İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Özet

Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.

Özet

Bakteriyel sürü hareketliliği, bakteri topluluklarının yarı katı yüzeyler üzerinde göç etmek için kullandıkları yaygın bir mikrobiyolojik fenotiptir. İndüklenmiş sürü hareketliliğinin araştırılmasında, bir indükleyicinin spesifik konsantrasyonu, bir türden istenen yanıtları ortaya çıkarmak için optimal konsantrasyon aralığında meydana gelen olayları rapor edemeyebilir. Birden fazla konsantrasyon içeren yarı katı plakalar, bir indükleyici konsantrasyon aralığındaki yanıtı araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, ayrı yarı katı plakalar, düzgün olmayan katılaşma süresi nedeniyle her plakadaki orta viskozite ve nem içeriğindeki değişimleri arttırır.

Bu yazıda, izometrik olarak düzenlenmiş test kuyularının çok konsantrasyonlu yanıtların eşzamanlı olarak elde edilmesine izin verdiği tek bir gradyan plaka üzerinde yüzey kaynatma hareketliliğini aynı anda test etmek için tek adımlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada, Escherichia coli K12 ve Pseudomonas aeruginosa PAO1'in yüzey sürüsü, resveratrol ve arabinoz gibi indükleyicilerin konsantrasyon gradyanına yanıt olarak değerlendirilmiştir. Periyodik olarak, sürü morfolojileri, tüm yüzey kaynama sürecini yakalamak için bir görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi.

Sürü morfolojilerinin kantitatif ölçümü, sürü alanının analiz edilebilir bilgilerini sağlayan ImageJ yazılımı kullanılarak elde edildi. Bu yazıda, indükleyicilerin yüzey kaynaması üzerindeki etkileri hakkında kalitatif ve nicel bilgi sağlayan basit bir gradyan sürü plakası yöntemi sunulmaktadır; bu, diğer indükleyicilerin daha geniş bir hareketli bakteri türü yelpazesi üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilebilir.

Giriş

Bakteriyel kaynama hareketliliği, bakteri hücrelerinin bir maddenin yüzeyi boyunca toplu göçünü ifade eder. Laboratuvarda özel olarak hazırlanan yarı katı agar ^{plakalarına1} ek olarak, bu fenotip, hayvan ^dokuları2, hidratlanmış ^yüzeyler3 ve bitki ^kökleri4 gibi bazı yumuşak substratlarda da gözlenir. Yarı katı bir yüzey, bakteri kaynaşmasının temel koşullarından biri olarak kabul edilirken, bazı türler de sürü hareketliliklerini desteklemek için enerji açısından zengin bir ortama ihtiyaç ^duyarlar5. Flagella rotasyonu hem yüzmeye hem de kaynama hareketliliğine güç verir-yüzme, sıvı bir ortamdaki tek hücreli hareketliliği tanımlarken, kaynama, mikrobiyal bir popülasyonun yarı katı yüzeyler boyunca senkronize hareketidir.

Substrat viskozitesi bakteriyel motiliteyi etkiler; Helicobacter pylori gibi patojenik mikroplar üzerinde yapılan çalışmalar, patojenin hareketliliğinin, insan konakçısındaki çevresel asitleşmeden etkilenen müsin tabakası viskozitesine bağlı olarak değiştiğini ^{göstermiştir6}. Bu ortamları çoğaltmak için,% 0.3'ün (w / v) üzerindeki agar konsantrasyonunu kullanan daha önceki çalışmalar, yüzey kaynamasına kademeli bir kaymayı etkilemek için bakteriyel yüzme hareketliliğini kısıtlamaktadır. Agar konsantrasyonunun %1'in (w/v) üzerinde kullanılması, birçok türün kaynama hareketliliğini ^önler7. Yüzeyde oluşan koloni desenleri, özelliksiz ^mat8, boğa ^gözü9, dendritler10 ve ^vorteks11 dahil olmak üzere çeşitlidir.

Bu tür kalıpların alaka düzeyi belirsizliğini korusa da, bu kalıplar çevresel ve kimyasal ipuçlarına bağlı gibi ^{görünmektedir12}. Çevresel ipuçları, sıcaklık, tuzluluk, ışık ve pH dahil olmak üzere farklı yönleri kapsarken, kimyasal ipuçları mikrobiyal çekirdek algılama moleküllerinin, biyokimyasal yan ürünlerin ve besin maddelerinin varlığını içerir. AHL (N-hekzanoil-L homoserin lakton) gibi otoindükleyici çekirdek algılama sinyal molekülleri, yüzey aktif madde üretimini düzenleyerek yüzey kaynamasını ^{etkileyebilir13,14}. Bir fitoaleksin bileşiği olan Resveratrol, bakteriyel sürü hareketliliğini ^{kısıtlayabilir15}.

Bu çalışmada, resveratrolün gradyan konsantrasyonlarının vahşi tip Escherichia coli K12 suşu üzerindeki etkisini araştırıyoruz ve mühendislik ürünü E. coli K12-YdeH ve Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH türlerinin arabinoz ile indüklenebilir sürü hareketliliğini araştırıyoruz. YdeH enziminin üretimi, arabinoz tarafından araBAD promotörü aracılığıyla indüklenir, bu da hücresel c-di-GMP pertürbasyonuna neden olur ve bakteriyel sürü hareketliliğini ^etkiler16,17. Bu indüklenebilir sürü davranışı, E. coli K12-YdeH ve P. aeruginosa PAO1-YdeH suşları ile arabinoz gradyan sürü plakaları kullanılarak incelenmiştir.

Gradyan sürü plakaları, çift katmanlı ortamın art arda katılaşmasıyla hazırlanır (Şekil 1B). Alt tabaka, desteklenmiş bir Petri kabının bir tarafına dökülen indükleyici ile eklenen ortamı içerir. Alt tabakanın katılaşması üzerine, Petri kabı düz bir yüzeye geri döndürülür, burada indükleyici olmadan ortamı içeren üst tabaka plakanın diğer tarafından eklenir. Sürü plakaları tamamen katılaştıktan sonra, izometrik olarak düzenlenmiş tutma kuyuları, sabit bir düzen izlenerek sürü plakaları üzerindeki deliklerin delinmesiyle (Şekil 1C) veya orta kürleme işlemi sırasında mandallar içeren plaka kapağının 3D baskılı bir modeli kullanılarak kuyucukların basılmasıyla üretilir (Ek Şekil S1). Farklı zaman noktalarındaki sürü morfolojilerini yakalamak için bir jel görüntüleme sistemi kullanılır (Şekil 2). ImageJ yazılımı kullanılarak yüzey kaynamasının analizi (Ek Şekil S2), yüzey kaynatma işleminin nicel sonuçlarını sağlar (Şekil 3).

Bu nedenle, bir indükleyici konsantrasyon aralığında yüzey kaynama hareketliliğini test etmek için basit bir yöntem öneriyoruz. Bu yöntem, indükleyiciyi alt tabaka ortamına karıştırarak diğer indükleyicilerin çoklu konsantrasyon tepkilerini test etmek için kullanılabilir ve diğer hareketli türlere (örneğin, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) uygulanabilir. Bu yaklaşım, tek bir kimyasal indükleyicinin taranması için güvenilir kalitatif ve kantitatif sonuçlar sağlayabilir ve daha fazla kimyasal indükleyiciyi değerlendirmek için ayrı plakalar kullanılabilir.

Protokol

1. Degrade sürü plakalarının hazırlanması

1. Sürü ortamının hazırlanması
   NOT: Farklı ortam viskozitelerinin kısa bir karşılaştırması için tartışma bölümüne bakın; Bu protokolde sürü ortamının %0.7 (w/v) agar konsantrasyonu kullanılmıştır.
   1. İki konik şişede agar ile Lysogeny et suyu (LB) tozu hazırlayın; Her şişe 2 g tripton, 2 g sodyum klorür, 1 g maya ekstresi ve 1.4 g agar içerir. Çift damıtılmış su (_ddH2O) ekleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak süspansiyonu karıştırın. Ek _ddH2O ekleyerek son ses seviyesini 200 mL'ye ayarlayın.
   2. Çözeltiyi 20 dakika boyunca 121 °C'de otoklav yapın. Hava geçirgen bir kapak veya hava menfezli şişe sızdırmazlık filmi kullanın.
      NOT: Agar, otoklavda ısıtıldığında çözülecektir.
   3. Sıcaklık 65 ° C'ye düştüğünde, homojenliği sağlamak için çözeltiyi karıştırın ve kısa süreli kullanım için ortamı 65 ° C'lik bir inkübatöre veya su banyosuna aktarın.
2. Alt tabaka sürü ortamının hazırlanması
   NOT: Alt katman ortamı, sürü ortamı ve indükleyici stok çözeltilerinin karışımıdır. İndükleyici gradyan sürü plakalarının formülasyonu Tablo 1'de gösterilmiştir.
   1. 114.12 mg liyofilize resveratrol tozunu 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içine çözerek 100 mM'lik bir resveratrol stok çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi -20 ° C'de saklayın.
   2. 6 g arabinoz tozunu 30 mL ddH2O içinde çözerek% ₂₀ (w / v) arabinoz stok çözeltisi hazırlayın; arabinozun çözünmesine izin vermek için 10-15 dakika bekleyin; ve çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
   3. Ortamı 65 ° C inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına yerleştirin; Erlenmeyer şişesi tutacak kadar soğuk olana kadar (~ 50 ° C) sürü ortamının soğumasını bekleyin. Sürü ortamını uzun süre oda sıcaklığına koymayın, çünkü bu agarın katılaşmasına neden olur.
   4. İndükleyici stok çözeltisinin gerekli hacmini 50 °C'de sürü ortamına ekleyin (Tablo 1). İndükleyici solüsyonu dökmek yerine dağıtmak için bir pipet kullanın. İndükleyiciyi sürü ortamıyla karıştırmak için yavaşça döndürün.
      NOT: Bu adım, otoklavlanamayan indükleyiciler içindir. Kabarcıkları ortama sokmamaya dikkat edin.
3. Çift katmanlı gradyan sürü plakalarının hazırlanması
   NOT: Üst katman ortamı, %0,7 (w/v) agar içeren LB ortamıdır.
   1. 13 x 13 cm kare Petri tabaklarını indükleyici adı ve suşlarla etiketleyin ve bulaşıkları kapakların kenarından yukarı doğru yerleştirin (Şekil 1B).
   2. 50 mL'lik pipet veya 50 mL'lik santrifüj tüpü kullanarak 40 mL sıcak alt katman ortamı (50 °C) ekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, 13 x 13 cm kare Petri tabaklar için 40 mL alt katman ve üst katman ortamı uygundur; 10 x 10 cm kare Petri tabakları için 25 mL alt tabaka ve üst tabaka ortamı uygundur.
   3. Alt tabaka ortamının, laminer bir akış başlığı içinde 1 saat boyunca açıkta kalmasını bekleyin. Orta katılaşırken kare Petri tabaklarını rahatsız etmeyin.
      NOT: Alt tabakayı kürlerken, indükleyici içermeyen sürü ortamı 65 °C'lik bir inkübatörde veya su banyosunda tutulmalıdır.
   4. Alt tabaka tamamen katılaştıktan sonra, kapakları çıkarın ve kare Petri tabaklarını laminer bir akış başlığının içine yerleştirin.
   5. 50 mL'lik pipet veya 50 mL santrifüj tüpü kullanarak 40 mL sıcak üst katman ortamı (50 °C) ekleyin.
      NOT: Üst katman ortamı indükleyici içermez.
   6. Masaüstü üzerindeki çift katmanlı plakaları 1 saat boyunca örtülü ve rahatsız edilmeden kürleyin. Hazırlanan plakaları 4 °C'de 24 saate kadar saklayın.
      NOT: Daha uzun kürlenme süreleri nem içeriğini azaltacak ve sürü hareketliliğini kısıtlayacaktır.

2. E. coli K12 ve P. aeruginosa PAO1'in büyümesi

1. _ddH2O'ya 5 g tripton, 5 g NaCl ve 2.5 g maya ekstraktı ekleyerek 500 mL LB ortamı hazırlayın ve çözeltiyi 500 mL'ye kadar doldurun. Çözeltiyi sıvı döngüsünde 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın ve 4 °C'de saklayın.
2. ddH2O'ya 1 g tripton, 1 g NaCl, 0,5 g maya ekstresi ve 1,5 g agar ekleyerek 100 mL% 1,5 (w / v) LB-agar ortamı hazırlayın ve çözeltiyi 100 mL'ye kadar doldurun. Çözeltiyi sıvı döngüsünde 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın. Agarın katılaşmasını önlemek için ortamı 50 ° C'lik bir su banyosuna aktarın.
3. LB-agar orta boy şişenin tutulması rahat olduğunda, 25 mL'lik bir pipet kullanarak Petri kabına (10 cm çapında) 20 mL LB-agar ortamı ekleyin. Plakayı gece boyunca oda sıcaklığında bırakın ve LB-agar plakasını 4 ° C'de saklayın.
4. Tek kullanımlık aşılama döngüleri kullanarak LB-agar Petri tabaklarında -80 ° C, streak E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 ve P. aeruginosa PAO1-YdeH suşlarını içeren stok kültürlerini alın. Petri çanaklarını gece boyunca 37 ° C'de ters çevrilmiş olarak inkübe edin.
5. Petri bulaşıklarından farklı suşlar için tek koloniler seçin, her koloniye 5 mL LB ortamına aşılayın ve kültürü 220 rpm'ye ayarlanmış bir laboratuvar yörünge çalkalayıcısında 37 ° C'de inkübe edin.
6. Kültür yoğunluğu _OD600nm ~ 1.0'a ulaştığında, kültürü çalkalayıcıdan çıkarın ve oda sıcaklığına yerleştirin. Kültür yoğunluğunu, adım 3.2.1'de açıklandığı gibi _OD600nm = 1.0 olarak ayarlayın.

3. Gradyan sürü plakalarının aşılanması ve inkübasyonu

1. Aşılama kuyularının hazırlanması
   NOT: Aşağıda açıklanan yöntem yerine standart bir mesafe ile ayrılmış kuyucuklar üretebilen 3D baskı kapak modelleri kullanılabilir (Ek Şekil S1).
   1. Şekil 1C'de gösterilen A4 kağıdındaki kuyu konumlarını işaretleyin. Bir kare Petri kabında iki veya üç kopya ile üç test konsantrasyonu ayarlayın.
   2. İşaretli A4 kağıdını katılaşmış bir gradyan plakasının altına yerleştirin. 100 μL pipet ucunun daha geniş tarafını işaretli konumda yarı katı orta yüzeye itin. Pipet ucunu üst katman ortamının dibine ulaşana kadar bastırın.
   3. Uç tabana dokunduğunda, uca dikey kuvvet uygulamayın; silindirik kuyucuğun içeriğini izole etmek için ucu yavaşça döndürün.
   4. Pipet uçlarını yatay olarak çok küçük bir mesafe boyunca hareket ettirerek hava akışının bir kenara bırakılan dar yere girmesini sağlayın. Başparmak ve orta parmağınızı kullanarak pipeti tutarken ucun içindeki gaz akışını engellemek için ucu işaret parmağınızla bastırın.
   5. Ucu dikey olarak dışarı çekin, dışarı çekerken kuyu içeriğini uçta tutun.
      NOT: Kuyu içeriği kayarsa, ucu tamamen kapatmak için işaret parmağınızla biraz daha fazla basınç uygulayın.
   6. 3.1.2 ile 3.1.5 arasındaki adımları işaretli her konumda yineleyin. Aşılamadan önce sürü plakasını örtün.
2. Gradyan plakası aşılama ve inkübasyon
   1. Gecelik büyüme kültürü yoğunluğunu _OD600nm = 1.0 olarak ayarlayın.
   2. Pipet, 80 μL'lik bir gecede büyüme kültürünü her kuyucuğun içine yerleştirir. Bakteri kültürünü kuyuların dışına dökmeyin.
   3. Plakaları sızdırmazlık filmi ile sarın. Uzun süreli gözlem için (3-5 gün), plakaları steril laboratuvar kauçuk bandı ile sarın.
      NOT: Kauçuk bandın kırılma olasılığı daha düşüktür.
   4. İnkübatörün içindeki nemi korumak için inkübatöre _ddH2O ile doldurulmuş bir beher yerleştirin. Gradyan sürü plakalarını 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Sürü plakalarını baş aşağı inkübe etmeyin; bu, bakteri kültürünün kuyulardan sızmasına neden olacaktır.
   5. Aşılamadan hemen sonra sürü plakasını görüntüleyin ve bunu 0 saatlik zaman noktası olarak kaydedin.

4. Görüntüleme bakteri yüzeyi kaynaşması

1. Sürü plakalarını her 12 saatte bir inkübatörden teker teker çıkarın, plakayı yatay olarak tutun ve jel görüntüleme sistemine yerleştirin ( bkz.
   NOT: Plakaların yüzeyinde parmak izi bırakmayın; sürü plakasının yan tarafını temiz eldivenlerle tutun.
2. Jel görüntüleme modunu seçin; sürü plakasını beyaz ışığa maruz bırakın; tıklayın ve sürülerin en net görünümünü sağlamak için odak uzaklığını ayarlayın.
   NOT: Belirli bir gruptaki tüm plakalar için aynı odak uzaklığını kullanın.
3. Pozlama süresini 300 ms'ye ayarlayarak net gözlem için sürülerin parlaklığını artırın. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için eşiği ayarlayın.
   NOT: Eşik, jel görüntüleme sisteminin işletim arayüzünde ayarlanır. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için soldaki değerleri artırın; Sürülerin parlaklığını artırmak için sağdaki değerleri azaltın. Bu protokolde, bölge genellikle 6.000 ila 50.000 arasındadır.
4. Daha fazla analiz için görüntü dosyasını kaydedin. Görüntüleme süresini, indükleyici türünü, gradyan yönünü ve gerinimleri .txt bir dosyaya kaydedin.

5. ImageJ yazılımını kullanarak sürü alanını ölçün

1. Jel görüntüleme sistemi kullanılarak elde edilen görüntü dosyasını içe aktarın.
2. ImageJ yazılımını kullanarak ölçek çubuğunu ayarlayın ve tüm görüntülere uygulayın.
   1. Çizgi aracına tıklayarak panonun uzunluğunu işaretleyen bir çizgi parçası oluşturun.
   2. | Analiz Et'e tıklayın Set Scale penceresini açmak için Ölçeği Ayarlayın.
   3. Gerçek uzunluğu Bilinen mesafe ve Uzunluk birimi alanlarına yazın.
      NOT: Bu çalışmada 13 x 13 cm kare Petri çanakları kullanıldığından, gerçek uzunluk '130' ve uzunluk birimi 'mm'dir.
   4. Genel kutusunu işaretleyin.
   5. | Analiz Et'i tıklatarak ölçek çubuğu ekleme Araçlar | Ölçek Çubuğu'na mm cinsinden Genişlik, piksel cinsinden Yükseklik, Yazı tipi boyutu yazın ve açılır menüden Renk, Arka Plan ve Konum'u seçin. Alternatif olarak, onay kutularını işaretleyerek Kalın Metin, Metni Gizle, Serif Font ve Bindirme'yi seçin.
      NOT: Bu parametrelerin seçimi kullanıcılar ve görüntülerin özellikleri tarafından belirlenir. Bu protokolde, mm cinsinden genişlik 25, piksel cinsinden yükseklik 20, Yazı tipi boyutu 80 olarak ayarlandı ve ölçek çubuğu Konum seçilerek sağ alt köşeye yerleştirildi | Sağ alt. Diğer parametreler kullanıcı tarafından seçilebilir.
3. İşlem |'na tıklayın Görüntünün keskinliğini, özellikle de sınırları artırmak için gölgeler (Ek Şekil S2A). İşlem |'na tıklayın Görüntüleri işlemek için toplu işlem.
   NOT: Bu adımın amacı, daha kesin sınır çizgisi sağlamaktır.
   1. İşlem | tıklayarak bir görüntüyü referans olarak işleyin Gölgeler | Güney.
   2. İşlem |'na tıklayın Toplu | Toplu İşlem penceresini açmak için makro. Pencerede görüntülenen aşağıdaki komutları arayın:
      run("Güney");
      run("Kaydet");
      close();
   3. Toplu İşlem penceresinde İşlem'i tıklatarak özgün görüntülerin klasör adresini ve çıktı dosyası adresini yazın.
      NOT: Gölgeli görüntülerin başka bir klasöre aktarılması ve orijinal görüntülerin bir kopyasının saklanması önerilir.
4. Sürüleri tek tek seçmek için Değnek (izleme) aracını kullanın ve oluşturulan çizgi sürü sınırına doğru şekilde uyana kadar toleransı ayarlayın (Değnek (izleme) aracını çift tıklatın) (Ek Şekil S2B).
   NOT: İlk olarak, Değnek (izleme) aracını tıklatın ve bir görüntüde bir sürü seçin. Sınırlar doğru şekilde gösterilmemişse, Toleransın ayarlanabileceği Değnek Aracı pencerelerini açmak için Değnek (izleme) aracını çift tıklatın.
5. | Analiz Et'e tıklayın Alan değerini dışa aktarmak için ölçün.
6. Tüm sürüler ölçülene kadar 5.1.1-5.1.5 arasındaki adımları yineleyin, daha fazla çözümleme için sonuçları bir .csv dosyasına kaydedin.

Sonuçlar

Degrade sürü plakalarının hazırlanması, aşılama ve inkübasyondan oluşan iş akışı Şekil 1B'de gösterilmiştir. Degrade yüzme plakaları oluşturmak için, alt tabaka ortamı, yatay düzlemden ~ 4.3 ° 'de (Ek Şekil S3) desteklenmiş tabaklara dökülür, ardından alt tabaka tamamen katılaştıktan sonra üst katman ortamı dökülür. Çift katmanlı ortamın bileşimi Tablo 1'de gösterilmiştir. Daha sonra, gece boyunca kültürlenen bak...

Tartışmalar

Yarı katı gradyan plakalar üzerindeki bakteri kaynaşma hareketliliğinin araştırılması, substrat viskozitesi, nem ve orta bileşenler gibi birden fazla faktörü içerdiğinden zorlu bir görev ^{olabilir18,19,20}. Bu faktörler arasında, agar konsantrasyonu, yüzme veya sürü hareketliliğine mikrobiyal geri dönüşün belirlenmesinde belirleyici bir rol oynar. Agar konsantrasyonu %0,3'ten (w/v) %1'e (w/v) yükseldikç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes	Bkman	B-SLPYM130F	Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28