/recettori permeabili al calcio che danno firme funzionali uniche.

Abstract

Qui, riportiamo modelli selettivi in vitro di circuiti basati su glia (astrociti, oligodendrociti e microglia) e / o neuroni da tessuti periferici (gangli della radice dorsale) e centrali (corteccia, zona subventricolare, organoide) che sono dinamicamente studiati in termini di spostamenti di calcio. Il modello scelto per illustrare i risultati è la retina, un tessuto semplice con complesse interazioni cellulari. Il calcio è un messaggero universale coinvolto nella maggior parte dei ruoli cellulari importanti. Spieghiamo in un protocollo passo-passo come le cellule neuronali-gliali retiniche in coltura possono essere preparate e valutate, immaginando spostamenti di calcio. In questo modello, differenziamo i neuroni dalla glia in base alla loro risposta selettiva a KCl e ATP. I recettori e i canali permeabili al calcio sono espressi selettivamente in diversi compartimenti. Per analizzare le risposte al calcio, utilizziamo stampi fluorescenti raziometrici come Fura-2. Questa sonda quantifica la concentrazione libera ^{di Ca2+} in base alle forme ^Ca2+-free e ^Ca2+-bound, presentando due diversi picchi, fondati sull'intensità di fluorescenza percepita su due lunghezze d'onda.

Introduzione

A causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero, questo ione è coinvolto in un vasto numero di attività di segnalazione: trascrizione genica, nascita e morte, proliferazione, migrazione e differenziazione, trasmissione sinaptica e plasticità. Quindi, un metodo in grado di tracciare le dinamiche di attivazione del calcio con fedeltà e agilità fornirebbe un modo per osservare risposte spazio-temporali uniche. Tale metodo è la tecnica di imaging del calcio cellulare, che correla i dati funzionali degli spostamenti del calcio con fenotipi cellulari specifici in base alle loro risposte distinte.

Le sonde ^Ca2+ sono state sviluppate per la prima volta nel 1980, con miglioramenti successivi che hanno permesso a queste molecole di essere utilizzate in saggi di cellule ^vive1. Come indicatore chimico, Fura-2 è considerato lo standard per le misurazioni quantitative [^Ca2+]_i. L'estere acetosimetilico (AM) di questo indicatore (cioè Fura-2 AM) permea facilmente la membrana cellulare e può raggiungere concentrazioni intracellulari 20 volte superiori alla diluizione di incubazione (ad esempio, [5 μM]_o/[100 μM]_i). Un altro vantaggio di Fura-2 è che ha una buona resistenza al fotosbiancamento; pertanto, l'imaging di questo indicatore per periodi di tempo più lunghi non influenzerà notevolmente le sue capacità di fluorescenza. Infine, Fura-2 è sensibile a una vasta gamma di livelli di calcio, da ~ 100 nM a ~ 100 μM, e ha un _Kd di ~ 145 nM, che è paragonabile al riposante [^{Ca2 +}] _i2. Successivamente, l'imaging del calcio cellulare è stato sviluppato con microscopi fluorescenti e metodi di calcolo migliori, insieme a sonde raziometriche che non sono influenzate dal carico del colorante.

Ogni cellula esprime diversi dispositivi di calcio (pompe, trasportatori, recettori e canali) che contribuiscono alla risposta finale come una particolare firma. Il consiglio importante è quello di trovare risposte selettive di diversi tipi di cellule correlate con la loro espressione fenotipica. Di conseguenza, ci sono almeno due diversi recettori che operano attraverso gli spostamenti del calcio: i recettori ionotropici che permeano ^{Ca2 +} in modo veloce e recettori metabotropici lenti accoppiati a vie di segnalazione e stock intracellulari che rilasciano ^{Ca2 +} attivato da secondi messaggeri, come l'inositolo trifosfato e l'ADP-ribosio ^ciclico3.

Ad esempio, le cellule progenitrici esprimono la nestin nella retina immatura e mostrano recettori _GABAA depolarizzati dal GABA (o muscimolo)⁴. Ciò accade a causa del gradiente elettrochimico Cl^- con alti livelli ^{intracellulari di Cl−} ; man mano che il tessuto si sviluppa, i trasportatori KCC2 passano dall'eccitazione sui progenitori all'inibizione sui neuroni GABAergici ^maturi5. D'altra parte, le cellule staminali che esprimono sox-2 nella zona subventricolare immatura (SVZ) dei roditori postnatali presentano anche recettori H1 metabotropici attivati dall'istamina che aumenta Il ^Ca2+ in modo ^lento6. Un secondo recettore metabotropico della famiglia par-1 (1) attivato dalla proteasi, attivato dalla trombina e a valle di G(q/11) e fosfolipasi C (PLC), fornisce lenti spostamenti di ^Ca2+ negli oligodendrociti (che esprimono O4 e PLP) generati da cellule staminali neurali SVZ ^{multipotenti7}.

In generale, i neuroni esprimono canali del calcio voltaggio-dipendenti e i principali recettori dei neurotrasmettitori permeabili al ^Ca2+, come i recettori glutamatergici (AMPA, NMDA, kainate) e periferici e centrali. Il cloruro di potassio viene solitamente utilizzato come agente depolarizzante per attivare i neuroni periferici, come i neuroni gangliari della radice ^dorsale8 o i neuroni centrali, come dalla zona subventricolare9 o ^retina10. D'altra parte, l'ATP è riconosciuto come il principale gliotrasmettitore (oltre alla D-serina), che attiva i membri ^P2X permeabili selettivi al Ca2 +, come P2X7 e P2X4. Entrambi i recettori presentano correnti di ^Ca2+ equivalenti, simili a quelle mostrate dai recettori NMDA riconosciuti come le più grandi correnti di ^Ca2+ attivate dai ^{trasmettitori11}. I recettori P2X7 sono altamente espressi sulle microglia, ma a una densità inferiore su astrociti e oligodendrociti, avendo un ruolo nel rilascio di citochine proinfiammatorie12. I recettori P2X7 sono espressi anche sulle cellule di ^Schwann13 e sulla glia di Müller nella ^retina14,15.

La retina è nota per mostrare quasi tutti i trasmettitori osservati nel cervello. Ad esempio, l'asse verticale (fotorecettori, cellule gangliari bipolari e retiniche) è principalmente glutamatergico, con AMPA permeabili al calcio o recettori kainate espressi in cellule OFF-bipolari e mgluR6 espresso in cellule ^{ON-bipolari16}. Curiosamente, tutti e tre i recettori si trovano anche nella glia di Müller, che sono accoppiati alle vie del calcio e dell'inositolo ^{trifosfato17,18}. L'asse inibitorio orizzontale, costituito da cellule orizzontali e amacrine, secerne non solo GABA, ma anche dopamina, acetilcolina e altri neurotrasmettitori classici. Le cellule amacrine sono i principali tipi di cellule presenti nelle colture retiniche aviarie, mostrando diversi tipi di canali gestiti dal calcio, come i canali del calcio glutamatergici, purinergici, nicotinici e voltaggio-dipendenti. Per questo motivo, questo è un ottimo modello per valutare le diverse proprietà degli spostamenti di calcio tra neuroni e glia.

Pertanto, la combinazione di diversi recettori e canali sommati a marcatori fenotipici selettivi durante lo sviluppo con distinti modelli di risposta agonista consente firme uniche in stelo, progenitore, neurone, astrocita, oligodendrocita e microglia che operano attraverso dispositivi di segnalazione selettiva.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati e condotti seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Federale di Rio de Janeiro, seguendo i "Principi di cura degli animali da laboratorio" (NIH, Bethesda, USA); numero di permesso IBCCF-035 per uova di gallina Livorno Bianca fecondate.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare la soluzione di Krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 6 mM glucosio, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
2. Preparare tampone salino (soluzione libera di ^{Ca2+ e Mg2+} - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L _Na2HPO4, 0,610 g/L _KH2PO4, 21,95 g/L glucosio e 7,90 g/L NaHCO3.
3. Preparare la soluzione di incubazione (con Fura-2 nella soluzione di Krebs:) 5 μM di estere fura-2-acetossimetilico (Fura-2), 0,1% di albumina sierica bovina priva di acidi grassi (BSA) e 0,02% di Poloxamer 407.
4. Per la popolazione mista o la coltura gliale, preparare DMEM/F12 con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 40 mg/L di gentamicina come mezzo.
5. Per la coltura arricchita di neuroni, preparare DMEM / F12 con FCS all'1%, integratore di coltura cellulare neuronale, 40 mg / L e gentamicina come mezzo.

2. Dissezione della retina e preparazione della coltura cellulare

1. Aprire l'embrione di pulcino di 8 giorni (E8) in cui si trova la cellula dell'aria.
2. Rimuovere il contenuto dell'uovo in una capsula di Petri e procedere con l'eutanasia embrionale per decapitazione con un paio di pinzette.
3. Portare la testa in una capsula di Petri pulita e versare una soluzione priva di calcio e magnesio (CMF) per lavarla.
4. Rimuovere gli occhi, facendo attenzione a non danneggiarlo nel processo.
   NOTA: Cercare di evitare di tagliare o triturare gli strati dell'occhio prima di rimuoverlo dalla cavità oculare.
5. Porta gli occhi su una capsula di Petri pulita contenente CMF.
6. Iniziare la dissezione dell'occhio rimuovendo la lente.
7. Fai 3 o 4 tagli longitudinali nell'occhio, a partire dal foro lasciato dalla lente. Fai tagli tirando le pinzette, tenendo l'occhio sclera in direzioni opposte.
8. Rimuovere il corpo vitreo trasparente con cautela, assicurandosi che la retina non sia legata ad esso.
9. Staccare la retina dall'epitelio pigmentato e rimuovere il tessuto rimanente.
10. Tagliare la retina trasparente in piccoli pezzi.
11. Trasferire la retina a un altro ricevente e centrifugare brevemente (~ 1.800 x g per 1 minuto) per rimuovere la CMF.
12. Dissociare enzimaticamente la retina con 1 mL di tripsina allo 0,25%, incubandola a 37 °C per 10 min.
13. Interrompere la reazione aggiungendo 1 mL di mezzo contenente il 10% di FCS.
14. Lavare la retina 2 o 3 volte con il mezzo. Il lavaggio consiste in cicli di aggiunta del mezzo e rimozione mediante centrifugazione (~ 1.800 x g per 1 min).
15. Aggiungere 2 ml di mezzo completo per retina e dissociare delicatamente meccanicamente la retina pipettandola su e giù.
    NOTA: Qui, gli investigatori possono scegliere quale tipo di cultura verrà preparata. Per una coltura neuronale arricchita, utilizzare DMEM-F12 + integratore neuronale + 1% FCS + antibiotici. Per la popolazione mista o glia purificata, utilizzare DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotici.
16. Contare le cellule e diluirle alla densità desiderata.
    NOTA: Idealmente, questa dovrebbe essere una coltura a bassa densità con ~ 2 x ¹⁰⁶ celle o meno.
17. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare a ciascun coperchio.
18. Trattamento Coverslip
    1. Incubare i coverslip per almeno 1 ora (idealmente durante la notte) in 1 mL di 10-50 μg/mL di poli-L-lisina in acqua purificata sterilizzata a 37 °C.
    2. Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina e lavare le coperture con acqua purificata sterilizzata 2-3 volte.
    3. Lascia asciugare le coperture in un armadio di sicurezza con luci UV accese. A questo punto, conservarli in un contenitore sigillato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
    4. Fase facoltativa: per le colture arricchite di neuroni, aggiungere 50 μL di laminina 10-20 ng/mL in PBS o mezzo a ciascun coverslip per 2 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di laminina in eccesso e il coverslip è pronto per l'uso.
19. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di _CO2 del 5% fino a quando non si attaccano al vetro. Questo dovrebbe richiedere circa 1-2 ore.
20. Aggiungere 1 mL di mezzo completo a ciascun pozzetto e restituire la piastra all'incubatrice fino al giorno dell'esperimento. Se necessario, cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.

3. Celle di carico con Fura-2 AM

1. Ricostituire un flaconcino da 50 μg di Fura-2 AM con 50 μL di DMSO.
2. Per preparare la soluzione di Fura-2 AM funzionante, aggiungere 3 μL di Poloxamer 407 al 10%, 7,5 μL di Fura-2 AM in DMSO e soluzione di Krebs q.s.p. a 1,5 mL.
3. Sonicare la miscela per 7 minuti a bagnomaria.
4. Lavare il coverslip con la coltura cellulare 3x con la soluzione di Krebs prima di incubarlo in Fura-2.
5. Incubare a 37 °C e 5% _CO2 per 30 min.
6. Dopo l'incubazione, lavarlo di nuovo 3 volte e trasferirlo in un altro recipiente contenente Krebs e protetto dalla luce.
   NOTA: La soluzione Fura-2 AM funzionante rimane stabile per 24 ore se protetta dalla luce.

4. Imaging del calcio delle cellule

1. Prima di ogni corsa, aggiungere silicio al supporto e alla camera del coperchio per evitare perdite durante l'esperimento.
2. Lavare il fondo del coperchio con acqua distillata per evitare la cristallizzazione del sale sulla lente del microscopio.
3. Metti il coverslip sul supporto, premendo delicatamente i bordi.
4. Collegare il supporto e la camera al microscopio e iniziare a perfondere le cellule con la soluzione di Krebs.
   NOTA: la perfusione cellulare durante gli esperimenti di imaging del calcio a singola cellula viene calibrata su una portata di 0,5 ml / min e ci vogliono 8-10 s per sostituire completamente la soluzione della piattaforma.
5. Dai un'occhiata alle celle e seleziona un campo visivo appropriato.
6. Selezionare manualmente i corpi cellulari in base alla loro morfologia distinta.
7. Prima di applicare qualsiasi stimolo, attendere la stabilizzazione al basale. Ogni stimolo dovrebbe richiedere circa 30 secondi.
   NOTA: Preparare tutte le soluzioni immediatamente prima di ogni esperimento.
8. Valutare le variazioni di [^Ca2+]_i quantificando il rapporto tra la fluorescenza emessa a 510 nm dopo eccitazione alternata (750 millisecondi) a 340 e 380 nm.
9. Elaborare i valori acquisiti utilizzando un software di analisi della fluorescenza.
10. Esprimere i risultati sperimentali in una tabella in cui ogni riga rappresenta una singola cella e ogni riga un punto temporale.

5. Trattamento dei dati

1. Utilizzando un software per fogli di calcolo, tracciare la variazione dei valori del rapporto di fluorescenza Fura-2 di singole celle separatamente o di tutte allo stesso tempo.
2. Per quantificare il numero di cellule reattive a determinati stimoli, impostare un cutoff del 30% di aumento dei livelli basali di calcio

Risultati

Qui, abbiamo usato le cellule della retina in coltura dai pulcini embrionali del giorno 8 per studiare come i neuroni e la glia segnalano in termini di spostamenti di calcio. Le colture sono state preparate essenzialmente come ^{descritto15,19} come cellule miste neurone-gliali (ad una densità di ≥ 1 x ¹⁰⁶ cellula/piatto) in una fase di 7 giorni in vitro (Figura 1A). In alternativa, cellule neuronali arricchite preparate i...

Discussione

Abbiamo usato il tessuto retinico per dimostrare che le risposte calciche mediate da KCl o ATP sono chiaramente compartimentate in risposte neuronali e gliali, rispettivamente (Figura 1). Sebbene alcuni dati in letteratura implichino che i recettori P2X7 siano espressi in neuroni, che regolano l'attività neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori ^sinaptici20, altri autori mettono in dubbio l'esistenza di recettori P2X7 neuronali. In effetti, i risultati attuali so...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mm coverslip	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Cell suport
510 nm long-pass filter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital camera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Cell culture medium
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence Microscope	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molecular Probes	F1221	Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate	Calbiochem	1405-41-0	antibiotics
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 apparatus	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Help cell adhesion
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nonionic, surfactant
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056	Dissociation enzyme