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Resumo

Cibridos transmissocondriais são células híbridas obtidas pela fusão de DNA mitocondrial (mtDNA) células esgotadas (células rho0 ) com citoplastas (células enucleadas) derivadas de pacientes afetados por distúrbios mitocondriais. Permitem a determinação da origem nuclear ou mitocondrial da doença, avaliação da atividade bioquímica e confirmação do papel patogênico das variantes relacionadas ao MTDNA.

Resumo

Deficiência dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial que realizam fosforilação oxidativa (OXPHOS) é o marcador bioquímico das doenças mitocondriais humanas. Do ponto de vista genético, o OXPHOS representa um exemplo único porque resulta da complementação de dois sistemas genéticos distintos: DNA nuclear (nDNA) e DNA mitocondrial (mtDNA). Portanto, os defeitos oxphos podem ser devido a mutações que afetam genes codificados nucleares e mitocondriais.

O trabalho inovador de King e Attardi, publicado em 1989, mostrou que as linhas celulares humanas esgotadas de mtDNA (chamada rho0) poderiam ser repovoadas por mitocôndrias exógenas para obter os chamados "cibrids transmissores". Graças a esses cibrids contendo mitocôndrias derivadas de pacientes com distúrbios mitocondriais (DM) e núcleos de células rho0 , é possível verificar se um defeito está relacionado com MTDNA ou nDNA. Esses cibrids também são uma ferramenta poderosa para validar a patogenicidade de uma mutação e estudar seu impacto a um nível bioquímico. Este artigo apresenta um protocolo detalhado descrevendo geração, seleção e caracterização cibrid.

Introdução

Os distúrbios mitocondriais (DM) são um grupo de síndromes multissistemas causadas por um comprometimento nas funções mitocondriais devido a mutaçõesno DNA nuclear (nDNA) ou mitocondrial (mtDNA). Estão entre as doenças metabólicas herdadas mais comuns, com prevalência de 1:5.000. as doenças associadas ao MTDNA seguem as regras da genética mitocondrial: herança materna, heteroplasma e efeito limiar, e segregação mitótica2. O mtDNA humano é um círculo de DNA de dupla rega de 16,6 kb, que contém uma região de controle curto com sequências necessárias para replicação e transcrição, 13 genes codificadores de proteínas (todas subunidades da cadeia respiratória), 22 tRNA e 2 genes rRNA3.

Em indivíduos saudáveis, há um único genótipo de MTDNA (homoplasma), enquanto mais de um genótipo coexiste (heteroplasma) em condições patológicas. Mutações heteroplasmáticas deletérias devem superar um limiar crítico para interromper o OXPHOS e causar doenças que podem afetar qualquer órgão a qualquer idade aos4 anos. A genética dupla do OXPHOS dita a herança: recessiva autossômica ou dominante e ligada a X para mutações de nDNA, materna para mutações de MTDNA, além de casos esporádicos tanto para nDNA quanto para dNA.

No início da era da medicina mitocondrial, um experimento marcante de King e Attardi5 estabeleceu a base para entender a origem de uma mutação responsável por um DM, criando células híbridas contendo núcleos de linhas de células tumorais nas quais o MTDNA estava totalmente esgotado (rho0 células) e mitocôndrias de pacientes com DM. Técnicas de sequenciamento de última geração (GNS) não estavam disponíveis naquela época, e não foi fácil determinar se uma mutação estava presente no genoma nuclear ou mitocondrial. O método, descrito em 1989, foi então utilizado por vários pesquisadores que atuam no campo da medicina mitocondrial 6,7,8,9; um protocolo detalhado foi publicado recentemente10, mas nenhum vídeo foi feito ainda. Por que tal protocolo deveria ser relevante hoje em dia quando o NGS poderia identificar com precisão e rapidez onde uma mutação está localizada? A resposta é que a geração cibrid ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação mtDNA, correlacionar a porcentagem de heteroplasma com a gravidade da doença, e realizar uma investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo no qual a contribuição do fundo nuclear autóctono do paciente está ausente11, 12,13.

Este protocolo descreve como obter citoplastos de fibroblastos confluentes e derivados do paciente cultivados em placas de Petri de 35 mm. A centrifugação dos pratos na presença de citochalasina B permite o isolamento de citoplastos enucleados, que são então fundidos com células rho0 na presença de polietileno glicol (PEG). Os cibrids resultantes são então cultivados em meio seletivo até que os clones surjam. A seção de resultados representativos mostra um exemplo de caracterização molecular dos cibridos resultantes para provar que o mtDNA é idêntico ao dos fibroblastos dos pacientes doadores e que o nDNA é idêntico ao DNA nuclear da linha celular rho0 tumoral.

Protocolo

NOTA: O uso de fibroblastos humanos pode exigir aprovação ética. Os fibroblastos utilizados neste estudo foram derivados de pacientes com MD e armazenados no biobanco institucional em conformidade com as exigências éticas. Foi previsto consentimento informado para o uso das células. Realize todos os procedimentos de cultura celular sob um gabinete de fluxo laminar estéril à temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Use soluções filtradas estéreis adequadas para a cultura celular e equipamentos estéreis. Cresça todas as linhas celulares em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Os testes de mycoplasma devem ser realizados semanalmente para garantir culturas livres de mycoplasma. 143BTK-rho 0 células podem ser geradas como descrito anteriormente5.

1. Cultura das células

  1. Antes de iniciar qualquer procedimento, verifique a presença da mutação em fibroblastos derivados de pacientes com DM e quantifique a porcentagem de heteroplasmia ou homoplasma por Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP) e/ou análises de sequenciamento de mtDNAinteiros 14.
  2. Fibroblastos de sementes em quatro pratos Petri de 35 mm, cada um contendo 2 mL de Meio cultura completa (Tabela 1). Deixe as células crescerem até 80% confluentes (48 h).
  3. Cresça 143BTK-rho0 células em 8 mL de Cultura Suplementar (Tabela 1) em uma placa de Petri de 100 mm.
  4. Mantenha as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  5. Verifique a ausência de mtDNA em células rho0 por técnicas de sequenciamento14.

2. Enucleação de fibroblastos

  1. Esterilize quatro garrafas de centrífugas de 250 mL por esterilização autoclave a 121 °C para um ciclo de 20 minutos. Seque-os em um forno de laboratório ou na RT.
  2. Pré-aquecimento da centrífuga a 37 °C.
  3. Lave os pratos de 35 mm contendo os fibroblastos duas vezes, usando 2 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS) sem (w/o) cálcio e magnésio.
  4. Limpe a superfície externa dos pratos com 70% de etanol e espere até que o álcool evapore.
  5. Retire as tampas dos pratos e as tampas dos parafusos das garrafas. Coloque cada prato, sem a tampa, de cabeça para baixo na parte inferior de cada garrafa centrífuga de 250 mL.
  6. Adicione lentamente 32 mL de Enucleação Média a cada garrafa (Tabela 1), permitindo que o meio entre no prato e entre em contato com as células. Remova quaisquer bolhas dos pratos usando uma pipeta pasteur de vidro longo, curvando a ponta em uma chama Bunsen.
    NOTA: É importante remover as bolhas para permitir que o meio entre no prato e entre em contato com as células.
  7. Feche cada garrafa com a tampa do parafuso e transfira-as para a centrífuga.
  8. Centrifugar por 20 min a 37 °C e 8.000 × g, aceleração máxima, desaceleração lenta. Preste atenção para equilibrar a centrífuga: contrapeso cada garrafa. Se necessário, ajuste o peso adicionando um volume adequado de meio de enucleação.
  9. Durante a centrifugação, use vácuo ou uma pipeta sorológica de 10 mL para aspirar e descartar o meio das placas de cultura 143BTK-rho 0 e lave-as duas vezes usando 4 mL de 1x PBS w/o cálcio e magnésio.
  10. Adicione 2 mL de trippsina para cobrir completamente a monocamada da célula.
  11. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C por ~2 min.
  12. Remova os pratos da incubadora, observe o descolamento celular usando um microscópio invertido para células vivas (objetivos 4x ou 10x), e iniba a atividade enzimátil adicionando 2 mL de Meio de Cultura Suplementar.
  13. Aspire os 4 mL da suspensão celular no prato com uma pipeta de 10 mL e transfira-o para um tubo cônico de 15 mL.
  14. Conte as células usando uma câmara hemocitrâmmetro Burker ou um contador automatizado.
  15. No final da centrifugação (etapa 2.8), aspire o meio das garrafas e descarte-o.
  16. Retire os pratos invertendo as garrafas em uma gaze estéril previamente pulverizada com 70% de etanol. Limpe a superfície externa dos pratos e suas tampas com 70% de etanol. Espere até que o álcool evaporar, e depois feche os pratos.
  17. Antes de prosseguir, verifique se há formação de citoplast (fantasma) usando um microscópio invertido para células vivas (objetivo 4x ou 10x). Procure por fibroblastos extremamente alongados devido à extrusão de seus núcleos induzidos pela citochalasina B.
  18. A cada prato de 35 mm, adicione 1 × 106 de 143BTK-rho0 células resuspended em 2 mL de 143BTK-rho0 cultura média suplementada com 5% de soro bovino fetal (FBS).
  19. Deixe os pratos por 3h em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 e deixe as células 143BTK-rho 0 se acomodarem nos fantasmas. Não perturbe os pratos.

3. Fusão dos fibroblastos enucleados com células rho 0

  1. Após 3h de incubação, aspire e descarte o meio dos pratos.
  2. Lave as células aderentes duas vezes com 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) de alta glicose c/o soro ou com meio essencial mínimo (MEM).
  3. Aspire e descarte o meio.
  4. Adicione 500 μL de solução PEG (veja a Tabela de Materiais) às células e incubar por exatamente 1 min.
  5. Aspire e descarte a solução PEG.
  6. Lave as células três vezes usando 2 mL de DMEM de alta glicose c/o soro ou com MEM.
  7. Adicione 2 mL de Fusion Medium (Tabela 1) e incubar durante a noite na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.

4. Seleção e expansão de Cybrid

  1. Após a incubação durante a noite, remova as placas da incubadora, tentepsinizar as células conforme descrito acima (etapas 2.9-2.13), e transfira o conteúdo de cada prato de 35 mm em uma prato de 100 mm.
  2. Adicione 8 mL de Meio de Seleção (Tabela 1) e coloque as placas na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  3. Troque o meio a cada 2-3 dias.
  4. Aguarde ~10-15 dias de seleção até que colônias de células apareçam.
  5. Congele uma das quatro placas de Petri coletando todos os clones e gerando uma cultura "massiva" como um backup dos cibrids, que podem eventualmente ser reestiladas e usadas para investigações posteriores.
  6. Experimente as células nos pratos de cultura restantes, conte e semente em uma ou mais placas de Petri a 50-100 células/prato no Meio de Cultura Suplementar (Tabela 1) até que os clones apareçam. Deixe-os crescer por alguns dias.
  7. Pelota as células restantes por centrifugação a 1.200 × g por 3 min na RT e descarte o sobrenante.
  8. Extrair DNA da pelota (ver a Tabela de Materiais).
  9. Realizar genotipagem por número variável de análise vntr (VNTR) como relatado anteriormente15.
  10. Pegue clones da placa de Petri com cilindros de clonagem ou uma ponta de pipeta, usando um estereoscópio para evitar a agrupação de diferentes clones, e transfira-os para uma placa de 96 poços, cada um contendo 200 μL de Cultura Suplementar (Tabela 1).
  11. Expanda todos os clones até que haja células suficientes para congelar e extrair DNA.
  12. Verifique a porcentagem de mutação de cada clone por RFLP ou outros métodos de sequenciamento. Idealmente, tente obter tanto clones com mtDNA tipo selvagem (mutação de 0%) quanto clones com diferentes percentuais de mutação, ambos somando-se ao mtDNA mutante homoplasmado (mutação de 100%). Consulte a Figura 1 para obter um diagrama esquemático do protocolo de geração cibrid.

Resultados

A geração de cibrids requer 3 dias de trabalho laboratorial mais um período de seleção (~2 semanas) e 1-2 semanas adicionais para o crescimento de clones. As etapas críticas são a qualidade dos citoplastos e o período de seleção. A morfologia dos cibrids se assemelha à das células doadoras rho0. A atribuição do mtDNA correto e nDNA nos cibrids é obrigatória para confirmar a identidade das células. Um exemplo é dado na Figura 2. Neste caso, geramos cibrids a parti...

Discussão

O mtDNA tem uma taxa de mutação muito alta em comparação com o NDNA devido à falta de histonas protetoras e sua localização perto da cadeia respiratória, o que expõe a molécula a efeitos oxidativos prejudiciais não neutralizados eficientemente pelos sistemas de reparo16. As primeiras mutações patogênicas de MTDNA foram identificadas em 198817,18 e, desde então, um grande número de mutações foram descritas. A tecnologia NG...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi realizado no Centro de Estudos de Doenças Pediátricas Mitocondriais (http://www.mitopedia.org), financiado pela Fundação Mariani. VT é membro da European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 well PlatesCorning3516
96 well PlatesCorning3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kitQIAGEN13323
CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-257,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mLBeckman Coulter356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Dialyzed FBSGibco26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)EuroCloneECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)EuroCloneECB4004L
Ethanol Absolute AnhydrousCarlo Erba414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Glass pasteur pipettesVWRM4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell MicroscopyNikonECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum RotorBeckman Coulter339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Essential Medium MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Dishes 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Dishes 35 mmEuroCloneET2035
Sodium Pyruvate 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Referências

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