Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Resumen

Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.

Resumen

La motilidad del enjambre bacteriano es un fenotipo microbiológico común que las comunidades bacterianas utilizan para migrar sobre superficies semisólidas. En las investigaciones de la motilidad del enjambre inducido, la concentración específica de un inductor puede no ser capaz de informar eventos que ocurren dentro del rango de concentración óptimo para provocar las respuestas deseadas de una especie. Las placas semisólidas que contienen múltiples concentraciones se usan comúnmente para investigar la respuesta dentro de un rango de concentración del inductor. Sin embargo, las placas semisólidas separadas aumentan las variaciones en la viscosidad media y el contenido de humedad dentro de cada placa debido al tiempo de solidificación no uniforme.

Este artículo describe un método de un solo paso para probar simultáneamente la motilidad del enjambre de superficie en una sola placa de gradiente, donde los pozos de prueba dispuestos isométricamente permiten la adquisición simultánea de respuestas de multiconcentración. En el presente trabajo, se evaluó el enjambre superficial de Escherichia coli K12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1 en respuesta a un gradiente de concentración de inductores como el resveratrol y la arabinosa. Periódicamente, las morfologías del enjambre se fotografiaban utilizando un sistema de imágenes para capturar todo el proceso de enjambre de superficie.

La medición cuantitativa de las morfologías del enjambre se adquirió utilizando el software ImageJ, proporcionando información analizable del área del enjambre. Este artículo presenta un método simple de placa de enjambre de gradiente que proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre los efectos de los inductores en el enjambre de superficie, que puede ampliarse para estudiar los efectos de otros inductores en una gama más amplia de especies bacterianas móviles.

Introducción

La motilidad del enjambre bacteriano se refiere a la migración colectiva de células bacterianas a través de la superficie de una sustancia. Además de las placas de agar semisólido especialmente preparadas en el ^laboratorio1, este fenotipo también se observa en algunos sustratos blandos como tejidos ^animales2, superficies hidratadas3 y raíces de ^plantas4. Si bien una superficie semisólida se considera una de las condiciones fundamentales para el enjambre bacteriano, algunas especies también requieren un medio rico en energía para soportar su motilidad de enjambre5. La rotación de flagelos potencia tanto para nadar como para enjambre: la natación describe la motilidad unicelular dentro de un ambiente líquido, mientras que el enjambre es el movimiento sincrónico de una población microbiana a través de superficies semisólidas.

La viscosidad del sustrato influye en la motilidad bacteriana; los estudios de microbios patógenos, como Helicobacter pylori, han demostrado que la motilidad del patógeno cambia en función de la viscosidad de la capa de mucina, que está influenciada por la acidificación ambiental en el huésped ^humano6. Para replicar estos entornos, estudios anteriores que utilizaron una concentración de agar superior al 0,3% (p/v) restringen la motilidad bacteriana de la natación para efectuar un cambio gradual hacia el enjambre superficial. El uso de concentraciones de agar por encima del 1% (p/v) previene la motilidad del enjambre de muchas ^especies7. Los patrones de colonia formados en la superficie son diversos, incluyendo ^mat8 sin rasgos, ojo de ^buey9, dendritas10 y vórtice11.

Aunque la relevancia de tales patrones sigue sin estar clara, esos patrones parecen depender de señales ambientales y ^químicas12. Las señales ambientales cubren diferentes aspectos, incluida la temperatura, la salinidad, la luz y el pH, mientras que las señales químicas incluyen la presencia de moléculas de detección de quórum microbiano, subproductos bioquímicos y nutrientes. Las moléculas de señalización de detección de quórum autoinductoras como AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) pueden afectar el enjambre superficial al regular la producción de ^{surfactante13,14}. El resveratrol, un compuesto fitoalexina, podría restringir la motilidad del enjambre ^bacteriano15.

En el presente trabajo, investigamos el efecto de las concentraciones de gradiente de resveratrol en la cepa K12 de Escherichia coli de tipo silvestre e investigamos la motilidad de enjambre inducible por arabinosa de las especies de E. coli K12-YdeH y Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La producción de la enzima YdeH es inducida por la arabinosa a través del promotor araBAD, resultando en perturbación celular c-di-GMP y afectando la motilidad del enjambre ^{bacteriano16,17}. Este comportamiento de enjambre inducible se estudia utilizando placas de enjambre de gradiente de arabinosa con cepas de E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Las placas de enjambre de gradiente se preparan solidificando sucesivamente el medio de doble capa (Figura 1B). La capa inferior comprende el medio agregado con el inductor, vertido en un lado de una placa de Petri apoyada. Tras la solidificación de la capa inferior, la placa de Petri se devuelve a una superficie plana, donde la capa superior que contiene el medio sin el inductor se agrega desde el otro lado de la placa. Después de que las placas de enjambre están completamente solidificadas, los pozos de retención dispuestos isométricamente se producen perforando agujeros en las placas de enjambre siguiendo un diseño fijo (Figura 1C) o imprimiendo los pozos utilizando un modelo impreso en 3D de la cubierta de la placa que contiene clavijas durante el proceso de curado del medio (Figura suplementaria S1). Se utiliza un sistema de imágenes en gel para capturar las morfologías del enjambre en diferentes puntos temporales (Figura 2). El análisis del enjambre de superficies utilizando el software ImageJ (Figura suplementaria S2) proporciona resultados cuantitativos del proceso de enjambre de superficies (Figura 3).

Por lo tanto, proponemos un método simple para probar la motilidad del enjambre de superficie dentro de un rango de concentración de inductores. Este método se puede utilizar para probar múltiples respuestas de concentración de otros inductores mezclando el inductor en el medio de la capa inferior y se puede aplicar a otras especies móviles (por ejemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Este enfoque podría proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos confiables para la detección de un solo inductor químico, y se pueden emplear placas separadas para evaluar más inductores químicos.

Protocolo

1. Preparación de placas de enjambre de gradiente

1. Preparación del medio de enjambre
   NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener una breve comparación de las diferentes viscosidades medias; En este protocolo se utilizó una concentración de agar del medio de enjambre al 0,7% (p/v).
   1. Preparar caldo de lisogenia (LB) en polvo con agar en dos matraces cónicos; cada matraz contiene 2 g de triptona, 2 g de cloruro de sodio, 1 g de extracto de levadura y 1,4 g de agar. Agregue agua de doble destilación (_ddH2O) y revuelva la suspensión con una barra de agitación magnética. Ajuste el volumen final a 200 ml agregando _ddH2O adicional.
   2. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 min. Use una tapa permeable al aire o una película de sellado de botellas con una salida de aire.
      NOTA: El agar se disolverá cuando se caliente en el autoclave.
   3. Cuando la temperatura baje a 65 °C, mezcle la solución para garantizar la homogeneidad y transfiera el medio a una incubadora o baño de agua a 65 °C para un uso a corto plazo.
2. Preparación del medio de enjambre de capa inferior
   NOTA: El medio de capa inferior es la mezcla de medio de enjambre y soluciones madre inductoras. La formulación de las placas de enjambre de gradiente inductor se muestra en la Tabla 1.
   1. Prepare una solución madre de resveratrol de 100 mM disolviendo 114,12 mg de polvo de resveratrol liofilizado en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene la solución a -20 °C.
   2. Preparar una solución madre de arabinosa al 20% (p/v) disolviendo 6 g de polvo de arabinosa en 30 ml de _ddH2O; espere 10-15 minutos para permitir que la arabinosa se disuelva; y almacene la solución a temperatura ambiente.
   3. Saque el medio de la incubadora de 65 °C y colóquelo a temperatura ambiente; deje que el medio de enjambre se enfríe hasta que el matraz Erlenmeyer esté lo suficientemente frío como para sostenerlo (~ 50 ° C). No coloque el medio de enjambre a temperatura ambiente durante largos períodos, ya que esto causará la solidificación del agar.
   4. Añadir el volumen requerido de la solución madre inductora al medio de enjambre a 50 °C (Tabla 1). Use una pipeta para dispensar la solución inductora en lugar de verterla. Agite suavemente para mezclar el inductor con el medio de enjambre.
      NOTA: Este paso es para inductores que no se pueden esterilizar en autoclave. Tenga cuidado de no introducir burbujas en el medio.
3. Preparación de placas de enjambre de gradiente de doble capa
   NOTA: El medio de capa superior es un medio LB que contiene 0.7% (p/v) de agar.
   1. Etiquete las placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm con el nombre del inductor y las cepas, y apoye los platos sobre el borde de las tapas (Figura 1B).
   2. Agregue un medio de capa inferior caliente de 40 ml (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
      NOTA: Alternativamente, para placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm, es adecuado un medio de capa inferior y capa superior de 40 ml; para placas de Petri cuadradas de 10 x 10 cm, la capa inferior de 25 ml y el medio de capa superior son adecuados.
   3. Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante 1 h dentro de una campana de flujo laminar. No moleste las placas de Petri cuadradas mientras el medio se solidifica.
      NOTA: Durante el curado de la capa inferior, el medio de enjambre que no contenga inductores debe mantenerse en una incubadora o baño de agua a 65 °C.
   4. Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri cuadradas dentro de una campana de flujo laminar.
   5. Añadir 40 ml de medio de capa superior caliente (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
      NOTA: El medio de capa superior no contiene inductores.
   6. Cure las placas de doble capa en la mesa de trabajo cubierta y sin molestias durante 1 h. Conservar las placas preparadas a 4 °C durante un máximo de 24 h.
      NOTA: Los tiempos de curado más largos reducirían el contenido de humedad y restringirían la motilidad del enjambre.

2. Crecimiento de E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1

1. Prepare 500 ml de medio LB agregando 5 g de triptona, 5 g de NaCl y 2.5 g de extracto de levadura en _ddH2O, y complete la solución a 500 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C y guárdela a 4 °C.
2. Prepare 100 ml de medio lb-agar al 1,5% (p/v) agregando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extracto de levadura y 1,5 g de agar en _ddH2O y rellene la solución a 100 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C. Transfiera el medio a un baño de agua a 50 °C para evitar que el agar se solidifique.
3. Cuando el matraz medio LB-agar sea cómodo de sostener, agregue 20 ml de medio LB-agar en una placa de Petri (10 cm de diámetro) con una pipeta de 25 ml. Deje el plato a temperatura ambiente durante la noche y guarde el plato de agar LB a 4 °C.
4. Tome cultivos de inventario almacenados a -80 °C, cepas de E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PAO1-YdeH en placas de Petri de agar LB utilizando bucles de inoculación desechables. Incubar las placas de Petri invertidas durante la noche a 37 °C.
5. Elija colonias individuales para diferentes cepas de las placas de Petri, inocule cada colonia en 5 ml de medio LB e incube el cultivo a 37 ° C en un agitador orbital de laboratorio a 220 rpm.
6. Cuando la densidad de cultivo alcance _OD600nm ~ 1.0, retire el cultivo del agitador y colóquelo a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de cultivo a _OD600nm = 1.0, como se describe en el paso 3.2.1.

3. Inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente

1. Preparación de pocillos de inoculación
   NOTA: Se pueden utilizar modelos de cubiertas de impresión 3D capaces de generar pozos separados por una distancia estándar en lugar del método que se describe a continuación (Figura suplementaria S1).
   1. Marque las posiciones de los pozos en el papel A4 que se muestra en la Figura 1C. Establezca tres concentraciones de prueba en una placa de Petri cuadrada con dos o tres réplicas.
   2. Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 μL en la superficie media semisólida en la posición marcada. Presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.
   3. Cuando la punta toque la parte inferior, no aplique fuerza vertical a la punta; Gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico.
   4. Mueva horizontalmente las puntas de la pipeta a lo largo de una distancia muy pequeña para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta mientras sostiene la pipeta con el pulgar y el dedo medio.
   5. Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae.
      NOTA: Si el contenido del pozo se desliza, aplique un poco más de presión con el dedo índice para sellar completamente la punta.
   6. Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.5 en cada posición marcada. Cubra la placa de enjambre antes de la inoculación.
2. Inoculación e incubación de placas de gradiente
   1. Ajuste la densidad de cultivo de crecimiento durante la noche a _OD600nm = 1.0.
   2. Pipetear 80 μL de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. No derrame el cultivo bacteriano fuera de los pozos.
   3. Envuelva las placas con una película de sellado. Para la observación a largo plazo (3-5 días), envuelva las placas con cinta de goma de laboratorio estéril.
      NOTA: Es menos probable que la cinta de goma se rompa.
   4. Coloque un vaso de precipitados lleno de _ddH2O en la incubadora para mantener la humedad dentro de la incubadora. Incubar las placas de enjambre de gradiente a 37 °C.
      NOTA: No incube las placas de enjambre al revés; esto hará que el cultivo bacteriano se escape de los pozos.
   5. Imagine la placa de enjambre inmediatamente después de la inoculación, registrando esto como el punto de tiempo de 0 h .

4. Imágenes del enjambre de la superficie bacteriana

1. Saque las placas de enjambre, una a la vez, de la incubadora cada 12 h, sosteniendo la placa horizontalmente, y colóquelas en el sistema de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: No deje huellas dactilares en la superficie de las placas; sostenga el costado de la placa de enjambre con guantes limpios.
2. Seleccione el modo de imagen de gel ; exponer la placa de enjambre a la luz blanca; y ajustar la distancia focal para dar la vista más clara de los enjambres.
   NOTA: Utilice la misma distancia focal para todas las placas de un lote determinado.
3. Mejore el brillo de los enjambres para una observación clara ajustando el tiempo de exposición a 300 ms. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.
   NOTA: El umbral se ajusta en la interfaz operativa del sistema de imágenes en gel. Aumente los valores a la izquierda para minimizar la interferencia de la luz de fondo; disminuir los valores a la derecha para mejorar el brillo de los enjambres. En este protocolo, la región suele estar entre 6.000 y 50.000.
4. Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del gradiente y las deformaciones en un archivo .txt .

5. Cuantifique el área del enjambre utilizando el software ImageJ

1. Importe el archivo de imagen adquirido mediante el sistema de imágenes en gel.
2. Establezca la barra de escala utilizando el software ImageJ y aplíquela a todas las imágenes.
   1. Cree un segmento de línea que marque la longitud del tablero haciendo clic en la herramienta de línea.
   2. Haga clic en Analizar | Establezca Escala para abrir la ventana Establecer escala .
   3. Escriba la longitud real en Distancia conocida y Unidad de longitud.
      NOTA: Debido a que se utilizaron placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm en este trabajo, la longitud real es '130', y la unidad de longitud es 'mm'.
   4. Marque la casilla Global .
   5. Insertar una barra de escala haciendo clic en Analizar | Herramientas | Barra de escala, escriba Ancho en mm, Alto en píxeles, Tamaño de fuente y seleccione Color, Fondo y Ubicación en el menú desplegable. Alternativamente, elija Texto en negrita, Ocultar texto, Fuente Serif y Superposición marcando las casillas de verificación.
      NOTA: La elección de esos parámetros está determinada por los usuarios y las propiedades de las imágenes. En este protocolo, el ancho en mm se estableció en 25, el alto en píxeles en 20, el tamaño de fuente en 80 y la barra de escala se colocó en la esquina inferior derecha seleccionando Ubicación | Abajo a la derecha. Otros parámetros pueden ser elegidos por el usuario.
3. Haga clic en Procesar | Sombras para mejorar la nitidez de la imagen, especialmente los límites (Figura suplementaria S2A). Haga clic en Procesar | Lote para procesar imágenes.
   NOTA: El propósito de este paso es proporcionar una demarcación de límites más precisa.
   1. Procese una imagen como referencia haciendo clic en Procesar | Sombras | Sur.
   2. Haga clic en Procesar | | por lotes Macro para abrir la ventana Proceso por lotes . Busque los siguientes comandos que se muestran en la ventana:
      run("Sur");
      run("Guardar");
      cerrar();
   3. Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales y la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes .
      NOTA: Se recomienda exportar imágenes con sombras a otra carpeta y conservar una copia de las imágenes originales.
4. Utilice la herramienta Varita (trazado) para seleccionar enjambres individualmente y ajustar la tolerancia ( herramienta Varita (trazado)) hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre (Figura suplementaria S2B).
   NOTA: Primero, haga clic en la herramienta Varita (rastreo) y seleccione un enjambre en una imagen. Si los límites no se han representado correctamente, haga doble clic en la herramienta Varita (trazado) para abrir las ventanas herramienta Varita , donde se puede ajustar la Tolerancia .
5. Haga clic en Analizar | Medida para exportar el valor del área.
6. Repita los pasos 5.1.1-5.1.5 hasta que se midan todos los enjambres, guarde los resultados en un archivo .csv para su posterior análisis.

Resultados

El flujo de trabajo que consiste en la preparación de placas de enjambre de gradiente, inoculación e incubación se muestra en la Figura 1B. Para generar placas de natación de gradiente, el medio de la capa inferior se vierte en platos apuntalados a ~ 4.3 ° desde el plano horizontal (Figura suplementaria S3), seguido de verter el medio de la capa superior después de que la capa inferior esté completamente solidificada. La composición del medio de doble capa se muestra...

Discusión

La investigación de la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente semisólido puede ser una tarea ^{desafiante18,19,20}, ya que involucra múltiples factores como la viscosidad del sustrato, la humedad y los componentes medios. Entre estos factores, la concentración de agar juega un papel decisivo en la determinación de la reversión microbiana a la motilidad de natación o enjambre. A medida que la concentración ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes	Bkman	B-SLPYM130F	Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28