Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

Résumé

Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho⁰ ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.

Résumé

La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.

Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho⁰) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho⁰ , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.

Introduction

Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)¹. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique². L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplication et à la transcription, 13 gènes codant pour les protéines (toutes les sous-unités de la chaîne respiratoire), 22 ARNt et 2 gènes d’ARNr³.

Chez les individus en bonne santé, il existe un seul génotype d’ADNmt (homoplasmie), tandis que plus d’un génotype coexiste (hétéroplasmie) dans des conditions pathologiques. Les mutations hétéroplasmiques délétères doivent franchir un seuil critique pour perturber OXPHOS et provoquer des maladies pouvant affecter n’importe quel organe à tout âge^{de 4 ans}. La double génétique d’OXPHOS dicte l’hérédité : autosomique récessive ou dominante et liée à l’X pour les mutations de l’ADNn, maternelle pour les mutations de l’ADNmt, plus des cas sporadiques à la fois pour l’ADNmt et l’ADNmt.

Au début de l’ère de la médecine mitochondriale, une expérience historique de King et Attardi⁵ a établi la base pour comprendre l’origine d’une mutation responsable d’un MD en créant des cellules hybrides contenant des noyaux de lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’ADNmt était entièrement épuisé (cellules rho⁰) et les mitochondries de patients atteints de DM. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) n’étaient pas disponibles à cette époque, et il n’était pas facile de déterminer si une mutation était présente dans le génome nucléaire ou mitochondrial. La méthode, décrite en 1989, a ensuite été utilisée par plusieurs chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine mitochondriale 6,7,8,9; un protocole détaillé a été récemment publié¹⁰, mais aucune vidéo n’a encore été réalisée. Pourquoi un tel protocole devrait-il être pertinent de nos jours alors que NGS pourrait identifier précisément et rapidement où se trouve une mutation? La réponse est que la génération de cybrides est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADNmt, corréler le pourcentage d’hétéroplasmie avec la gravité de la maladie et effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène dans lequel la contribution du fond nucléaire autochtone du patient est absente^{11, 12,13}.

Ce protocole décrit comment obtenir des cytoplastes à partir de fibroblastes confluents dérivés de patients cultivés dans des boîtes de Petri de 35 mm. La centrifugation des plats en présence de cytochalasine B permet l’isolement des cytoplastes énucléés, qui sont ensuite fusionnés avec des cellules rho⁰ en présence de polyéthylène glycol (PEG). Les cybrides résultantes sont ensuite cultivées en milieu sélectif jusqu’à l’apparition de clones. La section des résultats représentatifs montre un exemple de caractérisation moléculaire des cybrides résultantes pour prouver que l’ADNmt est identique à celui des fibroblastes des patients donneurs et que l’ADNn est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire tumorale rho⁰ .

Protocole

REMARQUE: L’utilisation de fibroblastes humains peut nécessiter une approbation éthique. Les fibroblastes utilisés dans cette étude ont été dérivés de patients atteints de DM et stockés dans la biobanque institutionnelle conformément aux exigences éthiques. Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules. Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire sous une armoire à flux laminaire stérile à température ambiante (RT, 22-25 °C). Utilisez des solutions filtrées stériles adaptées à la culture cellulaire et aux équipements stériles. Cultiver toutes les lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂. Des tests de mycoplasmes doivent être effectués chaque semaine pour s’assurer que les cultures sont exemptes de mycoplasmes. Les cellules 143BTK^- rho⁰ peuvent être générées comme décrit précédemment⁵.

1. Culture de cellules

1. Avant de commencer toute procédure, vérifier la présence de la mutation dans les fibroblastes dérivés de patients MD et quantifier le pourcentage d’hétéroplasmie ou d’homoplasmie par polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) et / ou des analyses de séquençage d’ADNmt entier¹⁴.
2. Ensemencez des fibroblastes dans quatre boîtes de Petri de 35 mm, contenant chacune 2 mL de milieu de culture complet (tableau 1). Laissez les cellules croître jusqu’à 80% de confluent (48 h).
3. Cultiver 143BTK^- rho⁰ cellules dans 8 mL de milieu de culture supplémenté (tableau 1) dans une boîte de Petri de 100 mm.
4. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
5. Vérifier l’absence d’ADNmt dans les cellules rho⁰ par des techniques de séquençage¹⁴.

2. Énucléation des fibroblastes

1. Stériliser quatre bouteilles de 250 mL adaptées à la centrifugeuse par stérilisation autoclave à 121 °C pendant un cycle de 20 minutes. Séchez-les dans un four de laboratoire ou à RT.
2. Préchauffer la centrifugeuse à 37 °C.
3. Lavez deux fois les plats de 35 mm contenant les fibroblastes, en utilisant 2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans (sans) calcium ni magnésium.
4. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle avec 70% d’éthanol et attendez que l’alcool s’évapore.
5. Retirez les couvercles de la vaisselle et les bouchons à vis des bouteilles. Placez chaque plat, sans le couvercle, à l’envers au fond de chaque bouteille de centrifugeuse de 250 ml.
6. Ajouter lentement 32 mL de milieu d’énucléation à chaque bouteille (tableau 1), ce qui permet au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. Retirez toutes les bulles de la vaisselle à l’aide d’une longue pipette Pasteur en verre, en recourbant la pointe dans une flamme Bunsen.
   REMARQUE: Il est important d’enlever les bulles pour permettre au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules.
7. Fermez chaque bouteille avec le bouchon à vis et transférez-les à la centrifugeuse.
8. Centrifugeuse pendant 20 min à 37 °C et 8 000 × g, accélération max, décélération lente. Faites attention à équilibrer la centrifugeuse : contrebalancez chaque bouteille. Si nécessaire, ajustez le poids en ajoutant un volume approprié de milieu d’énucléation.
9. Pendant la centrifugation, utilisez le vide ou une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer et jeter le milieu des plaques de culture 143BTK-rho ⁰ et les laver deux fois en utilisant 4 mL de 1x PBS sans calcium et magnésium.
10. Ajouter 2 mL de trypsine pour recouvrir complètement la monocouche cellulaire.
11. Placez les plats dans un incubateur à 37 °C pendant environ 2 min.
12. Retirez les plats de l’incubateur, observez le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectifs 4x ou 10x) et inhibez l’activité enzymatique en ajoutant 2 mL de milieu de culture supplémenté.
13. Aspirer les 4 mL de la suspension cellulaire dans le plat avec une pipette de 10 mL et la transférer dans un tube conique de 15 mL.
14. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre hémocytométrique Burker ou d’un compteur automatisé.
15. À la fin de la centrifugation (étape 2.8), aspirez le fluide des bouteilles et jetez-le.
16. Retirez la vaisselle en inversant les bouteilles sur une gaze stérile préalablement pulvérisée avec 70% d’éthanol. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle et de leurs couvercles avec 70% d’éthanol. Attendez que l’alcool s’évapore, puis fermez la vaisselle.
17. Avant de continuer, vérifiez la formation de cytoplastes (fantômes) à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectif 4x ou 10x). Recherchez des fibroblastes extrêmement allongés en raison de l’extrusion de leurs noyaux induite par la cytochalasine B.
18. À chaque plat de 35 mm, ajouter 1 × 10⁶ de 143BTK^- rho⁰ cellules remises en suspension dans 2 mL de milieu de culture 143BTK^- rho⁰ complété par 5% de sérum fœtal bovin (FBS).
19. Laissez la vaisselle pendant 3 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂ et laissez les cellules 143BTK-rho⁰ se déposer sur les fantômes. Ne pas déranger la vaisselle.

3. Fusion des fibroblastes énucléés avec des cellules rho ⁰

1. Après 3 h d’incubation, aspirer et jeter le milieu des plats.
2. Lavez les cellules adhérentes deux fois avec 2 mL de glucose élevé DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco sans sérum ou avec un milieu essentiel minimum (MEM).
3. Aspirer et jeter le milieu.
4. Ajouter 500 μL de solution de PEG (voir le tableau des matériaux) aux cellules et incuber pendant exactement 1 min.
5. Aspirer et jeter la solution peg.
6. Lavez les cellules trois fois en utilisant 2 mL de DMEM à glucose élevé sans sérum ou avec MEM.
7. Ajouter 2 mL de milieu de fusion (tableau 1) et incuber toute la nuit dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.

4. Sélection et expansion de Cybride

1. Après une incubation d’une nuit, retirez les plaques de l’incubateur, trypsinisez les cellules comme décrit ci-dessus (étapes 2.9-2.13) et transférez le contenu de chaque plat de 35 mm dans un plat de 100 mm.
2. Ajouter 8 mL de milieu de sélection (tableau 1) et placer les plaques dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. Changez le milieu tous les 2-3 jours.
4. Attendez environ 10 à 15 jours de sélection jusqu’à ce que des colonies de cellules apparaissent.
5. Congelez l’une des quatre boîtes de Pétri en collectant tous les clones et en générant une culture « massive » comme sauvegarde des cybrides, qui peut éventuellement être reclonée et utilisée pour des recherches plus approfondies.
6. Trypsiniser les cellules dans les boîtes de culture restantes, compter et ensemencer dans une ou plusieurs boîtes de Petri à 50-100 cellules / boîte dans le milieu de culture supplémenté (tableau 1) jusqu’à ce que des clones apparaissent. Laissez-les grandir pendant quelques jours.
7. Abattez les cellules restantes par centrifugation à 1 200 × g pendant 3 min à TA et jetez le surnageant.
8. Extraire l’ADN de la pastille (voir la Table des matériaux).
9. Effectuer le génotypage par nombre variable d’analyses répétées en tandem (VNTR), comme indiqué précédemment¹⁵.
10. Ramassez les clones de la boîte de Pétri avec des cylindres de clonage ou une pointe de pipette, à l’aide d’un stéréomicroscope pour éviter la mise en commun de différents clones, et transférez-les dans une plaque de 96 puits, chaque puits contenant 200 μL de milieu de culture supplémenté (tableau 1).
11. Développez chaque clone jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de cellules pour congeler et extraire l’ADN.
12. Vérifiez le pourcentage de mutation de chaque clone par RFLP ou d’autres méthodes de séquençage. Idéalement, essayez d’obtenir à la fois des clones avec de l’ADNmt de type sauvage (mutation à 0%) et des clones avec des pourcentages de mutation différents, les deux s’ajoutant à l’ADNmt mutant homoplasmique (mutation à 100%). Voir la Figure 1 pour un diagramme schématique du protocole de génération cybride.

Résultats

La génération de cybrides nécessite 3 jours de travail en laboratoire plus une période de sélection (~ 2 semaines) et 1-2 semaines supplémentaires pour la croissance des clones. Les étapes critiques sont la qualité des cytoplastes et la période de sélection. La morphologie des cybrides ressemble à celle des cellules donneuses rho⁰. L’attribution de l’ADNmt et de l’ADNn corrects dans les cybrides est obligatoire pour confirmer l’identité des cellules. Un exemple est donné à

Discussion

L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation¹⁶. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 1988^17,18, et depuis lors, un grand nom...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G