Un enfoque in vitro para estudiar la disfunción mitocondrial: un modelo cibrido

Resumen

Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho⁰ ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.

Resumen

La deficiencia de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial que llevan a cabo la fosforilación oxidativa (OXPHOS) es el marcador bioquímico de los trastornos mitocondriales humanos. Desde un punto de vista genético, el OXPHOS representa un ejemplo único porque resulta de la complementación de dos sistemas genéticos distintos: el ADN nuclear (nDNA) y el ADN mitocondrial (ADNmt). Por lo tanto, los defectos de OXPHOS pueden deberse a mutaciones que afectan a genes codificados nucleares y mitocondriales.

El trabajo innovador de King y Attardi, publicado en 1989, mostró que las líneas celulares humanas agotadas de ADNmt (llamadas rho⁰) podrían ser repobladas por mitocondrias exógenas para obtener los llamados "cibridas transmitocondriales". Gracias a estos cibridos que contienen mitocondrias derivadas de pacientes con trastornos mitocondriales (DM) y núcleos de células rho⁰ , es posible verificar si un defecto está relacionado con el ADNmt o el ADNm. Estos cibridos también son una poderosa herramienta para validar la patogenicidad de una mutación y estudiar su impacto a nivel bioquímico. Este artículo presenta un protocolo detallado que describe la generación, selección y caracterización de cibridas.

Introducción

Los trastornos mitocondriales (DM) son un grupo de síndromes multisistémicos causados por un deterioro en las funciones mitocondriales debido a mutaciones en el ADN nuclear (nDNA) o mitocondrial (ADNmt)¹. Se encuentran entre las enfermedades metabólicas hereditarias más comunes, con una prevalencia de 1:5.000. Las enfermedades asociadas al ADNmt siguen las reglas de la genética mitocondrial: herencia materna, heteroplasmia y efecto umbral, y segregación mitótica². El ADNmt humano es un círculo de ADN de doble cadena de 16,6 kb, que contiene una región de control corta con secuencias necesarias para la replicación y transcripción, 13 genes codificantes de proteínas (todas las subunidades de la cadena respiratoria), 22 ARNt y 2 genes de ARNr³.

En individuos sanos, hay un solo genotipo de ADNmt (homoplasmia), mientras que coexiste más de un genotipo (heteroplasmia) en condiciones patológicas. Las mutaciones heteroplásmicas perjudiciales deben superar un umbral crítico para interrumpir OXPHOS y causar enfermedades que pueden afectar a cualquier órgano a cualquier edad⁴ años. La genética dual de OXPHOS dicta la herencia: autosómica recesiva o dominante y ligada al cromosoma X para las mutaciones del ADNn, materna para las mutaciones del ADNmt, además de casos esporádicos tanto para el ADNmt como para el ADNmt.

Al comienzo de la era de la medicina mitocondrial, un experimento histórico de King y Attardi⁵ estableció la base para comprender el origen de una mutación responsable de un MD mediante la creación de células híbridas que contienen núcleos de líneas celulares tumorales en las que el ADNmt estaba completamente agotado (células rho⁰) y mitocondrias de pacientes con DM. Las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) no estaban disponibles en ese momento, y no fue fácil determinar si una mutación estaba presente en el genoma nuclear o mitocondrial. El método, descrito en 1989, fue utilizado por varios investigadores que trabajaban en el campo de la medicina mitocondrial 6,7,8,9; recientemente se ha publicado un protocolo detallado¹⁰, pero aún no se ha realizado ningún video. ¿Por qué un protocolo de este tipo debería ser relevante hoy en día cuando NGS podría identificar con precisión y rapidez dónde se encuentra una mutación? La respuesta es que la generación de cíbridos sigue siendo el protocolo de última generación para comprender el papel patogénico de cualquier nueva mutación de ADNmt, correlacionar el porcentaje de heteroplasmia con la gravedad de la enfermedad y realizar una investigación bioquímica en un sistema nuclear homogéneo en el que la contribución del fondo nuclear autóctono del paciente está ausente^{11, 12,13}.

Este protocolo describe cómo obtener citoplastos a partir de fibroblastos confluentes derivados del paciente cultivados en placas de Petri de 35 mm. La centrifugación de los platos en presencia de citocalasina B permite el aislamiento de citoplastos enucleados, que luego se fusionan con células rho⁰ en presencia de polietilenglicol (PEG). Los cibridos resultantes se cultivan en medio selectivo hasta que surgen los clones. La sección de resultados representativos muestra un ejemplo de caracterización molecular de los cibridos resultantes para demostrar que el ADNmt es idéntico al de los fibroblastos de los pacientes donantes y que el ADNn es idéntico al ADN nuclear de la línea celular tumoral rho⁰ .

Protocolo

NOTA: El uso de fibroblastos humanos puede requerir aprobación ética. Los fibroblastos utilizados en este estudio se derivaron de pacientes con MD y se almacenaron en el biobanco institucional de conformidad con los requisitos éticos. Se dio consentimiento informado para el uso de las celdas. Realizar todos los procedimientos de cultivo celular bajo un gabinete de flujo laminar estéril a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilice soluciones filtradas estériles adecuadas para cultivo celular y equipos estériles. Cultive todas las líneas celulares en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂. Las pruebas de micoplasma deben realizarse semanalmente para garantizar cultivos libres de micoplasma. Se pueden generar 143 celdasBTK-rho ⁰ como se describió anteriormente⁵.

1. Cultivo de células

1. Antes de iniciar cualquier procedimiento, verificar la presencia de la mutación en fibroblastos derivados de paciente(s) con DM y cuantificar el porcentaje de heteroplasmia u homoplasmia mediante polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y/o análisis de secuenciación de ADNmt completo¹⁴.
2. Fibroblastos de semillas en cuatro placas de Petri de 35 mm, cada una con 2 ml de medio de cultivo completo (Tabla 1). Deja que las células crezcan hasta que el 80% se confluya (48 h).
3. Cultivar 143 célulasBTK^- rho⁰ en 8 mL de Medio de Cultivo Suplementado (Tabla 1) en una placa de Petri de 100 mm.
4. Mantenga las células en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂.
5. Comprobar la ausencia de ADNmt en células rho⁰ mediante técnicas de secuenciación¹⁴.

2. Enucleación de fibroblastos

1. Esterilice cuatro biberones aptos para centrífugas de 250 ml mediante esterilización en autoclave a 121 °C durante un ciclo de 20 minutos. Sécalos en un horno de laboratorio o en RT.
2. Precalentar la centrífuga a 37 °C.
3. Lave los platos de 35 mm que contienen los fibroblastos dos veces, usando 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin (sin) calcio y magnesio.
4. Limpie la superficie exterior de los platos con etanol al 70% y espere hasta que el alcohol se evapore.
5. Retire las tapas de los platos y los tapones de rosca de las botellas. Coloque cada plato, sin tapa, boca abajo en el fondo de cada botella centrífuga de 250 ml.
6. Agregue lentamente 32 ml de medio de enucleación a cada botella (Tabla 1), permitiendo que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células. Retire las burbujas de los platos con una pipeta Pasteur de vidrio largo, curvando la punta en una llama Bunsen.
   NOTA: Es importante eliminar las burbujas para permitir que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células.
7. Cierre cada botella con el tapón de rosca y transfiéralas a la centrífuga.
8. Centrifugación durante 20 min a 37 °C y 8.000 × g, aceleración máx., desaceleración lenta. Preste atención para equilibrar la centrífuga: contrapese cada botella. Si es necesario, ajuste el peso agregando un volumen adecuado de Medio de enucleación.
9. Durante la centrifugación, use vacío o una pipeta serológica de 10 ml para aspirar y desechar el medio de las placas de cultivo 143BTK-rho ⁰ y lávelas dos veces con 4 ml de 1 pbS sin calcio y magnesio.
10. Agregue 2 ml de tripsina para cubrir completamente la monocapa celular.
11. Coloque los platos en una incubadora de 37 °C durante ~2 min.
12. Retire los platos de la incubadora, observe el desprendimiento celular utilizando un microscopio invertido para células vivas (objetivos 4x o 10x), e inhiba la actividad enzimática agregando 2 ml de medio de cultivo suplementado.
13. Aspire los 4 mL de la suspensión celular en el plato con una pipeta de 10 mL y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL.
14. Cuente las células utilizando una cámara hemocitómetro Burker o un contador automatizado.
15. Al final de la centrifugación (paso 2.8), aspire el medio de las botellas y deséchelo.
16. Retirar los platos invirtiendo los frascos sobre una gasa estéril previamente rociada con etanol al 70%. Limpie la superficie exterior de los platos y sus tapas con etanol al 70%. Espere hasta que el alcohol se evapore y luego cierre los platos.
17. Antes de continuar, verifique la formación de citoplastos (fantasmas) utilizando un microscopio invertido para células vivas (objetivo 4x o 10x). Busque fibroblastos extremadamente alargados debido a la extrusión de sus núcleos inducida por la citocalasina B.
18. A cada plato de 35 mm, agregue 1 × 10⁶ de 143BTK^- rho⁰ células resuspendidas en 2 ml de medio de cultivo 143BTK^- rho⁰ suplementado con suero bovino fetal al 5% (FBS).
19. Deje los platos durante 3 h en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ y deje que las células 143BTK^- rho⁰ se asienten en los fantasmas. No moleste los platos.

3. Fusión de los fibroblastos enucleados con células rho ⁰

1. Después de 3 h de incubación, aspire y deseche el medio de los platos.
2. Lave las células adherentes dos veces con 2 ml de glucosa alta sin suero de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) o con Minimum Essential Medium (MEM).
3. Aspirar y desechar el medio.
4. Agregue 500 μL de solución de PEG (consulte la Tabla de materiales) a las células e incube durante exactamente 1 min.
5. Aspire y deseche la solución peg.
6. Lave las células tres veces usando 2 ml de DMEM alto en glucosa sin suero o con MEM.
7. Añadir 2 ml de medio de fusión (Tabla 1) e incubar durante la noche en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂.

4. Selección y expansión de Cybrid

1. Después de la incubación durante la noche, retire las placas de la incubadora, tripsinice las células como se describió anteriormente (pasos 2.9-2.13) y transfiera el contenido de cada plato de 35 mm a un plato de 100 mm.
2. Añadir 8 ml de medio de selección (Tabla 1) y colocar las placas en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂.
3. Cambie el medio cada 2-3 días.
4. Espere ~ 10-15 días de selección hasta que aparezcan colonias de células.
5. Congelar una de las cuatro placas de Petri recogiendo todos los clones y generando un cultivo "masivo" como respaldo de los cibridos, que eventualmente puede ser recloned y utilizado para futuras investigaciones.
6. Tripsinizar las células en las placas de cultivo restantes, contar y sembrar en una o más placas de Petri a 50-100 células / plato en el Medio de cultivo suplementado (Tabla 1) hasta que aparezcan clones. Déjalos crecer durante algunos días.
7. Granular las células restantes por centrifugación a 1.200 × g durante 3 min a RT y desechar el sobrenadante.
8. Extraer ADN del pellet (ver la Tabla de Materiales).
9. Realizar genotipado por número variable de análisis repetidos en tándem (VNTR) como se informó anteriormente¹⁵.
10. Recoger clones de la placa de Petri con cilindros de clonación o una punta de pipeta, utilizando un estereomicroscopio para evitar la agrupación de diferentes clones, y transferirlos a una placa de 96 pocillos, cada uno de los cuales contiene 200 μL de medio de cultivo suplementado (Tabla 1).
11. Expanda cada clon hasta que haya suficientes células para congelar y extraer ADN.
12. Verificar el porcentaje de mutación de cada clon mediante RFLP u otros métodos de secuenciación. Lo ideal es tratar de obtener tanto clones con ADNmt de tipo salvaje (mutación del 0%) como clones con diferentes porcentajes de mutación, ambos sumando al ADNmt mutante homoplásmico (mutación del 100%). Consulte la Figura 1 para obtener un diagrama esquemático del protocolo de generación de cibridas.

Resultados

La generación de cibridas requiere 3 días de trabajo de laboratorio más un período de selección (~ 2 semanas) y 1-2 semanas adicionales para el crecimiento de clones. Los pasos críticos son la calidad de los citoplastos y el período de selección. La morfología de los cibridos se asemeja a la de las células donantes rho⁰. La asignación del ADNmt y el ADNn correctos en los cibridas es obligatoria para confirmar la identidad de las células. Un ejemplo se da en la Figura 2...

Discusión

El ADNmt tiene una tasa de mutación muy alta en comparación con el ADNnm debido a la falta de histonas protectoras y su ubicación cerca de la cadena respiratoria, lo que expone a la molécula a efectos oxidativos dañinos no contrarrestados eficientemente por los sistemas de reparación¹⁶. Las primeras mutaciones patógenas del ADNmt se identificaron en ^{1988 17,18}, y desde entonces, se han descrito un gran número de mutaciones. La tecn...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G