כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

Summary

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

Abstract

תנועתיות נוהרת חיידקית היא פנוטיפ מיקרוביולוגי נפוץ שקהילות חיידקים משתמשות בו כדי לנדוד על פני משטחים חצי-קוליים. בחקירות של תנועתיות נחיל המושרה, ריכוז ספציפי של ממריץ לא יוכל לדווח על אירועים המתרחשים בטווח הריכוז האופטימלי כדי לעורר את התגובות הרצויות ממין. לוחות semisolid המכילים ריכוזים מרובים משמשים בדרך כלל כדי לחקור את התגובה בתוך טווח ריכוז ממריץ. עם זאת, לוחות חצי-סוליד נפרדים מגבירים את הווריאציות בצמיגות בינונית ובתכולת לחות בתוך כל צלחת עקב זמן התגבשות לא יוניפורמי.

מאמר זה מתאר שיטה חד-שלבית לבדיקת תנועתיות נוהרת משטח בו זמנית על צלחת הדרגתית אחת, שבה בארות הבדיקה המסודרות באופן איזומטרי מאפשרות רכישה סימולטנית של תגובות רב-מרכזיות. בעבודה הנוכחית, נחיל פני השטח של Escherichia coli K12 ו Pseudomonas aeruginosa PAO1 הוערכו בתגובה שיפוע ריכוז של ממריצים כגון רזברטרול ו arabinose. מעת לעת, המורפולוגיות של הנחיל צולמו באמצעות מערכת הדמיה כדי ללכוד את כל תהליך נחיל פני השטח.

המדידה הכמותית של מורפולוגיות הנחיל נרכשה באמצעות תוכנת ImageJ, המספקת מידע ניתן לניתוח של אזור הנחיל. מאמר זה מציג שיטת לוח נחיל שיפוע פשוט המספקת מידע איכותי וכמותי על ההשפעות של הממריצים על נחיל פני השטח, אשר ניתן להרחיב כדי ללמוד את ההשפעות של ממריצים אחרים על מגוון רחב יותר של מינים חיידקיים רגש.

Introduction

תנועתיות נוהרת חיידקית מתייחסת להגירה קולקטיבית של תאים חיידקיים על פני השטח של חומר. בנוסף לוחות אגר semisolid שהוכנו במיוחד ^{במעבדה1}, פנוטיפ זה נצפה גם על כמה מצעים רכים כגון רקמות בעלי ^חיים2, משטחים ^hydrated3, ושורשי ^צמחים4. בעוד משטח חצי-סוליד נחשב לאחד התנאים הבסיסיים עבור נחיל חיידקים, מינים מסוימים דורשים גם מדיום עשיר באנרגיה כדי לתמוך תנועתיות הנוהרת ^שלהם5. סיבוב פלאגלה מפעיל הן שחייה והן שחיית תנועתיות שורצת מתאר את תנועתיות חד-תאית בתוך סביבה נוזלית, ואילו נחיל הוא תנועה סינכרונית של אוכלוסייה מיקרוביאלית על פני משטחים חצי-קוליים.

צמיגות מצע משפיעה על תנועתיות חיידקים; מחקרים של חיידקים פתוגניים, כגון הליקובקטר פילורי, הראו כי תנועתיות הפתוגן משתנה בהתאם לצמיגות שכבת המוצין, המושפעת מהחמצה סביבתית במארח ^{האנושי6}. כדי לשכפל סביבות אלה, מחקרים קודמים באמצעות ריכוז אגר מעל 0.3% (w / v) להגביל תנועתיות שחייה חיידקית כדי לבצע שינוי הדרגתי לתוך נחיל פני השטח. השימוש בריכוז אגר מעל 1% (w / v) מונע את תנועתיות נחיל של מינים ^רבים7. דפוסי המושבה הנוצרים על פני השטח הם מגוונים, כולל ^mat8 ללא תכונות, עין ^שור9, dendrites10, ו מערבולת11.

למרות הרלוונטיות של דפוסים כאלה עדיין לא ברור, דפוסים אלה נראים תלויים רמזים סביבתיים ^{וכימיים12}. רמזים סביבתיים מכסים היבטים שונים, כולל טמפרטורה, מליחות, אור ו- pH, ואילו רמזים כימיים כוללים נוכחות של מולקולות חישת מניין מיקרוביאלי, תוצרי לוואי ביוכימיים וחומרים מזינים. מולקולות איתות של מניין Autoinducer כגון AHL (לקטון הומוסרין N-hexanoyl-L) יכול להשפיע על נחיל פני השטח על ידי ויסות הייצור של פעילי ^שטח13,14. רזברטרול, תרכובת פיטואלקסין, יכול להגביל תנועתיות נחיל ^{חיידקים15}.

בעבודה הנוכחית, אנו חוקרים את ההשפעה של ריכוזים הדרגתיים של רזברטרול על סוג בר Escherichia coli K12 זן ולחקור תנועתיות נחיל arabinose-inducable של מהונדס E. coli K12-YdeH ו Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH מינים. הייצור של האנזים YdeH מושרה על ידי arabinose באמצעות מקדם araBAD, וכתוצאה מכך הפרעה c-di-GMP הסלולר והשפעה על תנועתיות נוהר ^{חיידקים16,17}. התנהגות נחיל בלתי ניתנת לחינוך זו נחקרת באמצעות לוחות נחיל הדרגתיים arabinose עם E. coli K12-YdeH ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים.

לוחות הנחיל ההדרגתיים מוכנים על-ידי מיצוק רציף של מדיום דו-שכבתי (איור 1B). השכבה התחתונה כוללת את המדיום שנוסף עם הממריץ, שנמזג על צד אחד של צלחת פטרי. עם התגבשות השכבה התחתונה, צלחת הפטרי מוחזרת למשטח שטוח, שם מוסיפים את השכבה העליונה המכילה את המדיום ללא הממריץ מהצד השני של הצלחת. לאחר שליחות הנחיל מתגמצמים לחלוטין, בארות ההחזקה המסודרות באופן איזומטרי מיוצרות על ידי חורים משעממים בלוחות הנחיל לאחר פריסה קבועה (איור 1C) או על ידי הטבעת הבארות באמצעות דגם מודפס תלת-ממדי של כיסוי הלוח המכיל יתדות במהלך תהליך הריפוי הבינוני (איור S1 משלים). מערכת דימות ג'ל משמשת ללכידת המורפולוגיות הנוהרות בנקודות זמן שונות (איור 2). ניתוח נחיל פני השטח באמצעות תוכנת ImageJ (איור S2 משלים) מספק תוצאות כמותיות של תהליך נחיל פני השטח (איור 3).

לכן, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי לבדוק את תנועתיות נחיל פני השטח בתוך טווח ריכוז של ממריצים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבדוק תגובות ריכוז מרובות של ממריצים אחרים על ידי ערבוב הממריץ למדיום השכבה התחתונה והוא יכול להיות מיושם על מינים אחרים של רגש (למשל, Bacillus subtilis, סלמונלה enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). גישה זו יכולה לספק תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות להקרנת ממריץ כימי יחיד, וניתן להשתמש בלוחות נפרדים כדי להעריך יותר ממריצים כימיים.

Protocol

1. הכנת לוחות נחיל הדרגתיים

1. הכנת מדיום נחיל
   הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת השוואה קצרה של צמיגות בינונית שונה; 0.7% (w / v) ריכוז אגר של מדיום נחיל שימש בפרוטוקול זה.
   1. להכין אבקת מרק Lysogeny (LB) עם אגר בשני בקבוקונים חרוטיים; כל בקבוק מכיל 2 גרם טריפטון, 2 גרם של נתרן כלורי, 1 גרם של תמצית שמרים, ו 1.4 גרם של אגר. מוסיפים מים מזוקקים כפול (_ddH2O) ומערבבים את המתלה באמצעות מוט ערבוב מגנטי. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 200 מ"ל על-ידי הוספת _ddH2O נוסף.
   2. Autoclave את הפתרון ב 121 °C (50 °F) במשך 20 דקות. השתמשו בכובע חדיר לאוויר או בסרט איטום בקבוקים עם פתח אוורור.
      הערה: אגר יתמוסס כאשר מחומם ב autoclave.
   3. כאשר הטמפרטורה יורדת ל 65 °C (65 °F), לערבב את הפתרון כדי להבטיח הומוגניות, ולהעביר את המדיום לחממה 65 °C (65 °F) או אמבט מים לשימוש לטווח קצר.
2. הכנת מדיום נחיל השכבה התחתונה
   הערה: המדיום בשכבה התחתונה הוא התערובת של פתרונות מלאי בינוניים וממריצים של נחיל. הניסוח של לוחות נחיל הדרגתיים ממריץ מוצג בטבלה 1.
   1. הכן פתרון מלאי רזברטרול 100 mM על ידי המסת 114.12 מ"ג של אבקת רזברטרול lyophilized לתוך 5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ולאחסן את הפתרון ב -20 °C (60 °F).
   2. הכן פתרון 20% (w / v) מניית arabinose על ידי המסת 6 גרם של אבקת arabinose ב 30 מ"ל של _ddH2O; לחכות 10-15 דקות כדי לאפשר arabinose להתמוסס; ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
   3. להוציא את המדיום מן האינקובטור 65 °C (65 °F) ומניחים אותו בטמפרטורת החדר; אפשר למדיום הנחיל להתקרר עד שבקבוק ארלנמייר יהיה קריר מספיק כדי להחזיק (~ 50 מעלות צלזיוס). אין למקם את מדיום הנחיל בטמפרטורת החדר לתקופות ארוכות, שכן זה יגרום להתגבשות אגר.
   4. הוסף את הנפח הנדרש של פתרון מלאי הממריץ למדיום הנחיל בטמפרטורה של 50 °C (טבלה 1). השתמש פיפטה כדי לחלק את התמיסה הממריץ במקום לשפוך אותו. מערבבים בעדינות כדי לערבב את הממריץ עם מדיום הנחיל.
      הערה: שלב זה מיועד ממריצים שלא ניתן לשעבד באופן אוטומטי. היזהר לא להכניס בועות למדיום.
3. הכנת לוחות נחיל הדרגתיים דו-שכבתיים
   הערה: המדיום בשכבה העליונה הוא בינוני LB המכיל 0.7% (w/v) אגר.
   1. סמן 13 x 13 ס"מ מרובע פטרי מנות עם שם וזנים ממריצים, והצמד את הכלים מעל קצה המכסים (איור 1B).
   2. יש להוסיף 40 מ"ל חום בשכבה התחתונה בינונית (50°C) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
      הערה: לחלופין, עבור 13 x 13 ס"מ מרובע פטרי מנות, 40 מ"ל שכבה תחתונה בינוני שכבה עליונה מתאימה; עבור 10 x 10 ס"מ מרובע פטרי מנות, 25 מ"ל שכבה תחתונה מדיום שכבה עליונה מתאים.
   3. אפשר למדיום השכבה התחתונה לרפא שנחשף במשך 1 שעות בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי. אל תפריעו למנות פטרי המרובעות בזמן שהמדיום מתמצק.
      הערה: בעת ריפוי השכבה התחתונה, מדיום נחיל לא מכיל ממריצים צריך להישמר בחממה של 65 מעלות צלזיוס או באמבט מים.
   4. ברגע שהשכבה התחתונה מתגבשת לחלוטין, הסירו את המכסים והניחו את צלחות הפטרי המרובעות בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי.
   5. יש להוסיף 40 מ"ל של מדיום חם מהשכבה העליונה (50°C) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
      הערה: מדיום השכבה העליונה אינו מכיל ממריצים.
   6. לרפא את הלוחות הדו שכבתיים על הספסל מכוסה וללא הפרעה במשך 1 שעות. יש לאחסן את הצלחות המוכנות בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך עד 24 שעות.
      הערה: זמני ריפוי ארוכים יותר יפחיתו את תכולת הלחות ויגבילו את תנועתיות הנחיל.

2. צמיחה של E. coli K12 ו - P. aeruginosa PAO1

1. הכן 500 מ"ל של בינוני LB על ידי הוספת 5 גרם של טריפטון, 5 גרם של NaCl, ו 2.5 גרם של תמצית שמרים לתוך _ddH2O, ולמעלה את הפתרון ל 500 מ"ל. Autoclave את הפתרון על מחזור נוזלי במשך 20 דקות ב 121 °C (65 °F), ולאחסן אותו ב 4 °C (65 °F).
2. הכן 100 מ"ל של 1.5% (w / v) LB-אגר בינוני על ידי הוספת 1 גרם של טריפטון, 1 גרם של NaCl, 0.5 גרם של תמצית שמרים, ו 1.5 גרם אגר לתוך _ddH2O ולהעלות את הפתרון ל 100 מ"ל. Autoclave את הפתרון על מחזור נוזלי במשך 20 דקות ב 121 °C (50 °F). מעבירים את המדיום לאמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע את ההתמצקות של אגר.
3. כאשר הבקבוקון הבינוני LB-אגר נוח לאחיזה, מוסיפים 20 מ"ל של מדיום LB-אגר לצלחת פטרי (בקוטר 10 ס"מ) באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ואחסנו את צלחת ה-LB-אגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. קח תרביות מלאי המאוחסנות ב -80 °C (80 °F), פס E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1, ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים על צלחות LB-אגר פטרי באמצעות לולאות חיסון חד פעמיות. דגירה מנות פטרי הפוך לילה ב 37 °C (50 °F).
5. בחר מושבות בודדות עבור זנים שונים מן מנות פטרי, לחסן כל מושבה לתוך 5 מ"ל של LB בינוני, ודגר את התרבות ב 37 °C (50 °F) בשייקר מסלולית מעבדה להגדיר ב 220 סל"ד.
6. כאשר צפיפות התרבות מגיעה _OD600nm ~ 1.0, להסיר את התרבות מן השייקר ולמקם אותו בטמפרטורת החדר. התאם את צפיפות התרבות ל- _OD600nm = 1.0, כמתואר בשלב 3.2.1.

3. חיסון ודירה של לוחות נחיל הדרגתיים

1. הכנת בארות חיסון
   הערה: ניתן להשתמש בדגמי כיסוי להדפסה בתלת-ממד המסוגלים ליצור בארות המופרדות על ידי מרחק סטנדרטי במקום בשיטה המתוארת להלן (איור S1 משלים).
   1. סמנו את מיקומי הבאר על נייר A4 המוצג באיור 1C. הגדר שלושה ריכוזי בדיקה בצלחת פטרי מרובעת אחת עם שניים או שלושה העתקים.
   2. מניחים את נייר ה- A4 המסומן מתחת ללוח הדרגתי ממוצק. דחוף את הצד הרחב יותר של קצה פיפטה 100 μL לתוך המשטח הבינוני למחצה במיקום המסומן. הקש על קצה הפיפטה עד שתגיע לתחתית המדיום של השכבה העליונה.
   3. כאשר הקצה נוגע בתחתית, אין להפעיל כוח אנכי על הקצה; סובב בעדינות את הקצה כדי לבודד את התוכן של הבאר הגלילית.
   4. הזז אופקית את קצות הפיפטה לאורך מרחק קטן מאוד כדי לאפשר זרימת אוויר למקום הצר המוקצה בצד. לחץ על הקצה עם האצבע המורה כדי לחסום את זרימת הגז בתוך הקצה תוך החזקת פיפטה באמצעות האגודל והאצבע האמצעית.
   5. משוך את הקצה החוצה אנכית, שמירה על תוכן הבאר בקצה תוך משיכתו החוצה.
      הערה: אם תוכן הבאר מחליק, יש להפעיל מעט יותר לחץ עם האצבע המורה כדי לאטום לחלוטין את הקצה.
   6. חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.5 בכל מיקום מסומן. לכסות את צלחת הנחיל לפני החיסון.
2. חיסון ודגרה של צלחת הדרגתית
   1. התאם את צפיפות תרבות הצמיחה הלילית ל- _OD600nm = 1.0.
   2. פיפטה 80 μL של תרבות הצמיחה הלילה לתוך כל באר. אין לשפוך את תרבית החיידקים מחוץ לבארות.
   3. לעטוף את הצלחות עם סרט איטום. לתצפית ארוכת טווח (3-5 ימים), לעטוף את הצלחות עם סרט גומי מעבדה סטרילי.
      הערה: סרט גומי נוטים פחות להישבר.
   4. מניחים מלאה _ddH2O בחממה כדי לשמור על לחות בתוך האינקובטור. דגירה את לוחות נחיל שיפוע ב 37 °C (50 °F).
      הערה: אין לדגור על לוחות הנחיל הפוך; זה יגרום לתרבות החיידקים לדלוף מהבארות.
   5. דמיינו את לוחית הנחיל מיד לאחר החיסון, ורשמו את זה כנקודת הזמן של 0 שעות .

4. הדמיית משטח חיידקי נוהר

1. מוציאים את לוחות הנחיל, אחד בכל פעם, מהחממה כל 12 שעות, מחזיקים את הצלחת אופקית, ומניחים אותם במערכת הדמיית הג'ל (ראו טבלת החומרים).
   הערה: אין להשאיר טביעות אצבע על פני הלוחות; להחזיק את הצד של צלחת נחיל עם כפפות נקיות.
2. בחר מצב הדמיית ג'ל ; לחשוף את צלחת הנחיל לאור לבן; ולהתאים את אורך המוקד כדי לתת את התצוגה הברורה ביותר של נחילים.
   הערה: השתמש באותו אורך מוקד עבור כל הלוחות באצווה נתונה.
3. שפר את הבהירות של הנחילים לתצפית ברורה על ידי התאמת זמן החשיפה ל-300 אלפיות השנייה. התאם את הסף כדי למזער הפרעות מנורית הרקע.
   הערה: הסף מותאם בממשק ההפעלה של מערכת הדמיית הג'ל. הגדל ערכים משמאל כדי למזער הפרעות מאורות הרקע; הקטנת ערכים מימין כדי לשפר את הבהירות של הנחילים. בפרוטוקול זה, האזור הוא בדרך כלל בין 6,000 ל -50,000.
4. שמור את קובץ התמונה לניתוח נוסף. הקלט את זמן ההדמיה, סוג הממריץ, כיוון מעבר הצבע והזנים בקובץ .txt .

5. לכמת את אזור הנחיל באמצעות תוכנת ImageJ

1. יבא את קובץ התמונה שנרכש באמצעות מערכת הדמיית הג'ל.
2. הגדר את סרגל קנה המידה באמצעות תוכנת ImageJ והחל אותו על כל התמונות.
   1. צור מקטע קו המסמן את אורך הלוח על-ידי לחיצה על כלי הקו.
   2. לחץ על נתח | הגדר קנה מידה כדי לפתוח את החלון הגדרת קנה מידה .
   3. הקלד את האורך הממשי במרחק ידוע וביחידת אורך.
      הערה: מכיוון שנעשה שימוש במנות פטרי בגודל 13 x 13 ס"מ מרובעות בעבודה זו, האורך בפועל הוא '130', ויחידת האורך היא 'מ"מ'.
   4. סמן את התיבה כללי .
   5. הוסף סרגל קנה מידה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | סרגל קנה מידה, הקלד רוחב במ"מ, גובה בפיקסלים, גודל גופן ובחר צבע, רקע ומיקום מהתפריט הנפתח. לחלופין, בחר טקסט מודגש, הסתר טקסט, גופן Serif ושכבת-על על-ידי סימון תיבות הסימון.
      הערה: הבחירה של פרמטרים אלה נקבעת על-ידי המשתמשים ומאפייני התמונות. בפרוטוקול זה, רוחב במ"מ הוגדר ל - 25, גובה בפיקסלים ל - 20, גודל גופן ל - 80 וסרגל קנה המידה הוצב בפינה השמאלית התחתונה על-ידי בחירה באפשרות מיקום | ימינה למטה. משתמש יכול לבחור פרמטרים אחרים.
3. לחץ על תהליך | צללים לשיפור חדות התמונה, במיוחד הגבולות (איור S2A משלים). לחץ על תהליך | אצווה לעיבוד תמונות.
   הערה: מטרת שלב זה היא לספק תיחום גבולות מדויק יותר.
   1. עבד תמונה כהפניה על-ידי לחיצה על תהליך | צללים | דרום.
   2. לחץ על תהליך | | אצווה מאקרו לפתיחת החלון תהליך אצווה . חפש את הפקודות הבאות המוצגות בחלון:
      run("South");
      להפעיל("שמור");
      סגור();
   3. הקלד את כתובת התיקיה של התמונות המקוריות ואת כתובת קובץ הפלט על-ידי לחיצה על תהליך בחלון תהליך אצווה .
      הערה: מומלץ לייצא תמונות עם צללים לתיקיה אחרת ולשמור עותק של התמונות המקוריות.
4. השתמשו בכלי שרביט (עקיבה) כדי לבחור נחילים בנפרד ולהתאים את הסבילות (לחץ פעמיים על הכלי שרביט (עקיבה) עד שהקו שנוצר יתאים כראוי לגבול הנחיל (איור S2B משלים).
   הערה: ראשית, לחץ על הכלי שרביט (מעקב) ובחר נחיל בתמונה אחת. אם הגבולות לא תוארו כראוי, לחץ פעמיים על הכלי שרביט (מעקב) כדי לפתוח את חלונות כלי השרביט , שם ניתן להתאים את הרגישות .
5. לחץ על נתח | מדוד כדי לייצא את ערך האזור.
6. חזור על שלבים 5.1.1-5.1.5 עד שכל הנחילים יימדדו, שמור את התוצאות בקובץ .csv לניתוח נוסף.

תוצאות

זרימת העבודה המורכבת מהכנת לוחות נחיל הדרגתיים, חיסון ודגרה מוצגת באיור 1B. כדי ליצור לוחות שחייה הדרגתיים, המדיום של השכבה התחתונה נשפך לתוך כלים נפוחים ב~4.3° מהמישור האופקי (איור S3 משלים), ולאחר מכן שופך את המדיום של השכבה העליונה לאחר שהשכבה התחתונה מתגובקת לחלוט...

Discussion

חקירה של תנועתיות נחיל חיידקים על לוחות הדרגתיים חצי-אולידים יכולה להיות משימה מאתגרת 18,19,20, שכן היא כוללת גורמים רבים כגון צמיגות מצע, לחות ורכיבים בינוניים. בין גורמים אלה, ריכוז אגר ממלא תפקיד מכריע בקביעת חזרה מיקרוביאלית לשחייה או תנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes	Bkman	B-SLPYM130F	Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28