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Résumé

Ce protocole décrit comment un système de culture cellulaire tridimensionnel peut être utilisé pour modéliser, traiter et analyser les modifications de la chromatine dans un état quasi physiologique.

Résumé

Les cultures plates de cellules de mammifères sont une approche in vitro largement utilisée pour comprendre la physiologie cellulaire, mais ce système est limité dans la modélisation des tissus solides en raison de la réplication cellulaire anormalement rapide. Ceci est particulièrement difficile lors de la modélisation de la chromatine mature, car les cellules à réplication rapide sont fréquemment impliquées dans la réplication de l’ADN et ont une population polyploïde hétérogène. Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la modélisation, le traitement et l’analyse des modifications de la chromatine au repos à l’aide d’un système de culture cellulaire tridimensionnelle (3D). En utilisant ce protocole, les lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire sont cultivées sous forme de sphéroïdes 3D reproductibles dans un incubateur fournissant une diffusion active des nutriments et de faibles forces de cisaillement. Le traitement au butyrate de sodium et au succinate de sodium a induit une augmentation de l’acétylation des histones et de la succinylation, respectivement. Les augmentations des niveaux d’acétylation des histones et de succinylation sont associées à un état de chromatine plus ouvert. Les sphéroïdes sont ensuite collectés pour isoler les noyaux cellulaires, à partir desquels les protéines d’histones sont extraites pour l’analyse de leurs modifications post-traductionnelles. L’analyse des histones est réalisée par chromatographie liquide couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem, suivie d’un pipeline de calcul interne. Enfin, des exemples de représentation de données pour étudier la fréquence et l’occurrence des marques combinatoires d’histones sont montrés.

Introduction

Depuis la fin du19e siècle, les systèmes de culture cellulaire ont été utilisés comme modèle pour étudier la croissance et le développement des cellules en dehors du corps humain 1,2. Leur utilisation a également été étendue pour étudier le fonctionnement des tissus et des organes dans des contextes sains et malades 1,3. Les cellules en suspension (p. ex. les cellules sanguines) se développent dans des boîtes de Pétri ou des flacons de façon transparente et interchangeable, car elles ne s’assemblent pas dans des structures tridimensionnelles (3D) in vivo. Les cellules dérivées d’organes solides peuvent se développer dans des systèmes de culture bidimensionnels (2D) ou 3D. En culture 2D, les cellules sont cultivées dans une monocouche qui adhère à une surface plane 2,4. Les systèmes de culture cellulaire 2D sont caractérisés par une croissance exponentielle et un temps de doublement rapide, généralement de 24 h à quelques jours5. Les cellules des systèmes 3D se développent pour former des interactions cellules-cellules complexes en modélisant plus étroitement des conglomérats tissulaires, et elles se caractérisent par leur capacité à atteindre un équilibre dynamique où leur temps de doublement peut atteindre 1 mois ou plus5.

Présenté dans cet article est une méthodologie innovante pour cultiver des sphéroïdes 3D dans des systèmes de culture cellulaire rotatifs qui simulent une gravité réduite6. Il s’agit d’un dérivé simplifié d’un système de culture cellulaire introduit par la NASA dans les années 19907. Cette approche minimise les forces de cisaillement, qui se produisent dans les méthodes existantes comme la filature des flacons, et augmente la reproductibilité des sphéroïdes6. En outre, le bioréacteur rotatif augmente la diffusion active des nutriments, minimisant la formation nécrotique qui se produit dans des systèmes tels que la culture cellulaire suspendue où l’échange de milieux n’est pas pratique6. De cette façon, les cellules se développent la plupart du temps sans être dérangées, ce qui permet la formation de caractéristiques structurelles et physiologiques associées à la croissance des cellules dans les tissus. Les hépatocytes C3A (HepG2/C3A) cultivés de cette manière avaient non seulement des organites ultrastructuraux, mais produisaient également des quantités d’ATP, d’adénylate kinase, d’urée et de cholestérol comparables aux niveaux observés in vivo 1,2. En outre, les cellules cultivées en 2D par rapport aux systèmes de culture cellulaire .3D présentent des modèles d’expression génique différents8. L’analyse de l’expression génique des hépatocytes C3A cultivés sous forme de sphéroïdes 3D a montré que ces cellules exprimaient un large éventail de protéines spécifiques au foie, ainsi que des gènes impliqués dans des voies clés qui régulent la fonction hépatique8. Des publications antérieures ont démontré les différences entre les protéomes de cellules à croissance exponentielle en culture 2D et les cellules à l’équilibre dynamique dans les cultures sphéroïdes 3D5. Ces différences incluent le métabolisme cellulaire, qui à son tour affecte la structure, la fonction et la physiologie de la cellule5. Le protéome des cellules cultivées en culture 2D était plus enrichi en protéines impliquées dans la réplication cellulaire, tandis que le protéome des sphéroïdes 3D était plus enrichi en fonctionnalité hépatique5.

Le taux de réplication plus lent des cellules cultivées sous forme de sphéroïdes 3D modélise plus précisément des phénomènes spécifiques associés à l’état et aux modifications de la chromatine (par exemple, coupure d’histone9). L’écrêtage des histones est une modification post-traductionnelle irréversible des histones (PTM) qui provoque un clivage protéolytique d’une partie de la queue N-terminale de l’histone. Bien que sa fonction biologique soit encore en discussion 10,11,12,13, il est clair que sa présence dans les cellules primaires et les tissus hépatiques est modélisée par des cellules HepG2/C3A cultivées sous forme de sphéroïdes, mais pas sous forme de cellules plates 9. Ceci est essentiel, car l’état et les modifications de la chromatine régulent la lecture de l’ADN principalement en modulant l’accessibilité aux gènes et donc leur expression14. Les PTM d’histone influencent soit directement l’état de la chromatine en affectant la charge nette des nucléosomes où les histones sont assemblées, soit indirectement en recrutant des écrivains, des lecteurs et des gommes à base de chromatine14. Des centaines de PTM d’histones ont été identifiés à ce jour15, renforçant l’hypothèse selon laquelle la chromatine héberge un « code d’histone » utilisé par la cellule pour interpréter l’ADN16. Cependant, l’identification d’une myriade de combinaisons ptm15 et la découverte que les combinaisons de PTM d’histones ont souvent des fonctions biologiques différentes des PTM présents isolément (par exemple, Fischle et al.17), soulignent que davantage de travail est nécessaire pour déchiffrer le « code des histones ».

À l’heure actuelle, l’analyse ptm des histones est soit basée sur des techniques utilisant des anticorps (par exemple, transferts de Western, immunofluorescence ou immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage [ChIP-seq]) ou la spectrométrie de masse (SEP). Les techniques à base d’anticorps ont une sensibilité élevée et peuvent fournir des informations détaillées sur la localisation des marques d’histones à l’échelle du génome, mais sont souvent limitées dans l’étude des PTM rares ou des PTM présents dans des combinaisons 18,19,20. La SEP est plus adaptée à l’identification et à la quantification à haut débit et non biaisées des modifications protéiques uniques et coexistantes, en particulier les protéines histones 18,19,20. Pour ces raisons, ce laboratoire et plusieurs autres ont optimisé le pipeline de SEP pour l’analyse des peptides d’histones (SEP ascendante), des queues d’histones intactes (SEP moyennement descendante) et des protéines d’histones pleine longueur (MS descendante)21,22,23.

Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la culture des sphéroïdes HepG2 / C3A et leur préparation à l’analyse peptidique des histones (MS ascendante) par chromatographie nano-liquide, couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem (nLC-MS / MS). Une culture cellulaire 2D a été cultivée et les cellules ont été récoltées et transférées dans un bioréacteur où elles ont commencé à former des sphéroïdes (Figure 1). Après 18 jours de culture, les sphéroïdes ont été traités avec du butyrate de sodium ou du succinate de sodium pour augmenter les abondances relatives d’acétylation et de succinylation des histones. Notamment, les cultures 3D peuvent être traitées avec des composés génotoxiques tout aussi bien que leurs équivalents de culture plate; en fait, des publications récentes soulignent que la réponse toxicologique des cellules en culture 3D est plus similaire aux tissus primaires que celles en culture plate 2D24,25. Les cellules ont ensuite été collectées à des moments précis et l’isolement nucléaire a été effectué. Ensuite, les histones ont été extraites et dérivées avec de l’anhydride propionique avant et après la digestion de la trypsine selon un protocole développé pour la première fois par Garcia et al.26. Cette procédure génère des peptides d’une taille appropriée pour la séparation en ligne avec chromatographie en phase inversée (C18) et la détection avec MS. Enfin, les peptides d’histones ont été identifiés et quantifiés, et les données générées ont été représentées de multiples façons pour une interprétation biologique plus complète.

Protocole

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Milieux de croissance cellulaire (pour les cellules HepG2/C3A) : Ajouter le sérum fœtal bovin (FBS) (10 % v/v), les acides aminés non essentiels (1 % v/v), le supplément de L-glutamine (1 % v/v) et la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v) au milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM, contenant 4,5 g/L de glucose). Les milieux de croissance sont conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.
  2. Solution de butyrate de sodium (NaBut) de 200 mM : Pour préparer 10 mL, remettre en suspension 220,18 mg de NaBut dans 10 mL de ddH2O. Conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C. Avant le traitement cellulaire, filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 mm et ajouter 1 mL de la solution filtrée à 9 mL de milieu de croissance cellulaire pour une concentration de travail de 20 mM.
  3. Solution de succinate de sodium (NaSuc) de 100 mM : Pour préparer 10 mL, remettre en suspension 162,05 mg de NaSuc dans 10 mL de ddH2O. Conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C. Avant le traitement cellulaire, filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 mm et ajouter 1 mL de la solution filtrée à 9 mL de milieu de croissance cellulaire pour une concentration de travail de 10 mM.
  4. Froid 0,2 M H2SO4 : Pour préparer 1 L, ajouter 10 mL deH2SO4 concentré à 990 mL d’eau de qualité CLHP. Conserver à 4 °C.
  5. Acétone froide + 0,1 % d’acide chlorhydrique (HCl) : Ajouter du HCl concentré (0,1 % v/v) à l’acétone. Conserver à 4 °C.
  6. Solution NH4HCO3 à 100 mM, pH 8,0 : Pour préparer 1 L, remettre en suspension 7,91 g de NH4HCO3 dans 1 L d’eau de qualité CLHP. Conserver 50 mL d’aliquotes à -20 °C.
  7. Solution d’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % : Ajouter de l’AGT concentré (0,1 % v/v) à l’eau de qualité CLHP. Conserver à 4 °C.
  8. Solution d’acétonitrile à 60 % / solution de TFA à 0,1 % : Ajoutez de l’acétonitrile de qualité HPLC (60 % v/v) à de l’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez du TFA concentré (0,1 % v/v) à cette solution. Conserver à 4 °C.
  9. Acétonitrile de qualité HPLC à 2 % + 0,1 % d’acide formique : Ajoutez de l’acétonitrile de qualité HPLC (2 % v/v) à de l’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez de l’acide formique concentré (0,1% v/v) à cette solution.
  10. 80 % d’acétonitrile de qualité HPLC + 0,1 % d’acide formique : Ajoutez de l’acétonitrile de qualité HPLC (80 % v/v) à de l’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez de l’acide formique concentré (0,1% v/v) à cette solution.

2. Préparation du système de culture 3D

REMARQUE: Différentes cellules, primaires ou immortalisées, ont des propriétés de culture différentes, de sorte que la formation de sphéroïdes peut différer d’un type de cellule à l’autre. Ce protocole a été établi pour la formation de sphéroïdes HepG2/C3A à l’aide de bioréacteurs et d’un système innovant de culture cellulaire 3D.

  1. En utilisant des milieux de croissance standard, cultivez des cellules en monocouche jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80%.
  2. Laver les cellules avec HBSS (5 mL pour une fiole de 75 cm2 ) et incuber les cellules avec 5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % diluées dans du HBSS (dilution 1:2) pendant 5 min à 37 oC avec 5 % de CO2.
  3. Vérifiez le détachement cellulaire au microscope et neutralisez la trypsine en ajoutant 3 mL de sérum bovin fœtal (FBS) ou de milieu de croissance (contenant 5% à 10% de FBS).
  4. Compter le nombre de cellules et diluer la suspension cellulaire pour obtenir 1 x 106 cellules dans un volume maximum de 1,5 mL.
  5. Équilibrager une plaque de fond ronde de 24 puits à fixation ultra-faible (contenant plusieurs micro-puits par puits) en lavant les puits avec 0,5 mL de milieu de croissance. Centrifugez la plaque pendant 5 min à 3 000 x g pour éliminer les bulles d’air de la surface du puits.
  6. Transférer la suspension de la cellule dans la plaque et centrifuger pendant 3 min à 120 x g.
  7. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 oC avec 5% de CO2 pour la formation de sphéroïdes. Pendant ce temps, équilibrez le bioréacteur en remplissant la chambre d’humidité avec 25 mL d’eau stérile et la chambre cellulaire avec 9 mL de milieu de croissance.
  8. Incuber le bioréacteur, en tournant dans l’incubateur à clinostat, pendant 24 h à 37 oC avec 5% de CO2.

3. Croissance des sphéroïdes dans les bioréacteurs

REMARQUE: Pour préserver la structure des sphéroïdes, de larges pointes d’alésage sont utilisées pour manipuler les structures 3D.

  1. Détachez les sphéroïdes de la plaque de fixation ultra-basse en pipetant doucement de haut en bas avec des embouts d’alésage de 1 mL de large et transférez-les dans un plat traité par culture tissulaire.
  2. Laver la plaque avec 0,5 mL de milieu de croissance préchauffé et transférer dans le même plat.
  3. Évaluer la qualité des sphéroïdes par microscopie et sélectionner des sphéroïdes suffisamment formés. Les sphéroïdes de bonne qualité ont une taille, une compacité et une rondeur uniformes.
  4. Transférer les sphéroïdes dans des bioréacteurs équilibrés remplis de 5 mL de milieux de croissance frais. Après avoir transféré les sphéroïdes, remplissez complètement le bioréacteur avec des milieux de croissance frais.
  5. Placez le bioréacteur dans l’incubateur à clinostat et ajustez la vitesse de rotation à 10-11 tr / min.
  6. Échangez des supports de croissance tous les 2 à 3 jours en retirant 10 mL d’anciens supports et en les remplaçant par 10 mL de nouveaux supports.
  7. Ajustez la vitesse de rotation en fonction de la croissance des sphéroïdes, en augmentant à mesure que les sphéroïdes grandissent en taille et en nombre.
  8. Après 18 jours de culture, les sphéroïdes sont prêts pour le traitement et/ou la collecte

4. Traitement et collecte des sphéroïdes

REMARQUE: Dans ce protocole, les sphéroïdes HepG2 / C3A sont traités avec du butyrate de sodium (NaBut) et du succinate de sodium (NaSuc) pour évaluer les niveaux de marques d’histones contenant de l’acétylation et de la succinylation, respectivement.

  1. Préparer les milieux de croissance avec la concentration de travail appropriée du composé (p. ex., 20 mM de NaBut ou 10 mM de NaSuc). Échangez le milieu dans le bioréacteur avec le milieu traité.
    REMARQUE: Pour établir une condition de contrôle, soit recueillir suffisamment de sphéroïdes pour les expériences avant d’ajouter le traitement, soit désigner un bioréacteur pour les sphéroïdes non traités.
  2. Prélever les sphéroïdes pour l’analyse protéomique après un temps de traitement suffisant (p. ex., 48 h à 1 semaine pour le traitement NaSuc ou 48-72 h pour le traitement NaBut).
    REMARQUE: Pour l’extraction des histones à l’aide de ce protocole, six à huit sphéroïdes contenant environ 1 x 106 cellules ont été collectés.
    1. Retirez 3 à 5 mL de média du bioréacteur par l’orifice supérieur.
    2. Ouvrez l’orifice avant et utilisez une pointe d’alésage de 1 mL de large pour retirer les sphéroïdes et les placer dans des tubes de microcentrifugation.
    3. Centrifuger les sphéroïdes à 100 x g pendant 5 min et jeter le milieu.
      REMARQUE: Les milieux dans le bioréacteur peuvent être changés et le bioréacteur peut être retourné à l’incubateur pour un temps de traitement ou de récupération supplémentaire.
    4. Lavez les sphéroïdes avec 200 μL de HBSS pour éliminer le FBS. Centrifuger à 100 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
      REMARQUE: Les sphéroïdes peuvent être stockés à -80 °C jusqu’au traitement.

5. Extraction des histones

REMARQUE: Les nombreux résidus d’acides aminés basiques présents dans les histones leur permettent d’interagir étroitement avec l’ADN, qui a une colonne vertébrale d’acide phosphorique. Parce que les histones sont parmi les protéines les plus basiques du noyau, lorsqu’elles sont extraites avec de l’acide sulfurique glacé (0,2 M H2SO4), la contamination est minimale. Les protéines non histones précipiteront dans l’acide fort. L’acide trichloroacétique (TCA) hautement concentré dilué à une concentration finale de 33% est ensuite utilisé pour précipiter les histones de l’acide sulfurique. Conservez tous les échantillons, tubes et réactifs sur la glace pendant toute l’extraction des histones.

  1. Ajouter cinq volumes (~100 μL) de froid 0,2 MH2SO4 à la pastille cellulaire (~10-20 μL), et pipeter de haut en bas pour perturber la pastille et libérer des histones.
  2. Incuber les tubes jusqu’à 4 h à rotation constante ou agitation à 4 °C.
    REMARQUE: Pour les échantillons remis en suspension qui ont un volume supérieur à 500 μL, une incubation de 2 h est suffisante pour extraire les histones (une incubation plus longue peut entraîner l’extraction d’autres protéines nucléaires de base). Pour les échantillons remis en suspension d’un volume inférieur à 200 μL, une incubation de 4 h est nécessaire pour un meilleur rendement.
  3. Centrifuger à 3 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Collectez le surnageant dans un nouveau tube et jetez la pastille plus tard.
  4. Ajouter le TCA concentré à froid de telle sorte qu’il constitue un TCA final de 25% à 33% v / v (par exemple, 40-60 μL de TCA froid: 120 μL de surnageant) et mélanger en inversant le tube plusieurs fois.
  5. Incuber les tubes pendant au moins 1 h à rotation constante ou en agitant à 4 °C.
    REMARQUE: Pour les granulés de départ de plus petite taille, une incubation de nuit est recommandée.
  6. Centrifuger à 3 400 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le surnageant par pipetage. Aspirer soigneusement le surnageant; ne touchez pas les côtés du tube ou de la pastille.
    REMARQUE: Les histones se déposent à la fois sur les côtés et au fond du tube. La pastille blanche insoluble formée tout en bas du tube contient principalement des protéines non histones et d’autres biomolécules.
  7. Laver le tube (parois et granulés) avec de l’acétone froide + 0,1% HCl à l’aide d’une pipette Pasteur en verre (~500 μL/tube).
  8. Centrifuger à 3 400 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le surnageant en retournant le tube.
  9. Lavez le tube (parois et granulés) avec de l’acétone 100% froide à l’aide d’une pipette Pasteur en verre (~500 μL/tube). Centrifuger à 3 400 x g pendant 5 min à 4 oC.
  10. Jetez le surnageant en retournant le tube et pipettez l’acétone restante. Ouvrez le couvercle et séchez l’échantillon à l’air libre sur le banc pendant environ 20 min.
  11. Procéder à la propionylation ou conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à leur utilisation.

6. Premier cycle de dérivatisation

REMARQUE: L’utilisation de la trypsine pour digérer les protéines d’histone conduit à des peptides excessivement petits qui sont difficiles à identifier en utilisant les configurations protéomiques traditionnelles. Pour cette raison, l’anhydride propionique est utilisé pour dévatiser chimiquement les groupes ɛ-amino des résidus de lysine non modifiée et monométhyl. Cela limite la protéolyse de la trypsine aux résidus d’arginine C-terminal. Pour les échantillons dans des plaques de 96 puits, l’utilisation de pipettes et de réservoirs multicanaux pour le ramassage des réactifs est recommandée (figure 2A). La dérivatisation est également réalisée après digestion pour marquer les N-termini libres des peptides augmentant l’hydrophobicité peptidique et donc la rétention chromatographique en phase inversée.

  1. Remettre en suspension des échantillons dans 20 μL d’acétonitrile à 15 % à 20 % dans du bicarbonate d’ammonium de 100 mM (pH 8,0). Vortex pendant 15 s, puis rotation à 1 000 x g pendant 30 s.
  2. S’il y a huit échantillons ou plus, transférer chaque échantillon remis en suspension dans une plaque de 96 puits.
    REMARQUE : Si les échantillons n’ont pas été transférés sur une plaque de 96 puits, une pipette à canal unique peut être utilisée aux étapes 6.3-6.7, 7.1-7.5 et 8.1-8.5.
  3. Sous le capot, ajouter 2 μL d’anhydride propionique à l’aide d’une pipette multicanal. Mélanger en pipetant de haut en bas 5x.
  4. Ajouter rapidement 10 μL d’hydroxyde d’ammonium à l’aide d’une pipette multicanal. Mélanger en pipetant de haut en bas 5x.
    REMARQUE: L’acide propionique est un produit de la réaction entre l’anhydride propionique et les amines libres de peptides et peut diminuer le pH de l’échantillon. Le pH 8 peut être rétabli en ajoutant de l’hydroxyde d’ammonium à l’échantillon dans un rapport de 1:5 (v/v).
  5. Assurez-vous que le pH est de 8 à l’aide d’un papier d’essai du pH. Si le pH < 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’hydroxyde d’ammonium. Si le pH > 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’acide formique ou acétique. Lorsque le pH > 10, il est possible de marquer d’autres résidus d’acides aminés avec un pKa plus élevé.
  6. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  7. Répétez les étapes 6.3 à 6.6. Un double tour de propionylation des histones assure une efficacité de réaction presque complète.
  8. Sécher la plaque sous vide jusqu’à ce que tous les puits soient complètement séchés (~9 h).
  9. Procéder à la digestion de la trypsine ou conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

7. Digestion des histones

REMARQUE: Les histones sont digérées en peptides à l’aide de trypsine, qui coupe du côté carboxyle de l’arginine et des résidus de lysine. Cependant, comme la propionylation modifie les résidus de lysine, seuls les résidus d’arginine sont clivés (figure 2B).

  1. Préparer la solution de trypsine (25 ng/μL dans 50 mM NH4HCO3, pH 8,0). Ajouter 20 μL de trypsine (500 ng) à chaque échantillon.
    1. Pour préparer une solution de NH4HCO3 de 50 mM, diluer 100 mM de solution NH4HCO3 1:1 v/v avec de l’eau de qualité CLHP.
  2. Assurez-vous que le pH est de 8 à l’aide d’un papier test de pH. Si le pH < 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’hydroxyde d’ammonium. Si le pH > 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’acide formique ou acétique.
  3. Digérer à température ambiante pendant la nuit ou incuber à 37 °C pendant 6 à 8 h.
  4. Si possible, vérifiez le pH après environ 3 h de digestion, car il peut avoir diminué. Si le pH < 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’hydroxyde d’ammonium.
  5. Ajouter 5 μL supplémentaires de solution de trypsine de 50 ng/μL (250 ng) et poursuivre la digestion.
  6. Passez à la deuxième série de propionylation ou conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

8. Dérivatisation du peptide N-termini

REMARQUE: La propionylation des peptides d’histones à leur terminaison N améliore la rétention des peptides les plus courts par chromatographie liquide en phase inversée (par exemple, les acides aminés 3-8 de l’histone H3), car le groupe propionyle augmente l’hydrophobicité peptidique.

  1. Sous le capot, ajouter 2 μL d’anhydride propionique à l’aide de la pipette multicanal. Mélanger en pipetant de haut en bas 5x.
  2. Ajouter rapidement 10 μL d’hydroxyde d’ammonium à l’aide de la pipette multicanal. Mélanger en pipetant de haut en bas 5x.
    REMARQUE: L’acide propionique est un produit de la réaction entre l’anhydride propionique et les amines libres de peptides, et peut diminuer le pH de l’échantillon. Le pH 8 peut être rétabli en ajoutant de l’hydroxyde d’ammonium à l’échantillon dans un rapport de 1:5 (v/v).
  3. Assurez-vous que le pH est de 8 à l’aide d’un papier d’essai du pH. Si le pH < 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’hydroxyde d’ammonium. Si le pH > 8, ajuster en ajoutant 1 μL d’acide formique ou acétique. Lorsque le pH > 10, il est possible de marquer d’autres résidus d’acides aminés avec un pKa plus élevé.
  4. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  5. Répétez les étapes 8.1 à 8.4. Un double tour de propionylation des histones assure une efficacité de réaction presque complète.
  6. Sécher la plaque sous vide jusqu’à ce que tous les puits soient complètement séchés (~9 h).
  7. Passez à l’étape de dessalement ou conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à leur utilisation.

9. Dessalage et nettoyage des échantillons

REMARQUE: Les sels présents dans l’échantillon interfèrent avec l’analyse par spectrométrie de masse. Les sels sont également ionisés lors de l’électropulvérisation et peuvent supprimer les signaux des peptides. Les sels peuvent former des adduits ioniques sur les peptides, ce qui fait que le peptide adduit a une masse différente. Cela réduit l’intensité du signal du peptide et empêche une identification et une quantification appropriées. La configuration du dessalement est illustrée à la figure 2C.

  1. Commencez à mélanger la résine HLB (50 mg/mL dans 100% d’acétonitrile) sur une plaque d’agitation magnétique.
  2. Assurez-vous qu’une plaque de collecte de 96 puits est placée sous la plaque filtrante en polypropylène de 96 puits pour recueillir le débit.
  3. Ajouter 70 μL de suspension HLB par puits à la plaque filtrante. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Jetez le flux.
  4. Lavez la résine avec 100 μL de 0,1% TFA. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Jetez le flux.
  5. Remettre en suspension chaque échantillon dans 100 μL de 0,1 % de TFA. Vérifiez le pH; il devrait être ~ 2-3.
  6. Chargez chaque échantillon dans chaque puits. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Jetez le flux.
  7. Laver avec 100 μL 0,1% TFA. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Jetez le flux.
  8. Remplacez la plaque de collecte par une nouvelle plaque de collecte de 96 puits.
  9. Ajouter 60 μL d’acétonitrile à 60 % / 0,1 % de TFA par puits. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Collectez le flux et séchez-le dans un vide rapide.
  10. Passez à LC-MS/MS ou conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.

10. Analyse peptidique des histones par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

  1. Préparer les phases mobiles à fonctionner sur la chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Phase mobile A (AMP) : 2 % d’acétonitrile de qualité CLHP + 0,1 % d’acide formique. Phase B mobile (MPB) : 80 % d’acétonitrile de qualité CLHP + 0,1 % d’acide formique.
  2. Programmez la méthode HPLC comme suit : (1) 4 % à 34 % de MPB sur 30 min; (2) 34% -90% MPB sur 5 min; et (3) isocratique 90% MPB pendant 5 min. Utilisez les propriétés de colonne recommandées suivantes : matériau d’emballage C18 3 μm, diamètre intérieur 75 μm, longueur 20-25 cm. Réglez le débit à 250-300 nL/min pour les nano-colonnes d’un diamètre interne de 75 μm.
    1. Dans le cas où la CLHP n’est pas programmée pour automatiser l’équilibrage des colonnes avant le chargement de l’échantillon, incluez (4) 90% -4% MPB sur 1 min et (5) isocratique 4% MPB sur 10 min.
  3. Programmer la méthode d’acquisition de la SEP.
    1. Assurez-vous que l’instrument effectue une analyse complète de la SEP au début de chaque cycle d’utilisation. L’instrumentation à haute résolution (p. ex., les analyseurs orbitrap ou à temps de vol) est recommandée, en raison de la précision de masse qui peut être utilisée lors de l’extraction du signal. Cependant, l’instrumentation basse résolution peut également être utilisée comme décrit précédemment27,28.
    2. Assurez-vous que l’analyse MS complète est suivie de 16 événements d’analyse MS/MS, chacun avec une largeur d’isolement de 50 m/z, couvrant la plage m/z de 300-1100. Par exemple, le premier balayage doit isoler les signaux à 300-350 m/z, le second à 350-400 m/z, etc. Si possible, acquérir des scans MS/MS en haute résolution également, mais une résolution inférieure par rapport au scan MS complet est suffisante (en raison des masses plus petites d’ions fragments par rapport aux ions intacts).
    3. La méthode HPLC générera des signaux chromatographiques avec des largeurs de crête d’environ 3-40 s; pour assurer une quantification adéquate du signal, assurez-vous que le spectromètre de masse effectue au moins 10 cycles d’utilisation par pic chromatographique (c.-à-d. un rapport cyclique de 3 s ou plus).
    4. Si vous utilisez un analyseur de masse de type piégeage (orbitrap, piège à ions), assurez-vous que la limite de temps d’injection d’ions est réglée sur <200 ms; pour les autres analyseurs (quadripôle, temps de vol), ce n’est pas un problème en raison de leur temps d’analyse plus rapide. Un test préliminaire pourrait être nécessaire.
      REMARQUE: Plus de détails sur les méthodes MS pour l’analyse des peptides d’histones peuvent être trouvés dans les références suivantes 27,28,29.
  4. Remettre en suspension l’échantillon dans 10 μL de MPA, ce qui correspond à ~1 μg/μL d’échantillon d’histone digéré. La quantité exacte de chargement n’est pas critique (il n’est pas non plus trivial d’évaluer) si tous les échantillons du lot sont chargés en utilisant des dilutions et des volumes similaires.
  5. Chargez 1 μL d’échantillon sur la colonne HPLC.
  6. Exécutez la méthode LC-MS/MS programmée aux étapes 10.1 à 10.3.

11. Analyse des données

  1. Importez les fichiers de données brutes MS dans un logiciel conçu pour effectuer l’intégration de la zone de pointe.
    REMARQUE: EpiProfile 30,31 est utilisé dans la présente étude et est généralement recommandé, car il est optimisé pour une extraction fiable de la zone de crête des peptides d’histones connus. Cependant, d’autres logiciels disponibles gratuitement pour la chromatographie ionique extraite tels que Skyline32,33 conviennent.
  2. Calculer l’abondance relative d’un peptide (non)modifié donné comme l’aire d’un seul peptide divisée par l’aire totale du peptide sous toutes ses formes modifiées. Des logiciels tels que EpiProfile30,31 contiennent déjà des bibliothèques de peptides pour l’extraction de signaux. Sinon, générez une bibliothèque de peptides d’intérêt manuellement ou via l’identification des peptides à l’aide de pipelines protéomiques de routine.

Résultats

Dans ce protocole, les sphéroïdes HepG2/C3A ont été traités avec 20 mM de NaBut et 10 mM de NaSuc, qui ont tous deux affecté les niveaux globaux d’histones PTM (Figure 3A). Les PTM d’histones ont ensuite été identifiés et quantifiés au niveau de résidu unique par acquisition de MS/MS (Figure 3B).

Lorsque les échantillons sont exécutés en répétitions, une analyse statistique peut être effectuée pour éval...

Discussion

L’analyse des PTM d’histones est fondamentalement différente du pipeline d’analyse protéomique typique. La plupart des PTM d’histones ont encore des fonctions biologiques énigmatiques; par conséquent, les annotations telles que l’ontologie des gènes ou les bases de données de voies ne sont pas disponibles. Il existe plusieurs ressources qui associent les modifications des histones à l’enzyme responsable de leur catalyse ou aux protéines contenant des domaines qui lient ces PTM (par exemple, HISTome

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Le laboratoire Sidoli remercie la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), l’AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck et le NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin-EDTA solutionGibco25300054
0.5-20 µL pipet tipsBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubesBio-Rad2239480
10 µL multi-channel pipetteBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringeHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettesEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tipsRainin30389164
18 G syringe needleAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipetteCorning4082
2-200 µL pipet tipsBRANDZ740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplateCorning07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flaskCorning461464UUntreated, with vent cap
96-well skirted plateAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetoneFisher ScientificA949-1Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Ammonium hydroxide solutionFisher ScientificAC423300250
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unitCelVivoN/ATablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Formic acidThermo Scientific28905
Fume hoodMottN/AModel 7121000
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-8B9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplementCorning25-015-CI200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA481-212
IceN/AN/A
MEM non-essential amino acidsCorning25-025-CI100X solution
Oasis HLB resinWaters186007549Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQHigh resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plateOrochemOF110096-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI100X solution
pH paperHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 pH test paper
Pipette gunEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillaryMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterileFisher Scientific1367549
Propionic anhydrideSigma-Aldrich240311-50G
Refrigerated centrifugeThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur resinMSWILR13.AQ.0003120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
RotatorClay Adams25477 (American Laboratory Trading)Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsinPromegaV5111
Sodium butyrateThermo ScientificA11079
Sodium succinate dibasicSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)Savant20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Sterile hoodThermo Scientific1375Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dishFisher Scientific08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)Thermo ScientificAC421451000Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)Fisher ScientificPI28904Sequencing grade
Vacuum manifold 96-wellMilliporeMAVM0960R
VortexSigma-AldrichZ258415
Water bathFisher ScientificFSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µLAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µLAxygen14-222-730 (Fisher Scientific)

Références

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