Количественная оценка подвижности роя бактериальной поверхности на градиентных пластинах индуктора

Резюме

Здесь мы описываем использование пластин градиента индуктора для оценки подвижности бактериального роя при одновременном получении множественных реакций концентрации.

Аннотация

Бактериальная роевая подвижность является распространенным микробиологическим фенотипом, который бактериальные сообщества используют для миграции по полутвердым поверхностям. При исследованиях индуцированной роевой подвижности специфическая концентрация индуктора может быть не в состоянии сообщить о событиях, происходящих в пределах оптимального диапазона концентраций, чтобы вызвать желаемые ответы у вида. Полутвердые пластины, содержащие несколько концентраций, обычно используются для исследования реакции в диапазоне концентраций индуктора. Однако отдельные полутвердые пластины увеличивают изменения вязкости среды и содержания влаги в каждой пластине из-за неравномерного времени затвердевания.

В данной работе описан одноэтапный метод одновременного испытания подвижности роя поверхности на одной градиентной пластине, где изометрически расположенные испытательные скважины позволяют одновременно получать мультиконцентрационные ответы. В настоящей работе поверхностное роение Escherichia coli K12 и Pseudomonas aeruginosa PAO1 оценивали в ответ на градиент концентрации индукторов, таких как ресвератрол и арабиноза. Периодически морфологии роя визуализировались с использованием системы визуализации для захвата всего процесса роения поверхности.

Количественное измерение морфологии роя было получено с помощью программного обеспечения ImageJ, предоставляющего анализируемую информацию о области роя. В данной работе представлен простой метод градиентных роевых пластин, который предоставляет качественную и количественную информацию о влиянии индукторов на поверхностное роение, которая может быть расширена для изучения воздействия других индукторов на более широкий спектр подвижных видов бактерий.

Введение

Бактериальная роевая подвижность относится к коллективной миграции бактериальных клеток по поверхности вещества. В дополнение к полутвердым агаровым пластинам, специально подготовленным в ^{лаборатории1}, этот фенотип также наблюдается на некоторых мягких субстратах, таких как ткани ^{животных2}, гидратированные ^{поверхности3} и корни ^{растений4}. В то время как полутвердая поверхность считается одним из фундаментальных условий для бактериального роения, некоторым видам также требуется богатая энергией среда для поддержки их роевой ^{подвижности5}. Вращение жгутиков как плавает, так и роевая подвижность - плавание описывает одноклеточную подвижность в жидкой среде, тогда как роение - это синхронное движение микробной популяции по полутвердым поверхностям.

Вязкость субстрата влияет на подвижность бактерий; Исследования патогенных микробов, таких как Helicobacter pylori, показали, что подвижность возбудителя изменяется в зависимости от вязкости слоя муцина, на которую влияет закисление окружающей среды в организме ^{человека-хозяина6}. Чтобы воспроизвести эти среды, более ранние исследования с использованием концентрации агара выше 0,3% (мас./об.) ограничивают подвижность бактериального плавания, чтобы обеспечить постепенный переход к поверхностному роению. Использование концентрации агара выше 1% (мас./об.) предотвращает роение подвижности многих ^видов7. Колониальные узоры, образующиеся на поверхности, разнообразны, включая безликий ^mat8, бычий ^глаз9, дендриты10 и вихрь11.

Хотя актуальность таких моделей остается неясной, эти модели, по-видимому, зависят от экологических и химических ^{сигналов12}. Экологические сигналы охватывают различные аспекты, включая температуру, соленость, свет и рН, тогда как химические сигналы включают присутствие молекул микробного кворума, биохимических побочных продуктов и питательных веществ. Сигнальные молекулы, чувствительные к кворуму, такие как AHL (N-гексаноил-L гомосерин лактон), могут влиять на поверхностное роение, регулируя выработку поверхностно-активного ^{вещества13,14}. Ресвератрол, соединение фитоалексинов, может ограничить подвижность бактериального ^роя15.

В настоящей работе исследуется влияние градиентных концентраций ресвератрола на штамм Escherichia coli K12 дикого типа и исследуется арабиноза-индуцируемая роевая подвижность инженерных видов E. coli K12-YdeH и Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. Производство фермента YdeH индуцируется арабинозой через промотор araBAD, что приводит к клеточному возмущению c-di-GMP и влияет на подвижность бактериального ^{роения16,17}. Это индуцируемое роевое поведение изучается с использованием арабинозных градиентных роевых пластин с штаммами E. coli K12-YdeH и P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Градиентные роевые пластины получают путем последовательного затвердевания двухслойной среды (рис. 1В). Нижний слой содержит среду, добавленную с индуктором, вылитую на одну сторону подпираемой чашки Петри. После затвердевания нижнего слоя чашка Петри возвращается на плоскую поверхность, где верхний слой, содержащий среду без индуктора, добавляется с другой стороны пластины. После того, как роевые пластины полностью затвердевают, изометрически расположенные удерживающие скважины получают путем бурения отверстий на роевых пластинах по фиксированной компоновке (рисунок 1C) или путем отпечатывания скважин с использованием 3D-печатной модели крышки пластины, содержащей колышки, во время процесса отверждения среды (дополнительный рисунок S1). Гелевая система визуализации используется для захвата роевых морфологий в разные моменты времени (рисунок 2). Анализ поверхностного роения с помощью программного обеспечения ImageJ (дополнительный рисунок S2) дает количественные результаты процесса поверхностного роения (рисунок 3).

Таким образом, мы предлагаем простой метод проверки подвижности роя поверхности в диапазоне концентраций индукторов. Этот метод может быть использован для проверки множественных реакций концентрации других индукторов путем смешивания индуктора в среде нижнего слоя и может быть применен к другим подвижным видам (например, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Этот подход может обеспечить надежные качественные и количественные результаты для скрининга одного химического индуктора, и отдельные пластины могут быть использованы для оценки большего количества химических индукторов.

протокол

1. Подготовка градиентных роевых пластин

1. Подготовка роевой среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое сравнение различных вязкостей среды см. в разделе обсуждения; В этом протоколе использовалась 0,7% (мас./об.) концентрация агара роевой среды.
   1. Приготовить порошок лизогенного отвара (ЛБ) с агаром в двух конических колбах; каждая колба содержит 2 г триптона, 2 г хлорида натрия, 1 г дрожжевого экстракта и 1,4 г агара. Добавьте двойную дистиллированную воду (_ddH2O) и перемешайте суспензию с помощью магнитного перемешивателя. Отрегулируйте конечный объем до 200 мл, добавив дополнительный _ddH2O.
   2. Автоклав раствора при 121 °C в течение 20 мин. Используйте воздухопроницаемый колпачок или уплотнительную пленку для бутылок с вентиляционным отверстием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агар растворяется при нагревании в автоклаве.
   3. Когда температура опустится до 65 °C, смешайте раствор для обеспечения однородности и перенесите среду в инкубатор или водяную баню при температуре 65 °C для краткосрочного использования.
2. Подготовка нижнеслойной роевой среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда нижнего слоя представляет собой смесь роевой среды и индукторных растворов. Рецептура индукторных градиентных роевых пластин приведена в таблице 1.
   1. Готовят 100 мМ раствора ресвератрола, растворяя 114,12 мг лиофилизированного порошка ресвератрола в 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), и хранят раствор при -20 °C.
   2. Готовят 20% (мас./об.) раствор арабинозы, растворяя 6 г порошка арабинозы в 30 мл _ddH2O; подождите 10-15 мин, чтобы арабиноза растворилась; и хранить раствор при комнатной температуре.
   3. Выньте среду из инкубатора при температуре 65 °C и поместите ее при комнатной температуре; дайте роевой среде остыть до тех пор, пока колба Эрленмейера не станет достаточно прохладной для удержания (~50 °C). Не размещайте роевую среду при комнатной температуре в течение длительных периодов времени, так как это вызовет затвердевание агара.
   4. Добавьте необходимый объем раствора индуктора в роевую среду при 50 °C (таблица 1). Используйте пипетку, чтобы дозировать раствор индуктора вместо того, чтобы заливать его. Аккуратно закрутите, чтобы смешать индуктор с роевой средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для индукторов, которые не могут быть автоклавированы. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки в среду.
3. Подготовка двухслойных градиентных роевых пластин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхнеслойная среда представляет собой среду LB, содержащую 0,7% (мас./об.) агара.
   1. Нанесите на квадратные чашки Петри размером 13 х 13 см с индукторным названием и штаммами и подперете тарелки вверх по краю крышек (рисунок 1B).
   2. Добавьте 40 мл теплой нижнеслойной среды (50 °C) с помощью пипетки объемом 50 мл или центрифужной трубки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, для квадратных чашек Петри размером 13 х 13 см подходит нижняя и верхнеслойная среда объемом 40 мл; для чашки Петри размером 10 х 10 см квадрата подойдет нижний слой 25 мл и верхний слой среды.
   3. Дайте среде нижнего слоя отверждаться непокрытой в течение 1 ч внутри ламинарной вытяжки. Не мешайте квадратным чашкам Петри, пока среда затвердевает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отверждении нижнего слоя роевая среда, не содержащая индукторов, должна поддерживаться в инкубаторе или на водяной бане при температуре 65 °C.
   4. Как только нижний слой полностью затвердеет, снимите крышки и положите квадратные чашки Петри внутрь ламинарной вытяжки.
   5. Добавьте 40 мл теплой верхнеслойной среды (50 °C) с помощью пипетки объемом 50 мл или центрифужной трубки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда верхнего слоя не содержит индукторов.
   6. Отвержьте двухслойные пластины на столешнице, покрытой и нетронутой в течение 1 ч. Хранить подготовленные тарелки при температуре 4 °C до 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время отверждения уменьшит содержание влаги и ограничит подвижность роя.

2. Рост E. coli K12 и P. aeruginosa PAO1

1. Приготовьте 500 мл среды LB, добавив 5 г триптона, 5 г NaCl и 2,5 г дрожжевого экстракта в _ddH2O, и доливайте раствор до 500 мл. Автоклавируйте раствор на жидком цикле в течение 20 мин при 121 °C, и храните его при 4 °C.
2. Приготовьте 100 мл 1,5% (мас./об.) LB-агаровой среды, добавив 1 г триптона, 1 г NaCl, 0,5 г дрожжевого экстракта и 1,5 г агара в _ddH2O и долив раствор до 100 мл. Автоклав раствора на жидком цикле в течение 20 мин при 121 °C. Перенесите среду на водяную баню с температурой 50 °C, чтобы предотвратить затвердевание агара.
3. Когда колбу LB-агара удобно держать, добавьте 20 мл lb-агаровой среды в чашку Петри (диаметром 10 см) с помощью пипетки 25 мл. Оставьте пластину при комнатной температуре на ночь и храните пластину LB-агара при температуре 4 °C.
4. Возьмите культуры, хранящиеся при -80 °C, полосы E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PAO1-YdeH на чашках LB-агара Петри с использованием одноразовых петель прививки. Инкубируйте чашки Петри, перевернутые в течение ночи при 37 °C.
5. Соберите отдельные колонии для различных штаммов из чашки Петри, привите каждую колонию в 5 мл среды LB и инкубируйте культуру при 37 ° C в лабораторном орбитальном шейкере, установленном на 220 оборотах в минуту.
6. Когда плотность культуры достигнет _{OD600 нм} ~ 1,0, извлеките культуру из шейкера и поместите ее при комнатной температуре. Отрегулируйте плотность культуры до _OD600nm = 1,0, как описано в шаге 3.2.1.

3. Инокуляция и инкубация градиентных роевых пластин

1. Подготовка посевных скважин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо метода, описанного ниже,, можно использовать модели покрытия для 3D-печати, способные генерировать скважины, разделенные стандартным расстоянием (дополнительный рисунок S1).
   1. Отметьте позиции скважин на бумаге формата А4, показанные на рисунке 1С. Установите три тестовые концентрации в одну квадратную чашку Петри с двумя или тремя репликами.
   2. Поместите маркированную бумагу формата А4 под затвердевшую градиентную пластину. Протолкните более широкую сторону наконечника пипетки объемом 100 мкл на поверхность полутвердой среды в отмеченном положении. Прижимайте наконечник пипетки до тех пор, пока он не достигнет нижней части верхнего слоя среды.
   3. Когда наконечник касается дна, не прикладывайте вертикального усилия к наконечнику; осторожно поверните наконечник, чтобы изолировать содержимое цилиндрического колодца.
   4. Горизонтально переместите кончики пипетки на очень небольшое расстояние, чтобы обеспечить воздушный поток в узкое отведенное место. Нажмите на кончик указательным пальцем, чтобы заблокировать поток газа внутри кончика, удерживая пипетку большим и средним пальцами.
   5. Вытяните наконечник вертикально, удерживая содержимое колодца в наконечнике, вытаскивая его наружу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если содержимое скважины проскальзывает, приложите немного больше давления указательным пальцем, чтобы полностью запечатать наконечник.
   6. Повторите шаги 3.1.2-3.1.5 в каждой отмеченной позиции. Накройте роевую пластину перед прививкой.
2. Градиентная пластинчатая инокуляция и инкубация
   1. Отрегулируйте плотность культуры роста за ночь до _OD600nm = 1,0.
   2. Пипетка 80 мкл культуры ночного роста в каждую скважину. Не проливайте бактериальную культуру за пределы лунок.
   3. Оберните пластины уплотнительной пленкой. Для длительного наблюдения (3-5 дней) оберните пластины стерильной лабораторной резиновой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновая лента с меньшей вероятностью сломается.
   4. Поместите стакан, наполненный _ddH2O, в инкубатор для поддержания влажности внутри инкубатора. Инкубируйте градиентные роевые пластины при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте роевые пластины вверх ногами; это приведет к утечке бактериальной культуры из лунок.
   5. Визуализируйте роевую пластину сразу после прививки, записав это как точку времени 0 ч .

4. Визуализация роения бактериальной поверхности

1. Вынимайте роевые пластины, по одной, из инкубатора каждые 12 часов, удерживая пластину горизонтально, и поместите их в систему визуализации геля (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте отпечатков пальцев на поверхности пластин; держите боковую часть роевой пластины чистыми перчатками.
2. Выберите режим визуализации геля ; подвергать роевую пластину белому свету; и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы обеспечить наиболее четкое представление о роях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одинаковое фокусное расстояние для всех пластин в данной партии.
3. Увеличьте яркость роев для четкого наблюдения, регулируя время экспозиции до 300 мс. Отрегулируйте пороговое значение, чтобы свести к минимуму помехи от фонового света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Порог регулируется на операционном интерфейсе гелевой системы визуализации. Увеличьте значения слева, чтобы свести к минимуму помехи от фонового света; уменьшить значения справа, чтобы увеличить яркость роев. В этом протоколе регион обычно составляет от 6 000 до 50 000.
4. Сохраните файл изображения для дальнейшего анализа. Запишите время обработки изображений, тип индуктора, ориентацию градиента и деформации в файле .txt .

5. Количественная оценка области роя с помощью программного обеспечения ImageJ

1. Импортируйте файл изображения, полученный с помощью системы визуализации геля.
2. Установите шкалу масштаба с помощью программного обеспечения ImageJ и примените ее ко всем изображениям.
   1. Создайте сегмент линии, обозначающий длину доски, щелкнув инструмент «Линия».
   2. Нажмите «Анализировать |» Установите масштаб , чтобы открыть окно Задать масштаб .
   3. Введите фактическую длину в полях Известное расстояние и Единица длины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этой работе использовались квадратные чашки Петри размером 13 х 13 см, фактическая длина составляет «130», а единица длины — «мм».
   4. Установите флажок Глобальный .
   5. Вставьте шкалу масштаба, щелкнув Анализ | Инструменты | Шкала, введите Ширина в мм, Высота в пикселях, Размер шрифта и выберите Цвет, Фон и Расположение в раскрывающемся меню. Кроме того, можно выбрать Полужирный текст, Скрыть текст, Шрифт с засечками и Наложение , установив флажки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор этих параметров определяется пользователями и свойствами изображений. В этом протоколе ширина в мм была установлена на 25, высота в пикселях на 20, размер шрифта на 80, а шкала была помещена в правый нижний угол, выбрав Location | Внизу справа. Другие параметры могут быть выбраны пользователем.
3. Нажмите обработать | Тени для повышения резкости изображения, особенно границ (дополнительный рисунок S2A). Нажмите обработать | Пакетная обработка изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы обеспечить более точную демаркацию границ.
   1. Обработайте изображение в качестве ссылки, нажав на кнопку Процесс | Тени | Юг.
   2. Нажмите обработать | Пакетная | Макрос , чтобы открыть окно Пакетный процесс . Найдите следующие команды, отображаемые в окне:
      run("Юг");
      run("Сохранить");
      закрыть();
   3. Введите адрес папки исходных изображений и адрес выходного файла, щелкнув Обработать в окне Пакетный процесс .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспортировать изображения с тенями в другую папку и сохранить копию исходных изображений.
4. Используйте инструмент «Палочка» (трассировка) для выбора роев по отдельности и регулировки допуска (дважды щелкните инструмент «Палочка» (трассировка)), пока сгенерированная линия не будет правильно соответствовать границе роя (дополнительный рисунок S2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала нажмите инструмент «Палочка» (трассировка) и выберите рой на одном изображении. Если границы были отображены неправильно, дважды щелкните инструмент «Палочка» (трассировка ), чтобы открыть окна инструмента «Палочка», где можно настроить допуск .
5. Нажмите на Анализ | Мера для экспорта стоимости площади.
6. Повторяйте шаги 5.1.1-5.1.5 до тех пор, пока не будут измерены все рои, сохраните результаты в файл .csv для дальнейшего анализа.

Результаты

Рабочий процесс, состоящий из подготовки градиентных роевых пластин, инокуляции и инкубации, показан на рисунке 1B. Для получения градиентных плавающих пластин нижнюю слой среды заливают в подпертую посуду под ~4,3° от горизонтальной плоскости (дополнительный рисуно...

Обсуждение

Исследование подвижности бактериального роения на полутвердых градиентных пластинах может быть сложной задачей18,19,20, поскольку оно включает в себя множество факторов, таких как вязкость субстрата, влажность и компоненты среды. Среди ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes	Bkman	B-SLPYM130F	Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28