미토콘드리아 기능 장애를 연구하기위한 체외 접근법 : Cybrid 모델

요약

경미토콘드리아 사이브리드는 미토콘드리아 장애에 의해 영향을 받는 환자로부터 유래된 세포플라스트(enucleated cells)와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)-고갈 세포(rho⁰ cells)를 융합시켜 얻은 하이브리드 세포이다. 그들은 질병의 핵 또는 미토콘드리아 기원의 결정, 생화학 적 활성의 평가 및 mtDNA 관련 변이체의 병원성 역할의 확인을 허용합니다.

초록

산화적 인산화(OXPHOS)를 수행하는 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 결핍은 인간 미토콘드리아 장애의 생화학적 마커이다. 유전 적 관점에서 볼 때, OXPHOS는 핵 DNA (nDNA)와 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 두 가지 별개의 유전 시스템의 보완으로 인해 발생하기 때문에 독특한 예를 나타냅니다. 따라서, OXPHOS 결함은 핵 및 미토콘드리아 코딩된 유전자에 영향을 미치는 돌연변이에 기인할 수 있다.

1989년에 발표된 King과 Attardi의 획기적인 연구는 mtDNA가 고갈된 인간 세포주(rho⁰)가 외인성 미토콘드리아에 의해 재채워져 소위 "트랜스미토콘드리아 사이브리드"를 얻을 수 있음을 보여주었다. 미토콘드리아 장애 (MDs) 환자로부터 유래 된 미토콘드리아와 rho⁰ 세포의 핵을 포함하는 이들 사이브리드 덕분에 결함이 mtDNA- 또는 nDNA와 관련이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 사이브리드는 또한 돌연변이의 병원성을 검증하고 생화학 적 수준에서 그 영향을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 백서에서는 cybrid 생성, 선택 및 특성화를 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

미토콘드리아 장애 (MDs)는 핵 (nDNA) 또는 미토콘드리아 (mtDNA) DNA¹의 돌연변이로 인한 미토콘드리아 기능의 손상으로 인한 다계통 증후군의 그룹입니다. 그들은 가장 흔한 유전 된 대사 질환 중 하나이며 1 : 5,000의 유병률이 있습니다. mtDNA 관련 질병은 미토콘드리아 유전학의 규칙을 따릅니다 : 모성 상속, 이종 혈질 및 역치 효과, 유사분열^{분리 2}. 인간 mtDNA는 복제 및 전사에 필요한 서열, 13개의 단백질 코딩 유전자(호흡 사슬의 모든 서브유닛), 22개의 tRNA 및 2개의 rRNA 유전자를 갖는 짧은 조절 영역을 포함하는 16.6 kb의 이중 가닥 DNA^원이다.

건강한 개체에는 하나의 단일 mtDNA 유전자형 (동종 플라스마)이 있지만 병리학 적 조건에서 하나 이상의 유전자형 (헤테로 플라스마)이 공존합니다. 해로운 이질성 돌연변이는 OXPHOS를 방해하고⁴ 세에 모든 장기에 영향을 줄 수있는 질병을 일으키는 중요한 임계 값을 극복해야합니다. OXPHOS의 이중 유전학은 상속을 지시합니다 : 상염색체 열성 또는 우성 및 nDNA 돌연변이에 대한 X 연결, mtDNA 돌연변이에 대한 모성, nDNA 및 mtDNA 모두에 대한 산발적 인 경우.

미토콘드리아 의학 시대가 시작될 때, King과 Attardi⁵의 획기적인 실험은 mtDNA가 완전히 고갈된 종양 세포주(rho⁰ cells)와 MD 환자의 미토콘드리아로부터 핵을 포함하는 하이브리드 세포를 만들어 MD를 담당하는 돌연변이의 기원을 이해하는 기초를 확립했습니다. 돌연변이가 핵 또는 미토콘드리아 게놈에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 쉽지 않았습니다. 1989 년에 설명 된이 방법은 미 토콘드리아 의학 6,7,8,9 분야에서 일하는 여러 연구자들에 의해 사용되었습니다. 자세한 프로토콜은 최근¹⁰ 번 게시되었지만 아직 비디오가 제작되지 않았습니다. NGS가 돌연변이가 어디에 있는지 정확하고 신속하게 식별 할 수있을 때 왜 그러한 프로토콜이 요즘 관련이 있어야합니까? 대답은 cybrid 생성이 여전히 새로운 mtDNA 돌연변이의 병원성 역할을 이해하고, 이종 형질의 비율을 질병의 중증도와 상관 관계시키고, 환자의 자가성 핵 배경의 기여가 결여되어있는 균질 핵 시스템에서 생화학 적 조사를 수행하는 최첨단 프로토콜이라는 것입니다^{11, 12,13년}.

이 프로토콜은 35mm 페트리 접시에서 자란 합류성 환자 유래 섬유아세포로부터 세포플라스트를 얻는 방법을 기술한다. 시토칼라신 B의 존재하에 접시를 원심분리하면 enucleated cytoplasts의 분리가 가능하며, 이는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재하에 rho⁰ 세포와 융합됩니다. 생성 된 cybrids는 클론이 발생할 때까지 선택적 배지에서 배양됩니다. 대표적인 결과 섹션은 mtDNA가 공여체 환자의 섬유아세포의 그것과 동일하고 nDNA가 종양 rho⁰ 세포주의 핵 DNA와 동일하다는 것을 증명하기 위해 생성된 사이브라이드의 분자 특성화의 예를 보여준다.

프로토콜

참고: 인간 섬유아세포의 사용은 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 섬유 아세포는 MD 환자로부터 유래되었으며 윤리적 요구 사항을 준수하여 기관 바이오 뱅크에 보관되었습니다. 세포의 사용을 위해 정보에 입각한 동의가 제공되었다. 모든 세포 배양 절차를 멸균된 층류 캐비닛 하에 실온(RT, 22-25°C)에서 수행한다. 세포 배양 및 멸균 장비에 적합한 멸균 여과 용액을 사용하십시오. 모든 세포주를 5%_CO2로 37°C의 가습 인큐베이터에서 성장시킨다. 마이코플라즈마 검사는 마이코플라즈마가 없는 배양을 보장하기 위해 매주 실시되어야 합니다. 143BTK-rho0 세포는 앞서 기술한 바와 같이 생성될 수 있다⁵.

1. 세포의 배양

1. 임의의 절차를 시작하기 전에, MD 환자(들)로부터 유래된 섬유아세포에서 돌연변이의 존재를 검증하고, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및/또는 전체 mtDNA 시퀀싱 분석(¹⁴)에 의해 이형질 또는 동형질의 백분율을 정량화한다.
2. 종자 섬유아세포를 네 개의 35mm 페트리 접시에 넣고, 각각 2mL의 완전 배양 배지를 함유한다(표 1). 세포가 80 % 합류 할 때까지 성장하게하십시오 (48 h).
3. 143BTK-rho 0 세포를¹⁰⁰ mm 페트리 디쉬에서 보충된 배지 8 mL (표 1)에서 성장시킨다.
4. 세포를 5%_CO2로 37°C의 인큐베이터에서 유지시킨다.
5. 시퀀싱 기술¹⁴에 의해 rho⁰ 세포에서 mtDNA의 부재를 확인한다.

2. 섬유아세포의 핵형성

1. 적합한 병을 오토클레이브 멸균에 의해 네 개의 250 mL 원심분리기를 20분 사이클 동안 121°C에서 멸균한다. 실험실 오븐이나 RT에서 건조시킵니다.
2. 원심분리기를 37°C에서 예열한다.
3. 섬유아세포가 들어있는 35mm 접시를 두 번 씻고, 칼슘과 마그네슘이 없는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL를 사용합니다.
4. 70 % 에탄올로 접시의 바깥 표면을 닦고 알코올이 증발 할 때까지 기다리십시오.
5. 접시에서 뚜껑을 제거하고 병에서 나사 캡을 제거하십시오. 뚜껑없이 각 접시를 각 250 mL 원심 분리기 병의 바닥에 거꾸로 놓습니다.
6. 각 병에 32mL의 Enucleation Medium을 천천히 첨가하고(표 1), 배지가 접시에 들어가 세포와 접촉할 수 있도록 한다. 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시에서 거품을 제거하고 Bunsen 불꽃으로 팁을 휘어줍니다.
   참고 : 배지가 접시에 들어가서 세포와 접촉 할 수 있도록 거품을 제거하는 것이 중요합니다.
7. 나사 캡으로 각 병을 닫고 원심 분리기로 옮깁니다.
8. 37°C 및 8,000 × g, 최대 가속도, 감속 둔에서 20분 동안 원심분리한다. 원심 분리기의 균형에주의하십시오 : 각 병의 무게를 줄이십시오. 필요한 경우, 적절한 부피의 핵형성 배지를 첨가하여 무게를 조절한다.
9. 원심분리 중에 진공 또는 10 mL 혈청 학적 피펫을 사용하여 흡인하고 143BTK-rho⁰ 배양 플레이트에서 배지를 버리고 칼슘 및 마그네슘을 함유 한 1x PBS 4 mL를 사용하여 두 번 세척하십시오.
10. 트립신 2 mL를 첨가하여 세포 단층을 완전히 덮으십시오.
11. 접시를 ~ 2 분 동안 37 °C 인큐베이터에 놓습니다.
12. 인큐베이터에서 접시를 제거하고, 살아있는 세포 (목표 4x 또는 10x)에 대해 거꾸로 현미경을 사용하여 세포 박리를 관찰하고, 보충 된 배양 배지 2 mL를 첨가하여 효소 활성을 억제하십시오.
13. 4 mL의 세포 현탁액을 10 mL 피펫으로 접시 중의 흡인하고, 이를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
14. Burker 혈구측정기 챔버 또는 자동 카운터를 사용하여 세포를 계수하십시오.
15. 원심분리가 끝나면 (단계 2.8), 병에서 배지를 흡인하고 버린다.
16. 이전에 70 % 에탄올로 뿌려진 멸균 거즈에 병을 뒤집어서 접시를 제거하십시오. 접시의 바깥 표면과 뚜껑을 70 % 에탄올로 닦으십시오. 알코올이 증발 할 때까지 기다린 다음 접시를 닫으십시오.
17. 진행하기 전에 살아있는 세포 (목표 4x 또는 10x)에 대해 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포 플라스트 (유령) 형성을 확인하십시오. 시토칼라신 B에 의해 유도된 핵의 압출로 인해 매우 길쭉한 섬유아세포를 찾으십시오.
18. 각 35 mm 접시에, 5% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 143BTK-rho⁰ 배지 2 mL에 재현탁된 143BTK-rho 0 세포의 1 ×^{10 6}을 첨가한다.
19. 접시를 37°C 및 5%_CO2의 가습된 인큐베이터에 3시간 동안 방치하고 143BTK-rho⁰ 세포가 유령 위에 정착하게 한다. 접시를 방해하지 마십시오.

3. enucleated 섬유아세포와 rho ⁰ 세포의 융합

1. 3 시간의 인큐베이션 후, 흡인하고 접시에서 배지를 버립니다.
2. 혈청이 없는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 고포도당 2mL 또는 최소 필수 배지(MEM)로 부착성 세포를 두 번 세척하십시오.
3. 매체를 흡인하고 버리십시오.
4. 500 μL의 PEG 용액 ( 물질 표 참조)을 세포에 첨가하고 정확히 1 분 동안 인큐베이션한다.
5. 흡인물은 PEG 용액을 버린다.
6. 혈청 없이 또는 MEM으로 DMEM 고글루코스 2mL를 사용하여 세포를 세 번 세척하십시오.
7. 퓨전 배지 2 mL(표 1)를 첨가하고, 5%_CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.

4. 사이브리드 선택 및 확장

1. 밤새 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 상기 기재된 바와 같이 세포를 트립신화하고(단계 2.9-2.13), 각 35 mm 디쉬의 함량을 100 mm 디쉬로 옮긴다.
2. 선택 배지 8 mL(표 1)를 첨가하고, 플레이트를 5%_CO2가 있는 37°C의 인큐베이터에 놓는다.
3. 2-3 일마다 배지를 교체하십시오.
4. 세포의 콜로니가 나타날 때까지 ~ 10-15 일 동안 기다리십시오.
5. 모든 클론을 수집하고 사이브리드의 백업으로 "거대한"배양물을 생성하여 네 개의 페트리 접시 중 하나를 동결시켜 결국 재복제하여 추가 조사에 사용할 수 있습니다.
6. 남은 배양 접시에 있는 세포를 트립신화하고, 계수하고, 클론이 나타날 때까지 보충된 배양 배지(표 1)의 50-100 세포/접시에 있는 하나 이상의 페트리 접시에 종자한다. 그들이 며칠 동안 자라게하십시오.
7. RT에서 3분 동안 1,200 × g 에서 원심분리하여 나머지 세포를 펠릿화하고 상청액을 버린다.
8. 펠렛에서 DNA를 추출 합니다 (물질 표 참조).
9. 이전에 보고된 바와 같이 가변 수의 탠덤 반복(VNTR) 분석에 의한 지노타이핑을 수행한다⁽¹⁵).
10. 클로닝 실린더 또는 피펫 팁이 있는 페트리 접시에서 클론을 집어 들고 입체 현미경을 사용하여 서로 다른 클론의 풀링을 피하고 200μL의 보충 배양 배지를 포함하는 각 웰의 96웰 플레이트로 옮깁니다(표 1).
11. DNA를 동결하고 추출하기에 충분한 세포가있을 때까지 모든 클론을 확장하십시오.
12. RFLP 또는 다른 시퀀싱 방법으로 각 클론의 돌연변이 백분율을 검증한다. 이상적으로는 야생형 mtDNA (0% 돌연변이)를 가진 클론과 돌연변이 비율이 다른 클론을 모두 얻어 동형질 돌연변이 mtDNA (100% 돌연변이)를 합산하는 것이 이상적이다. 사이브리드 생성 프로토콜의 개략도에 대해서는 도 1 을 참조한다.

결과

사이브리드를 생성하려면 3 일간의 실험실 작업과 선택 기간 (~ 2 주)과 클론 성장을위한 추가 1-2 주가 필요합니다. 중요한 단계는 세포 플라스트의 품질과 선택 기간입니다. 사이브리드의 형태학은 rho 0 공여^체 세포의 형태와 유사합니다. 사이브리드에서 정확한 mtDNA 및 nDNA의 할당은 세포의 동일성을 확인하기 위해 필수적이다. 그림 2에 예가 나와 있습니다. 이 경우,...

토론

mtDNA는 보호 히스톤의 부족 및 호흡 사슬에 가까운 그의 위치 때문에 nDNA에 비해 매우 높은 돌연변이율을 가지며, 이는 분자를 복구 시스템⁽¹⁶)에 의해 효율적으로 상쇄되지 않는 손상된 산화 효과에 노출시킨다. 최초의 병원성 mtDNA 돌연변이는 1988 년^17,18 년에 확인되었으며^, 그 이후로 많은 수의 돌연변이가 설명되었습니다. NGS 기술은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G