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Resumen

En este trabajo, nuestro objetivo era obtener una formulación mediante la carga de dopamina de los exosomas aislados de células madre de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton. En este protocolo se describen el aislamiento y la caracterización de los exosomas, la carga del fármaco en los exosomas resultantes y la actividad citotóxica de la formulación desarrollada.

Resumen

Los exosomas de entre 40 y 200 nm de tamaño constituyen el subgrupo más pequeño de vesículas extracelulares. Estas vesículas bioactivas secretadas por las células desempeñan un papel activo en la carga y la comunicación intercelular. Los exosomas se encuentran principalmente en fluidos corporales como el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la orina, la saliva, el líquido amniótico, el calostro, la leche materna, el líquido articular, el semen y el ácido pleural. Teniendo en cuenta el tamaño de los exosomas, se cree que pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades del sistema nervioso central porque pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). Por lo tanto, este estudio tenía como objetivo desarrollar un sistema de nanoportadores basado en exosomas encapsulando la dopamina en exosomas aislados de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton (WJ-MSC). Los exosomas que pasaron el proceso de caracterización fueron incubados con dopamina. Los exosomas cargados de dopamina se recaracterizaron al final de la incubación. Los exosomas cargados de dopamina se investigaron en ensayos de liberación de fármacos y citotoxicidad. Los resultados mostraron que la dopamina podía encapsularse con éxito dentro de los exosomas y que los exosomas cargados de dopamina no afectaban a la viabilidad de los fibroblastos.

Introducción

Los exosomas, vesículas bioactivas con características significativas, varían en tamaño de 40 nm a 200 nm. Los exosomas se originan en la membrana celular y se forman debido a la liberación de los endosomas1. Estas estructuras sirven como comunicadores de célula a célula e interactúan con las células vecinas para facilitar la transferencia de moléculas activas. Los exosomas se pueden aislar de muchas fuentes diferentes. Estos incluyen fluidos corporales como plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, así como líneas celulares cultivadas en condiciones in vitro . Los exosomas tienen un papel importante en la eliminación del daño nervioso, gracias a las biomacromoléculas que contienen, como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos2. Los glías, que son las células de soporte del sistema nervioso3, transfieren proteínas y micro ARN a los axones de las neuronas a través de exosomas4.

Los lípidos que forman la vaina de mielina, que son un rasgo característico de la conducción nerviosa, también se liberan de los oligodendrocitos a través de los exosomas 4,5. Los exosomas también están implicados en procesos como la plasticidad sináptica, la respuesta al estrés neuronal, la comunicación célula-célula y la neurogénesis en el cerebro 6,7. El hecho de que los exosomas posean nanodimensiones les permite pasar a través de la barrera hematoencefálica. Existe una ruta especial de transición desde el líquido intersticial hasta el líquido cefalorraquídeo después de penetrar en esta membrana8. Gracias a sus propiedades superficiales, los exosomas pueden interactuar de manera eficiente con las células diana como un sistema de administración de fármacos y administrar activamente los fármacos cargados.

Debido a la expresión de diversas proteínas adhesivas (tetraspaninas e integrinas) en la superficie de los exosomas, estas vesículas extracelulares pueden interactuar y fusionarse fácilmente con las membranas de las células huésped9. Se cree que los exosomas pueden utilizarse como sistema de administración de fármacos, especialmente en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central debido a su capacidad para penetrar en la barrera hematoencefálica y sus propiedades superficiales. Los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC) tienen un menor riesgo de rechazo inmunológico en comparación con las terapias celulares alogénicas y, en este sentido, pueden ser un componente importante de las aplicaciones de tratamiento libre de células10.

La dopamina es una molécula cuya deficiencia en el cerebro es el rasgo característico de la enfermedad de Parkinson (EP), empeorando día a día11,12,13. Se sabe que la EP está asociada a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo y a la pérdida de las funciones de las neuronas motoras14,15. La muerte de las neuronas dopaminérgicas impide el suministro del neurotransmisor dopamina al cuerpo estriado cerebral. Esto, a su vez, da lugar a la aparición de síntomas específicos de la EP16. Estos síntomas de la EP son la bradicinesia, la inestabilidad postural, la rigidez y, especialmente, el temblor en reposo12,13. A pesar de que la EP fue descrita por primera vez hace más de dos siglos, los estudios para comprender la patología y etiología de la enfermedad aún están en curso y actualmente se acepta que la EP es una enfermedad sistémica compleja17. Se predice que se produce una deficiencia de dopamina, y se observan síntomas clínicos de EP cuando más del 80% de las neuronas se degeneran18. En el tratamiento de la enfermedad, se prefiere la suplementación incompleta con dopamina para reducir los síntomas motores. Los estudios in vivo han demostrado que la infusión directa de dopamina en el cerebro reduce significativamente los síntomas en animales19. Los precursores de dopamina como la L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) y los fármacos receptores de dopamina se utilizan en la clínica porque la infusión directa de dopamina en el cerebro no es posible en los seres humanos y la dopamina que entra en el sistema no puede atravesar la barrera hematoencefálica20. Este tipo de medicamentos pierden su eficacia con el tiempo. Sin embargo, todavía no existe un enfoque de tratamiento curativo para la EP, por lo que existe una gran necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y modalidades de tratamiento para revelar la fisiopatología de la enfermedad y reducir el impacto de la EP en los pacientes.

Los estudios basados en exosomas han atraído recientemente la atención por recopilar información sobre enfoques terapéuticos y patologías de enfermedades del sistema nervioso. Se ha demostrado que los exosomas derivados de MSC reducen la inflamación en el daño nervioso y contribuyen a la regeneración neuronal21,22,23. Además, se ha reportado que los secretomas de exosomas derivados de MSC reducen la apoptosis al mostrar efectos neurotróficos y neuroprotectores, especialmente en las neuronas dopaminérgicas24,25. La investigación sobre plataformas en las que se utilizan exosomas como sistemas de administración de fármacos terapéuticos se ha acelerado intensamente en los últimos años. En numerosos estudios, se ha observado que los fármacos relevantes pueden encapsularse fácilmente en exosomas y administrarse de forma segura en células, tejidos y órganos diana26,27. Podrían utilizarse diferentes métodos, como la incubación, los ciclos de congelación/descongelación, la sonicación y la extrusión, para la carga de fármacos en los exosomas28.

La coincubación con exosomas o vesículas similares a exosomas permite encapsular pasivamente pequeñas moléculas lipofílicas en estos sistemas de administración28,29,30. En particular, varias moléculas como la curcumina31, la catalasa 30, la doxorrubicina 32 y el paclitaxel33 se cargaron eficazmente en los exosomas. Se ha observado que los exosomas que contienen catalasa, que tienen actividad antioxidante, se acumulan eficientemente en las neuronas y células microgliales del cerebro y exhiben fuertes actividades neuroprotectoras30. En el mismo estudio, se encontró que la saponina, añadida al complejo para aumentar la eficiencia de carga, aumenta el porcentaje de carga del fármaco durante la incubación30,34. Sin embargo, se necesitan más estudios para establecer los estándares para la carga de fármacos en los exosomas.

En este artículo se describe el desarrollo de un sistema de nanoportadores mediante la encapsulación de dopamina en exosomas que se aislaron de WJ-MSC. Se explican en detalle todos los pasos, incluido el cultivo de WJ-MSC, el aislamiento y la caracterización de exosomas, los experimentos de carga de fármacos, la caracterización de exosomas cargados de dopamina con diversas técnicas y el análisis de citotoxicidad in vitro .

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Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.

1. Cultivo y criopreservación de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton

  1. Retire los WJ-MSC (del ATCC) del congelador a -80 °C. Siembre las células en un matraz que contenga medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS). Incubarlos a 37 °C en una incubadora que contenga 5% de CO2.
  2. Cambie el medio de cultivo cada 2 días. Pasa las células cuando alcanzan el 80% de confluencia. Lave las células que se van a pasar con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: El lavado con PBS antes de agregar tripsina asegura una fácil separación de las células de la superficie del matraz.
  3. Retire el PBS y agregue 5 ml de solución de tripsina-EDTA al matraz. Incubar el matraz durante 5 min a 37 °C en una incubadora que contenga 5% de CO2.
  4. Recoger el sobrenadante en el tubo y centrifugar a 1.500 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM-F12 + 10% de FBS al tubo mediante pipeteo.
  5. Transferir las células a un matraz más grande y continuar el cultivo añadiendo DMEM-F12 + 10% de FBS hasta obtener suficientes exosomas35.
    NOTA: Las células cultivadas se congelan a una densidad de 1 millón/ml con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenan a -80 °C.

2. Producción de exosomas a partir de células madre mesenquimales Jelly de Wharton

NOTA: Los exosomas se aíslan de WJ-MSC cultivadas. El aislamiento de exosomas se realiza cuando las células cubren la superficie del matraz y alcanzan aproximadamente el 80% de densidad.

  1. Retire el medio sobrenadante que contiene un 10% de FBS del matraz y lave las celdas con 5 ml de PBS. Agregue el medio DMEM-F12 sin suero a las células después de enjuagar con PBS. Incubar matraces durante 48 h a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Después de la incubación, recoja el medio libre de suero en el tubo y guárdelo a -20 °C.
    NOTA: En el paso 2.1, se recogen 180 ml de medio libre de suero y se almacenan a -20 °C. Después de la descongelación, se inicia un proceso de centrifugación por lotes, como se describe a continuación.
  2. Aislamiento de exosomas
    1. Centrifugar el medio sin suero recogido a 300 x g durante 10 min a +4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a otro tubo.
    2. Centrifugar el sobrenadante recogido a 2.000 × g durante 10 min a +4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a otro tubo.
    3. Centrifugar el sobrenadante recogido a 10.000 × g durante 30 min a +4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a otro tubo.
    4. Transferir el sobrenadante recolectado a tubos de ultracentrífuga y ultracentrífuga a 110.000 × g durante 130 min. Retire lentamente el sobrenadante y agregue 1 ml de PBS al gránulo.
    5. Agitar el pellet y la ultracentrífuga a 110.000 × g durante 70 min a +4 °C36 (Figura 1). Retire lentamente el sobrenadante y agregue 1 ml de PBS al gránulo.
      NOTA: Una vez completados los pasos de ultracentrifugación, los exosomas obtenidos pueden almacenarse a -80 °C. El gránulo obtenido ya está listo para su caracterización.

figure-protocol-3695
Figura 1: Aislamiento de exosomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Caracterización de exosomas

  1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    NOTA: El análisis de seguimiento de nanopartículas se realiza para determinar el tamaño y la concentración de los exosomas aislados. Los comprimidos utilizados para 1x solución de PBS deben estar en el rango de pH 7,3-7,5. La solución 1x PBS contiene 10 mM de tampón de fosfato, 137 mM de cloruro de sodio y 2,7 mM de cloruro de potasio. La solución se prepara añadiendo 1 comprimido de PBS en 100 ml de agua destilada. Esta solución preparada se esteriliza en autoclave.
    1. Diluir los exosomas 100 veces añadiendo 990 μL de PBS a 10 μL de exosomas. Coloque la suspensión diluida en una jeringa desechable.
    2. Encienda el dispositivo NTA y conecte la computadora. Abra el software.
    3. Inyecte la muestra en la jeringa en el tubo de la sección de casete del dispositivo. Cierre la tapa del casete del dispositivo.
    4. En el software que se abre, haga clic en el botón Iniciar análisis . Guarde los resultados obtenidos pulsando el botón Grabar .
  2. Análisis dinámico de dispersión de luz
    NOTA: Los exosomas aislados para la medición del potencial zeta y el tamaño también se diluyen de la misma manera que para el análisis de NTA.
    1. Añadir 980 μL de PBS a 20 μL de los exosomas.
    2. Abra el dispositivo de dimensionamiento zeta y la computadora conectada. Abra el software.
    3. Agregue la suspensión del paso 3.2.1 a la cubeta desechable. Abra la tapa del dispositivo, coloque la cubeta en el casete y cierre la tapa.
    4. Seleccione el tipo de cubeta en el software del dispositivo. Haga clic en el botón Iniciar análisis para el potencial zeta y el análisis dimensional.
      NOTA: Los análisis se realizan por separado para el análisis dimensional y el potencial zeta.

4. Carga de dopamina en los exosomas

NOTA: Una vez completada la caracterización de los exosomas de WJ-MSCs, se obtuvieron exosomas cargados de dopamina como sistema de administración de fármacos. La carga del fármaco en los exosomas se realiza mediante el método de incubación.

  1. Agregue 3 ml de PBS a la suspensión del exosoma del paso 2.2.5. Esterilizar la suspensión diluida por filtración utilizando filtros de 0,22 μm. Transfiera 500 μL de la suspensión de exosomas esterilizada a otro tubo.
  2. Prepare la solución de dopamina (0,5 mg/ml) con agua destilada. Añadir 500 μL de solución de dopamina en los tubos que contienen los exosomas.
  3. Agregue saponina a la suspensión en el paso 4.2. Incubar la suspensión de exosoma dopamina preparada durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: La concentración de saponina no debe exceder el 0,002% de la solución total.
  4. Ultracentrifugar la suspensión a 90.000 × g durante 70 min para eliminar la dopamina y la saponina libres del medio. Almacenar los exosomas aislados a -20 °C hasta su uso para su posterior análisis37.
    NOTA: Agregue ácido ascórbico al 0,02% para la estabilidad de la solución de dopamina preparada.

5. Caracterización de exosomas cargados de dopamina

  1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    NOTA: El análisis de seguimiento de nanopartículas se realiza para determinar el tamaño y la concentración de exosomas aislados.
    1. Siga los pasos 3.1.1-3.1.4 para diluir los exosomas y realizar NTA.
  2. Análisis dinámico de dispersión de luz
    NOTA: Los exosomas aislados para la medición del potencial zeta y el tamaño también se diluyen de manera similar al análisis NTA.
    1. Siga los pasos 3.2.1-3.2.4 para diluir los exosomas y realizar un análisis dinámico de dispersión de la luz.
      NOTA: El tamaño y los potenciales zeta para cada solución (saponina, dopamina, exosoma-dopamina) se analizan por separado.

6. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

NOTA: Las cantidades de dopamina cargadas en los exosomas se miden mediante el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Para detectar la presencia de dopamina dentro de la formulación obtenida, los exosomas se detonan mediante un proceso especial.

  1. Coloque la formulación en un calentador a 75 °C para que se evapore. Agregue acetonitrilo (proporción 50:50) a la suspensión y al vórtice. Sonicar la solución durante 10 min.
  2. Centrifugar la solución durante 10 min a 10.000 × g. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm.
  3. Analice todos los analitos utilizando una columna C18 a 30 °C a un caudal de 1 mL/min (la fase móvil H2O/acetonitrilo). Mida la absorbancia a 230 nm38.

7. Medición de la capacidad de carga del fármaco (DL) y cinética de liberación del fármaco in vitro

  1. Capacidad de carga de fármacos (DL)
    NOTA: La cantidad de dopamina cargada en los exosomas se cuantifica mediante espectroscopía UV-Vis. La absorbancia se lee a 280 nm. Los sobrenadantes recolectados durante la síntesis se utilizan para medir la cantidad de fármaco descargado. La concentración de dopamina en el sobrenadante se determina a través de una curva de calibración estándar para la dopamina.
    1. Prepare una solución madre de 1 mg/ml de dopamina. Prepare concentraciones de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 mg/ml a partir de la solución madre utilizando agua destilada.
      NOTA: Agregue ácido ascórbico al 0,02% para la estabilidad de la solución de dopamina preparada.
    2. Genere una curva de calibración estándar midiendo la absorbancia de cada dilución de dopamina a 280 nm en un espectrofotómetro UV.
    3. Mida la absorbancia del sobrenadante a 280 nm.
    4. Calcule la capacidad de carga de dopamina del fármaco utilizando la Ec (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-10192 100 (1)
      NOTA: El análisis se realiza por triplicado.
  2. Cinética de liberación de fármacos in vitro
    NOTA: La cinética de liberación del fármaco de los exosomas cargados de dopamina se realiza utilizando una membrana de diálisis. El PBS, pH 7,4, se utiliza como medio de liberación para simular un microambiente fisiológico.
    1. Agregue 1 ml de exosomas cargados de dopamina a la membrana de diálisis. Coloque la membrana en un vaso de precipitados. Agregue 15 ml de PBS al vaso de precipitados.
    2. Muestree 1 ml de medio de liberación en un vaso de precipitados a 0,5, 1, 2, 4, 6 y 8 h. En cada momento, reemplace el volumen de la muestra con PBS nuevo. Analice las muestras tomadas a intervalos especificados a 280 nm utilizando un espectrómetro UV-Vis.
    3. Calcule los resultados usando la Ec (2)40.
      Lanzamiento (%) = figure-protocol-11214 100 (2)
      NOTA: Se prepara una curva de calibración para la determinación de la cinética de liberación del fármaco in vitro . La solución de dopamina se prepara a concentraciones de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 y 5,0 mg/ml. El valor de absorbancia UV de cada concentración se determina a 280 nm con un espectrofotómetro UV-Vis.

8. Ensayo de citotoxicidad in vitro

  1. Revitalización y cultivo de fibroblastos
    1. Retire los fibroblastos del congelador a -80 °C. Siembre las células en un matraz que contenga DMEM-F12 + 10% de FBS.
    2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora que contenga 5% de CO2. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.
    3. Pasa las células hasta que alcancen el 80% de confluencia. Siga los pasos 1.3-1.5. Después de la centrifugación a 1.500 × g durante 5 min, retire el sobrenadante, agregue 1 ml de DMEM-F12 + 10% de FBS y siembre 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos.
      1. Añadir medio DMEM-F12 + 10% FBS e incubar las células a 37 °C durante 18 h en una incubadora que contenga 5% de CO2. Cambie el medio de los pocillos al final de la incubación.
    4. Prepare el stock de suspensión de exosomas cargada de dopamina. Diluir la formulación del exosoma cargado de dopamina con medio para obtener concentraciones de 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL y 1.000 μL/mL.
    5. Agregue las concentraciones preparadas en las celdas dentro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar las placas a 37 °C durante 18 h en una incubadora que contenga 5% de CO241.
  2. Ensayo de viabilidad celular MTT
    NOTA: Al final de la incubación, las relaciones de viabilidad de las células se determinan mediante la prueba MTT.
    1. Prepare la solución de MTT (5 mg/mL) con PBS. Agregue 10 μL de solución de MTT a cada pocillo. Incubar durante 4 h a 37 °C.
    2. Al final de la incubación, agregue 100 μL de DMSO a cada pocillo. Incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Medir los valores de absorbancia en el lector ELISA a 570 nm42,43.
      NOTA: La prueba de viabilidad MTT se realiza por triplicado.

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Resultados

Aislamiento y caracterización de exosomas
Las células madre gelatinosas de Wharton se cultivan e incuban en un medio sin suero durante 48 h cuando el cultivo alcanza una densidad suficiente. Una vez finalizada la incubación, el sobrenadante se almacena a -20 °C. Los sobrenadantes recolectados se diluyen con PBS y se someten a ultracentrifugación (Figura 1). La solución obtenida se analiza mediante análisis NTA y DLS. Los exosomas se esterilizan pasando a través d...

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Discusión

Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana con dimensiones de 40-200 nm secretadas por la mayoría de los tipos de células, por ejemplo, las MSC1. Capaces de permitir la comunicación entre células, los exosomas pueden entrar en las células de diferentes maneras, como endocitosis, fagocitosis, micropinocitosis, internalización mediada por lípidos y fusión33,44. En comparación con otros sistemas de nanotransportadores, los lí...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

El trabajo fue financiado principalmente por fondos de investigación proporcionados por los Proyectos de Investigación Científica de la Universidad Técnica de Yıldız (TSA-2021-4713).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm membrane filterAisimoUsed for the sterilization process
0.45 µm syringe filterAisimoUsed for the sterilization process
15 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
50 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)Merck MilliporeUsed in cell culture step
AcetonitrileSigma271004-1LUsed for HPLC analysis
AutoclaveNUVE-OT 90LUsed for the sterilization process
Cell Culture CabinHera Safe KSUsed for the cell culture process
CentrifugalHitachiCF16RNUsed in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UVPanasonicUsed for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10GSigmaH8502-10GUsed in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16AIt was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °CPanasonicMDF-U5386S-PETo store cells and the resulting exosomes
FridgePanasonicMPR-215-PEUsed to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLCAgilent TechnologiesThe presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- PrimovertZeissUsed to observe cells in cell culture.
MTT AssayBiomatikUsed to measure cell viability
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalUsed for exosome characterization
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman CoulterUsed in the exosome isolation step
PBS tabletBiomatik43602In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin SolutionCapricornPB-SIt was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette AidIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMUsed in the preparation of solutions
Q500 SonicatorQsonica, LLCUsed to digest exosomes in HPLC analysis
SaponinSigma47036-50G-FIt was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-SpectrophotometryBMG LABTECHUsed for MTT and drug release analyzes
SPSS 22statistical package program
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexUsed to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-SenovaSenovaUsed in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cellsATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSUsed for exosome characterization

Referencias

  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

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