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Resumen

Este protocolo describe cómo se puede utilizar un sistema de cultivo celular tridimensional para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina en un estado casi fisiológico.

Resumen

Los cultivos planos de células de mamíferos son un enfoque in vitro ampliamente utilizado para comprender la fisiología celular, pero este sistema está limitado en el modelado de tejidos sólidos debido a la replicación celular anormalmente rápida. Esto es particularmente desafiante cuando se modela la cromatina madura, ya que las células de replicación rápida están frecuentemente involucradas en la replicación del ADN y tienen una población poliploide heterogénea. A continuación se presenta un flujo de trabajo para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina inactivas utilizando un sistema de cultivo celular tridimensional (3D). Usando este protocolo, las líneas celulares de carcinoma hepatocelular se cultivan como esferoides 3D reproducibles en una incubadora que proporciona difusión activa de nutrientes y bajas fuerzas de cizallamiento. El tratamiento con butirato de sodio y succinato de sodio indujo un aumento en la acetilación y succinilación de histonas, respectivamente. Los aumentos en los niveles de acetilación y succinilación de histonas se asocian con un estado de cromatina más abierto. Luego se recolectan esferoides para el aislamiento de núcleos celulares, de los cuales se extraen proteínas histonas para el análisis de sus modificaciones post-traduccionales. El análisis de histonas se realiza a través de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en línea, seguida de una tubería computacional interna. Finalmente, se muestran ejemplos de representación de datos para investigar la frecuencia y ocurrencia de marcas de histonas combinatorias.

Introducción

Desde finales delsiglo 19, los sistemas de cultivo celular se han utilizado como modelo para estudiar el crecimiento y desarrollo de las células fuera del cuerpo humano 1,2. Su uso también se ha extendido para estudiar cómo funcionan los tejidos y órganos tanto en contextos sanos como enfermos 1,3. Las células de suspensión (por ejemplo, células sanguíneas) crecen en placas de Petri o matraces sin problemas e indistintamente, ya que no se ensamblan en estructuras tridimensionales (3D) in vivo. Las células derivadas de órganos sólidos pueden crecer en sistemas de cultivo bidimensionales (2D) o 3D. En cultivo 2D, las células se cultivan en una monocapa que se adhiere a una superficie plana 2,4. Los sistemas de cultivo celular 2D se caracterizan por un crecimiento exponencial y un rápido tiempo de duplicación, típicamente de 24 h a unos pocos días5. Las células en los sistemas 3D crecen para formar intrincadas interacciones célula-célula modelando conglomerados similares a tejidos más de cerca, y se caracterizan por su capacidad para alcanzar un equilibrio dinámico donde su tiempo de duplicación puede alcanzar 1 mes o más5.

En este trabajo se presenta una metodología innovadora para cultivar esferoides 3D en sistemas de cultivo celular rotativo que simulan la gravedad reducida6. Este es un derivado simplificado de un sistema de cultivo celular introducido por la NASA en la década de 19907. Este enfoque minimiza las fuerzas de cizallamiento, que ocurren en métodos existentes como los matraces giratorios, y aumenta la reproducibilidad de los esferoides6. Además, el biorreactor giratorio aumenta la difusión activa de nutrientes, minimizando la formación necrótica que se produce en sistemas como el cultivo de células de gota colgante donde el intercambio de medios no es práctico6. De esta manera, las células crecen en su mayoría sin ser molestadas, lo que permite la formación de características estructurales y fisiológicas asociadas con las células que crecen en el tejido. Los hepatocitos C3A (HepG2/C3A) cultivados de esta manera no solo tenían orgánulos ultraestructurales, sino que también producían cantidades de ATP, adenilato quinasa, urea y colesterol comparables a los niveles observados in vivo 1,2. Además, las células cultivadas en sistemas de cultivo celular 2D vs.3D exhiben diferentes patrones de expresión génica8. El análisis de la expresión génica de los hepatocitos C3A cultivados como esferoides 3D mostró que estas células expresaban una amplia gama de proteínas específicas del hígado, así como genes involucrados en vías clave que regulan la función hepática8. Publicaciones anteriores demostraron las diferencias entre proteomas de células de crecimiento exponencial en cultivo 2D vs. células en equilibrio dinámico en cultivos esferoides 3D5. Estas diferencias incluyen el metabolismo celular, que a su vez afecta la estructura, función y fisiología de la célula5. El proteoma de las células cultivadas en cultivo 2D estaba más enriquecido en proteínas implicadas en la replicación celular, mientras que el proteoma de los esferoides 3D estaba más enriquecido en la funcionalidad hepática5.

La tasa de replicación más lenta de las células cultivadas como esferoides 3D modela con mayor precisión fenómenos específicos asociados con el estado y las modificaciones de la cromatina (por ejemplo, recorte de histonas9). El recorte de histonas es una modificación post-traduccional de histonas (PTM) irreversible que causa la escisión proteolítica de parte de la cola N-terminal de la histona. Si bien su función biológica aún está en discusión 10,11,12,13, está claro que su presencia en células primarias y tejido hepático está modelada por células HepG2/C3A cultivadas como esferoides, pero no como células planas 9. Esto es crítico, ya que el estado de la cromatina y las modificaciones regulan la lectura del ADN principalmente modulando la accesibilidad a los genes y, por lo tanto, su expresión14. Los PTM de histonas influyen directamente en el estado de la cromatina al afectar la carga neta de los nucleosomas donde se ensamblan las histonas, o indirectamente al reclutar escritores, lectores y borradores de cromatina14. Cientos de PTM de histonas han sido identificados hasta la fecha15, reforzando la hipótesis de que la cromatina alberga un "código de histonas" utilizado por la célula para interpretar el ADN16. Sin embargo, la identificación de una miríada de combinaciones de PTM15, y el descubrimiento de que las combinaciones de PTM de histonas con frecuencia tienen funciones biológicas diferentes de las PTM presentes de forma aislada (por ejemplo, Fischle, et al.17), pone de relieve que se requiere más trabajo para descifrar el "código de histonas".

Actualmente, el análisis de histona PTM se basa en técnicas que utilizan anticuerpos (por ejemplo, western blots, inmunofluorescencia o inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación [ChIP-seq]) o espectrometría de masas (MS). Las técnicas basadas en anticuerpos tienen una alta sensibilidad y pueden proporcionar información detallada sobre la localización de las marcas de histonas en todo el genoma, pero con frecuencia son limitadas en el estudio de PTM raros o PTM presentes en combinaciones 18,19,20. La EM es más adecuada para la identificación y cuantificación imparcial y de alto rendimiento de modificaciones de proteínas únicas y coexistentes, en particular proteínas histonas 18,19,20. Por estas razones, este y varios otros laboratorios han optimizado la tubería de EM para el análisis de péptidos de histonas (EM de abajo hacia arriba), colas de histonas intactas (EM de medio hacia abajo) y proteínas de histonas de longitud completa (EM de arriba hacia abajo)21,22,23.

A continuación se detalla un flujo de trabajo para cultivar esferoides HepG2 / C3A y prepararlos para el análisis de péptidos de histonas (EM de abajo hacia arriba) a través de cromatografía de nanolíquidos, junto con espectrometría de masas en tándem (nLC-MS / MS). Se cultivó un cultivo celular 2D y las células se cosecharon y se transfirieron a un biorreactor donde comenzarían a formar esferoides (Figura 1). Después de 18 días en cultivo, los esferoides se trataron con butirato de sodio o succinato de sodio para aumentar las abundancias relativas de acetilación y succinilación de histonas. En particular, los cultivos 3D se pueden tratar con compuestos genotóxicos tan bien como sus equivalentes de cultivo plano; de hecho, publicaciones recientes destacan que la respuesta toxicológica de las células en cultivo 3D es más similar a las de los tejidos primarios que a las del cultivo plano 2D24,25. Las células se recogieron en puntos de tiempo específicos y se realizó el aislamiento nuclear. Luego, las histonas fueron extraídas y derivatizadas con anhídrido propiónico antes y después de la digestión de tripsina de acuerdo con un protocolo desarrollado por primera vez por Garcia et al.26. Este procedimiento genera péptidos de un tamaño adecuado para la separación en línea con cromatografía de fase inversa (C18) y la detección con EM. Finalmente, se identificaron y cuantificaron los péptidos de histonas, y los datos generados se representaron de múltiples maneras para una interpretación biológica más completa.

Protocolo

1. Preparación de tampones y reactivos

  1. Medios de crecimiento celular (para células HepG2/C3A): Agregue suero fetal bovino (FBS) (10% v/v), aminoácidos no esenciales (1% v/v), suplemento de L-glutamina (1% v/v) y penicilina/estreptomicina (0,5% v/v) al Medio de Águila Modificada de Dulbecco (DMEM, que contiene 4,5 g/L de glucosa). Los medios de crecimiento se almacenan a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  2. Solución de butirato de sodio (NaBut) de 200 mM: Para preparar 10 ml, resuspenda 220,18 mg de NaBut en 10 ml de ddH2O. Conservar 1 ml de alícuotas a -20 °C. Antes del tratamiento celular, filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,45 mm y agregue 1 ml de la solución filtrada a 9 ml de medios de crecimiento celular para una concentración de trabajo de 20 mM.
  3. Solución de succinato de sodio (NaSuc) de 100 mM: Para preparar 10 ml, resuspenda 162,05 mg de NaSuc en 10 ml de ddH2O. Conservar 1 ml de alícuotas a -20 °C. Antes del tratamiento celular, filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,45 mm y agregue 1 ml de la solución filtrada a 9 ml de medios de crecimiento celular para una concentración de trabajo de 10 mM.
  4. Frío 0.2 M H2SO4: Para preparar 1 L, agregue 10 mL de H2SO4 concentrado a 990 mL de agua de grado HPLC. Conservar a 4 °C.
  5. Acetona fría + ácido clorhídrico al 0,1% (HCl): Añadir HCl concentrado (0,1% v/v) a la acetona. Conservar a 4 °C.
  6. Solución nh4HCO3 de 100 mM, pH 8.0: Para preparar 1 L, resuspenda 7.91 g de NH4HCO3 en 1 L de agua de grado HPLC. Conservar 50 ml de alícuotas a -20 °C.
  7. Solución de ácido trifluoroacético (AGT) al 0,1%: Agregue TFA concentrado (0,1% v/v) al agua de grado HPLC. Conservar a 4 °C.
  8. Solución de acetonitrilo al 60%/0,1% de TFA: Agregue acetonitrilo de grado HPLC (60% v/v) al agua de grado HPLC. Luego, agregue TFA concentrado (0.1% v / v) a esta solución. Conservar a 4 °C.
  9. Acetonitrilo de grado HPLC al 2% + ácido fórmico al 0.1%: Agregue acetonitrilo de grado HPLC (2% v / v) al agua de grado HPLC. Luego, agregue ácido fórmico concentrado (0.1% v / v) a esta solución.
  10. 80% de acetonitrilo de grado HPLC + 0.1% de ácido fórmico: Agregue acetonitrilo de grado HPLC (80% v / v) al agua de grado HPLC. Luego, agregue ácido fórmico concentrado (0.1% v / v) a esta solución.

2. Preparación del sistema de cultivo 3D

NOTA: Diferentes células, primarias o inmortalizadas, tienen diferentes propiedades de cultivo, por lo que la formación de esferoides puede diferir entre los tipos de células. Este protocolo se ha establecido para la formación de esferoides HepG2/C3A utilizando biorreactores y un innovador sistema de cultivo celular 3D.

  1. Usando medios de crecimiento estándar, cultive las células como una monocapa hasta que sean 80% confluentes.
  2. Lavar las células con HBSS (5 mL para un matraz de 75 cm2 ) e incubar las células con 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% diluidas en HBSS (dilución 1:2) durante 5 min a 37 oC con 5% de CO2.
  3. Verifique el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralice la tripsina agregando 3 ml de suero fetal bovino (FBS) o medios de crecimiento (que contengan 5% -10% de FBS).
  4. Contar el número de células y diluir la suspensión celular para obtener 1 x 106 células en un volumen máximo de 1,5 mL.
  5. Equilibre una placa inferior redonda de 24 pocillos de fijación ultrabaja (que contenga múltiples micropocillos por pozo) lavando los pozos con 0,5 ml de medios de crecimiento. Centrifugar la placa durante 5 min a 3.000 x g para eliminar las burbujas de aire de la superficie del pozo.
  6. Transfiera la suspensión celular a la placa y centrífuga durante 3 min a 120 x g.
  7. Incubar la placa durante 24 h a 37 oC con 5% de CO2 para la formación de esferoides. Mientras tanto, equilibre el biorreactor llenando la cámara de humedad con 25 ml de agua estéril y la cámara celular con 9 ml de medios de crecimiento.
  8. Incubar el biorreactor, rotando en la incubadora de clinostat, durante 24 h a 37 oC con 5% de CO2.

3. Crecimiento de esferoides en biorreactores

NOTA: Para preservar la estructura de los esferoides, se utilizan puntas de orificio ancho para manejar las estructuras 3D.

  1. Separe los esferoides de la placa de fijación ultra baja canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo con puntas de orificio de 1 ml de ancho y transfiéralos a un plato tratado con cultivo de tejidos.
  2. Lave el plato con 0,5 ml de medios de crecimiento precalentados y transfiéralo al mismo plato.
  3. Evaluar la calidad de los esferoides por microscopía y seleccionar esferoides suficientemente formados. Los esferoides de buena calidad tienen un tamaño, compacidad y redondez uniformes.
  4. Transfiera los esferoides a biorreactores equilibrados llenos de 5 ml de medios de crecimiento frescos. Después de transferir los esferoides, llene completamente el biorreactor con medios de crecimiento frescos.
  5. Coloque el biorreactor en la incubadora de clinostat y ajuste la velocidad de rotación a 10-11 rpm.
  6. Intercambie medios de crecimiento cada 2-3 días eliminando 10 ml de medios antiguos y reemplazándolos con 10 ml de medios nuevos.
  7. Ajuste la velocidad de rotación de acuerdo con el crecimiento de los esferoides, aumentando a medida que los esferoides crecen en tamaño y número.
  8. Después de 18 días en cultivo, los esferoides están listos para el tratamiento y / o la recolección

4. Tratamiento y recolección de esferoides

NOTA: En este protocolo, los esferoides HepG2/C3A se tratan con butirato de sodio (NaBut) y succinato de sodio (NaSuc) para evaluar los niveles de marcas de histonas que contienen acetilación y succinilación, respectivamente.

  1. Preparar los medios de crecimiento con la concentración de trabajo adecuada del compuesto (por ejemplo, 20 mM de NaBut o 10 mM de NaSuc). Intercambie los medios en el biorreactor con los medios tratados.
    NOTA: Para establecer una condición de control, recolecte suficientes esferoides para los experimentos antes de agregar el tratamiento o designe un biorreactor para los esferoides no tratados.
  2. Recolectar esferoides para el análisis proteómico después de un tiempo de tratamiento suficiente (por ejemplo, 48 h a 1 semana para el tratamiento con NaSuc o 48-72 h para el tratamiento con NaBut).
    NOTA: Para la extracción de histonas utilizando este protocolo, se recolectaron de seis a ocho esferoides que contenían aproximadamente 1 x 106 células.
    1. Retire 3-5 ml de medios del biorreactor a través del puerto superior.
    2. Abra el puerto frontal y use una punta de orificio de 1 ml de ancho para eliminar los esferoides y colocarlos en tubos de microcentrífuga.
    3. Centrifugar los esferoides a 100 x g durante 5 min y desechar los medios.
      NOTA: Los medios en el biorreactor se pueden cambiar y el biorreactor se puede devolver a la incubadora para un tiempo de tratamiento adicional o recuperación.
    4. Lave los esferoides con 200 μL de HBSS para eliminar el FBS. Centrifugar a 100 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
      NOTA: Los esferoides se pueden almacenar a -80 oC hasta su procesamiento.

5. Extracción de histonas

NOTA: Los muchos residuos básicos de aminoácidos presentes en las histonas les permiten interactuar estrechamente con el ADN, que tiene una columna vertebral de ácido fosfórico. Debido a que las histonas son algunas de las proteínas más básicas en el núcleo, cuando se extraen con ácido sulfúrico helado (0.2 M H2SO4) hay una contaminación mínima. Las proteínas no histonas precipitarán en ácido fuerte. El ácido tricloroacético altamente concentrado (TCA) diluido a una concentración final del 33% se utiliza después para precipitar las histonas del ácido sulfúrico. Mantenga todas las muestras, tubos y reactivos en hielo durante toda la extracción de histonas.

  1. Agregue cinco volúmenes (~ 100 μL) de frío 0.2 M H2SO4 al pellet celular (~ 10-20 μL) y pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir el pellet y liberar histonas.
  2. Incubar tubos durante un máximo de 4 h a rotación constante o agitar a 4 oC.
    NOTA: Para muestras resuspendidas que tienen un volumen superior a 500 μL, una incubación de 2 h es suficiente para extraer histonas (una incubación más larga puede resultar en la extracción de otras proteínas nucleares básicas). Para muestras resuspendidas con un volumen inferior a 200 μL, se requiere una incubación de 4 h para un mejor rendimiento.
  3. Centrifugadora a 3.400 x g durante 5 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo y desechar el pellet más tarde.
  4. Agregue TCA concentrado en frío de tal manera que constituya un 25% -33% v / v final (por ejemplo, 40-60 μL de TCA frío: 120 μL de sobrenadante) y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
  5. Incubar los tubos durante al menos 1 h a rotación constante o agitar a 4 oC.
    NOTA: Para tamaños de pellets iniciales más pequeños, se recomienda una incubación durante la noche.
  6. Centrifugar a 3.400 x g durante 5 min a 4 oC. Desechar sobrenadante por pipeteo. Aspirar el sobrenadante con cuidado; no toque los lados del tubo ni el pellet.
    NOTA: Las histonas se depositan tanto en los lados como en la parte inferior del tubo. El pellet blanco insoluble formado en la parte inferior del tubo contiene principalmente proteínas no histonas y otras biomoléculas.
  7. Lave el tubo (paredes y pellet) con acetona fría + 0,1% HCl con una pipeta Pasteur de vidrio (~500 μL/tubo).
  8. Centrifugar a 3.400 x g durante 5 min a 4 oC. Desechar sobrenadante volteando el tubo.
  9. Lave el tubo (paredes y pellet) con acetona 100% fría con una pipeta Pasteur de vidrio (~ 500 μL / tubo). Centrifugadora a 3.400 x g durante 5 min a 4 oC.
  10. Deseche el sobrenadante volteando el tubo y pipeteando la acetona restante. Abra la tapa y seque al aire la muestra en el banco durante ~ 20 minutos.
  11. Proceder a la propionilación o almacenar las muestras en -80 oC hasta su uso.

6. Primera ronda de derivatización

NOTA: El uso de tripsina para digerir las proteínas histonas conduce a péptidos excesivamente pequeños que son difíciles de identificar utilizando configuraciones proteómicas tradicionales. Por esta razón, el anhídrido propiónico se utiliza para derivar químicamente los grupos ɛ-amino de los residuos de lisina no modificados y monometil. Esto restringe la proteólisis de tripsina a los residuos de arginina C-terminal. Para muestras en placas de 96 pocillos, se recomienda el uso de pipetas y depósitos multicanal para la recogida de reactivos (Figura 2A). La derivatización también se realiza después de la digestión para etiquetar el N-termini libre de los péptidos aumentando la hidrofobicidad del péptido y, por lo tanto, la retención cromatográfica de fase inversa.

  1. Muestras de resuspend en 20 μL de acetonitrilo al 15%-20% en bicarbonato de amonio de 100 mM (pH 8.0). Vórtice durante 15 s, y luego girar hacia abajo a 1.000 x g durante 30 s.
  2. Si hay ocho o más muestras, transfiera cada muestra resuspendida a una placa de 96 pocillos.
    NOTA: Si las muestras no se han transferido a una placa de 96 pocillos, se puede usar una pipeta de un solo canal en los pasos 6.3-6.7, 7.1-7.5 y 8.1-8.5.
  3. Debajo del capó, agregue 2 μL de anhídrido propiónico usando una pipeta multicanal. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5x.
  4. Agregue rápidamente 10 μL de hidróxido de amonio usando una pipeta multicanal. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5x.
    NOTA: El ácido propiónico es un producto de la reacción entre el anhídrido propiónico y las aminas libres de péptidos y puede disminuir el pH de la muestra. El pH 8 se puede restablecer agregando hidróxido de amonio a la muestra en una proporción de 1:5 (v/v).
  5. Asegúrese de que el pH sea 8 usando papel de prueba de pH. Si el pH < 8, ajuste agregando 1 μL de hidróxido de amonio. Si el pH > 8, ajuste agregando 1 μL de ácido fórmico o acético. Cuando el pH > 10, es posible etiquetar otros residuos de aminoácidos con pKa más alto.
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  7. Repita los pasos 6.3-6.6. Una doble ronda de propionilación de histonas asegura una eficiencia de reacción casi completa.
  8. Placa seca en vacío de velocidad hasta que todos los pocillos estén completamente secos (~9 h).
  9. Proceda a la digestión de tripsina o almacene las muestras a -80 oC hasta su uso.

7. Digestión de histonas

NOTA: Las histonas se digieren en péptidos usando tripsina, que corta en el lado carboxilo de los residuos de arginina y lisina. Sin embargo, dado que la propionilación modifica los residuos de lisina, solo se escindin los residuos de arginina (Figura 2B).

  1. Preparar solución de tripsina (25 ng/μL en 50 mM NH4HCO3, pH 8.0). Añadir 20 μL de tripsina (500 ng) a cada muestra.
    1. Para preparar la solución NH4HCO3 de 50 mM, diluya la solución 1:1 v/v de NH4HCO3 de 100 mM con agua de grado HPLC.
  2. Asegúrese de que el pH sea 8 usando papel de prueba de pH. Si el pH < 8, ajuste agregando 1 μL de hidróxido de amonio. Si el pH > 8, ajuste agregando 1 μL de ácido fórmico o acético.
  3. Digerir a temperatura ambiente durante la noche o incubar a 37 oC durante 6-8 h.
  4. Si es posible, verifique el pH después de ~ 3 h de digestión, ya que puede haber disminuido. Si el pH < 8, ajuste agregando 1 μL de hidróxido de amonio.
  5. Añadir 5 μL adicionales de solución de tripsina de 50 ng/μL (250 ng) y continuar la digestión.
  6. Proceda a la segunda ronda de propionilación o almacene las muestras a -80 oC hasta su uso.

8. Derivatización del péptido N-termini

NOTA: La propionilación de péptidos de histonas en su extremo N mejora la retención de los péptidos más cortos mediante cromatografía líquida de fase inversa (por ejemplo, aminoácidos 3-8 de histona H3), ya que el grupo propionilo aumenta la hidrofobicidad peptídica.

  1. Debajo del capó, agregue 2 μL de anhídrido propiónico usando la pipeta multicanal. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5x.
  2. Agregue rápidamente 10 μL de hidróxido de amonio utilizando la pipeta multicanal. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5x.
    NOTA: El ácido propiónico es un producto de la reacción entre el anhídrido propiónico y las aminas libres de péptidos, y puede disminuir el pH de la muestra. El pH 8 se puede restablecer agregando hidróxido de amonio a la muestra en una proporción de 1:5 (v/v).
  3. Asegúrese de que el pH sea 8 usando papel de prueba de pH. Si el pH < 8, ajuste agregando 1 μL de hidróxido de amonio. Si el pH > 8, ajuste agregando 1 μL de ácido fórmico o acético. Cuando el pH > 10, es posible etiquetar otros residuos de aminoácidos con pKa más alto.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  5. Repita los pasos 8.1 a 8.4. Una doble ronda de propionilación de histonas asegura una eficiencia de reacción casi completa.
  6. Placa seca en vacío de velocidad hasta que todos los pocillos estén completamente secos (~9 h).
  7. Continúe con el paso de desalinización o almacene las muestras a -80 oC hasta su uso.

9. Desalinización y limpieza de muestras

NOTA: Las sales que están presentes en la muestra interfieren con el análisis de espectrometría de masas. Las sales también se ionizan durante el electropulverización y pueden suprimir las señales de los péptidos. Las sales pueden formar aductos iónicos en los péptidos, lo que hace que el péptido aducido tenga una masa diferente. Esto reduce la intensidad de la señal del péptido e impide una correcta identificación y cuantificación. La configuración para la desalinización se ilustra en la Figura 2C.

  1. Comience a mezclar la resina HLB (50 mg / ml en 100% acetonitrilo) en una placa de agitación magnética.
  2. Asegúrese de que haya una placa de recolección de 96 pocillos colocada debajo de la placa de filtro de polipropileno de 96 pocillos para recoger el flujo.
  3. Agregue 70 μL de suspensión de HLB por pocillo a la placa de filtro. Encienda suavemente la aspiradora para evitar salpicaduras. Descarta el flujo.
  4. Lavar la resina con 100 μL de TFA al 0,1%. Encienda suavemente la aspiradora para evitar salpicaduras. Descarta el flujo.
  5. Resuspend cada muestra en 100 μL de AGT al 0,1%. Compruebe el pH; debe ser ~ 2-3.
  6. Cargue cada muestra en cada pozo. Encienda la aspiradora suavemente para evitar salpicaduras. Descarta el flujo.
  7. Lavar con 100 μL 0.1% TFA. Encienda la aspiradora suavemente para evitar salpicaduras. Descarta el flujo.
  8. Reemplace la placa de recolección con una nueva placa de recolección de 96 pocillos.
  9. Añadir 60 μL de acetonitrilo al 60%/0,1% de AGT por pocillo. Encienda la aspiradora suavemente para evitar salpicaduras. Recoge el flujo y sécalo en un vacío de velocidad.
  10. Proceda a LC-MS/MS o almacene las muestras a -80 oC hasta su uso.

10. Análisis de péptidos de histonas mediante cromatografía líquida junto con espectrometría de masas

  1. Preparar las fases móviles para que se ejecuten en la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Fase A móvil (MPA): 2% de acetonitrilo de grado HPLC + 0,1% de ácido fórmico. Fase B móvil (MPB): 80% de acetonitrilo de grado HPLC + 0,1% de ácido fórmico.
  2. Programe el método HPLC de la siguiente manera: (1) 4% -34% MPB durante 30 min; (2) 34%-90% MPB durante 5 min; y (3) MPB isocrático al 90% durante 5 min. Utilice las siguientes propiedades de columna recomendadas: material de embalaje C18 3 μm, diámetro interno de 75 μm, longitud de 20-25 cm. Ajuste el caudal a 250-300 nL/min para nanocolumnas con un diámetro interno de 75 μm.
    1. En el caso de que el HPLC no esté programado para automatizar el equilibrio de la columna antes de la carga de la muestra, incluya (4) 90%-4% MPB durante 1 min y (5) MPB isocrático 4% durante 10 min.
  3. Programe el método de adquisición de EM.
    1. Asegúrese de que el instrumento realice un escaneo completo de MS al comienzo de cada ciclo de trabajo. Se recomienda la instrumentación de alta resolución (por ejemplo, orbitrap o analizadores de tiempo de vuelo), debido a la precisión de masa que se puede utilizar durante la extracción de la señal. Sin embargo, la instrumentación de baja resolución también se puede utilizar como se describió anteriormente27,28.
    2. Asegúrese de que el análisis completo de MS vaya seguido de 16 eventos de análisis de MS/MS, cada uno con un ancho de aislamiento de 50 m/z, que abarque el rango de m/z de 300-1100. Por ejemplo, el primer escaneo debe aislar las señales a 300-350 m/z, el segundo a 350-400 m/z, etc. Si es posible, adquiera escaneos MS / MS en alta resolución también, pero una resolución más baja en comparación con el escaneo MS completo es suficiente (debido a las masas más pequeñas de iones de fragmentos en comparación con los iones intactos).
    3. El método HPLC generará señales cromatográficas con anchos máximos de ~3-40 s; para garantizar una cuantificación adecuada de la señal, asegúrese de que el espectrómetro de masas realice al menos 10 ciclos de trabajo por pico cromatográfico (es decir, un ciclo de trabajo de 3 s o más rápido).
    4. Si utiliza un analizador de masas de estilo de captura (orbitrap, trampa de iones), asegúrese de que el límite de tiempo de inyección de iones se establezca en <200 ms; para otros analizadores (cuadrupolo, tiempo de vuelo), esto no es un problema debido a su tiempo de escaneo más rápido. Es posible que se requiera una prueba preliminar.
      NOTA: Se pueden encontrar más detalles sobre los métodos de EM para el análisis de péptidos histonos en las siguientes referencias 27,28,29.
  4. Muestra de resuspend en 10 μL de MPA, que corresponde a ~1 μg/μL de muestra de histona digerida. La cantidad de carga exacta no es crítica (tampoco es trivial de evaluar) si todas las muestras del lote se cargan utilizando diluciones y volúmenes similares.
  5. Cargue 1 μL de muestra en la columna hpLC.
  6. Ejecute el método LC-MS/MS programado en los pasos 10.1-10.3.

11. Análisis de datos

  1. Importe los archivos de datos sin procesar de MS en un software diseñado para realizar la integración de área pico.
    NOTA: EpiProfile 30,31 se utiliza en el estudio actual y generalmente se recomienda, ya que está optimizado para la extracción confiable del área pico de péptidos histonas conocidos. Sin embargo, otros programas disponibles gratuitamente para la cromatografía iónica extraída como Skyline32,33 son adecuados.
  2. Calcular la abundancia relativa de un péptido (no) modificado dado como el área de un solo péptido dividida por el área total del péptido en todas sus formas modificadas. Software como EpiProfile30,31 ya contiene bibliotecas de péptidos para la extracción de señales. De lo contrario, genere una biblioteca de péptidos de interés, ya sea manualmente o mediante la identificación de péptidos utilizando tuberías de proteómica de rutina.

Resultados

En este protocolo, los esferoides HepG2/C3A fueron tratados con NaBut de 20 mM y NaSuc de 10 mM, los cuales afectaron los niveles globales de PTM de histonas (Figura 3A). A continuación, se identificaron y cuantificaron los PTM de histonas a nivel de residuo único mediante la adquisición de EM/EM (Figura 3B).

Cuando las muestras se ejecutan en réplicas, se puede realizar un análisis estadístico para evaluar el enriqueci...

Discusión

El análisis de los PTM de histonas es fundamentalmente diferente de la tubería típica de análisis proteómico. La mayoría de los PTM de histonas todavía tienen funciones biológicas enigmáticas; como resultado, no se dispone de anotaciones como Gene Ontology o bases de datos de vías. Existen varios recursos que asocian las modificaciones de histonas con la enzima responsable de su catálisis o proteínas que contienen dominios que se unen a estos PTM (por ejemplo, HISTome36). Además, es p...

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

El laboratorio sidoli agradece a la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck y la Oficina del Director de los NIH (1S10OD030286-01).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin-EDTA solutionGibco25300054
0.5-20 µL pipet tipsBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubesBio-Rad2239480
10 µL multi-channel pipetteBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringeHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettesEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tipsRainin30389164
18 G syringe needleAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipetteCorning4082
2-200 µL pipet tipsBRANDZ740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplateCorning07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flaskCorning461464UUntreated, with vent cap
96-well skirted plateAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetoneFisher ScientificA949-1Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Ammonium hydroxide solutionFisher ScientificAC423300250
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unitCelVivoN/ATablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Formic acidThermo Scientific28905
Fume hoodMottN/AModel 7121000
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-8B9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplementCorning25-015-CI200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA481-212
IceN/AN/A
MEM non-essential amino acidsCorning25-025-CI100X solution
Oasis HLB resinWaters186007549Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQHigh resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plateOrochemOF110096-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI100X solution
pH paperHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 pH test paper
Pipette gunEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillaryMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterileFisher Scientific1367549
Propionic anhydrideSigma-Aldrich240311-50G
Refrigerated centrifugeThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur resinMSWILR13.AQ.0003120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
RotatorClay Adams25477 (American Laboratory Trading)Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsinPromegaV5111
Sodium butyrateThermo ScientificA11079
Sodium succinate dibasicSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)Savant20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Sterile hoodThermo Scientific1375Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dishFisher Scientific08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)Thermo ScientificAC421451000Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)Fisher ScientificPI28904Sequencing grade
Vacuum manifold 96-wellMilliporeMAVM0960R
VortexSigma-AldrichZ258415
Water bathFisher ScientificFSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µLAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µLAxygen14-222-730 (Fisher Scientific)

Referencias

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