JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.

Аннотация

Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.

Введение

Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом1. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакромолекулам, таким как липиды, белки и нуклеиновыекислоты. Глии, которые являются опорными клетками нервной системы3, переносят белки и микроРНК к аксонам нейронов через экзосомы4.

Липиды, образующие миелиновую оболочку, которые являются характерной особенностью нервной проводимости, также высвобождаются из олигодендроцитов через экзосомы 4,5. Экзосомы также участвуют в таких процессах, как синаптическая пластичность, реакция нейронов на стресс, межклеточная коммуникация и нейрогенез в мозге 6,7. Тот факт, что экзосомы обладают наноразмерностью, позволяет им проходить через ГЭБ. Существует специальный путь перехода от интерстициальной жидкости к спинномозговой жидкости после проникновения через эту мембрану8. Благодаря своим поверхностным свойствам экзосомы могут эффективно взаимодействовать с клетками-мишенями в качестве системы доставки лекарств и активно доставлять загруженные лекарства.

Благодаря экспрессии различных адгезивных белков (тетраспанинов и интегринов) на поверхности экзосом эти внеклеточные везикулы могут легко взаимодействовать и сливаться с клеточными мембранамихозяина 9. Считается, что экзосомы могут быть использованы в качестве системы доставки лекарств, особенно при лечении заболеваний центральной нервной системы из-за их способности проникать в ГЭБ и их поверхностных свойств. Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), имеют более низкий риск иммунного отторжения по сравнению с аллогенной клеточной терапией, и в этом отношении они могут быть важным компонентом применения бесклеточного лечения10.

Дофамин – это молекула, дефицит которой в головном мозге является характерным признаком болезни Паркинсона (БП), ухудшающейся день ото дня11,12,13. Известно, что болезнь Паркинсона ассоциирована с дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции мезэнфералона и потерей функций двигательных нейронов14,15. Гибель дофаминергических нейронов препятствует поступлению нейромедиатора дофамина в полосатое тело головного мозга. Это, в свою очередь, приводит к возникновению симптомов, специфичных для БП16. Такими симптомами БП являются брадикинезия, постуральная нестабильность, ригидность и особенно тремор в покое12,13. Несмотря на то, что болезнь Паркинсона была впервые описана более двух столетий назад, исследования, направленные на понимание патологии и этиологии заболевания, все еще продолжаются, и в настоящее время признано, что болезнь Паркинсона является сложным системнымзаболеванием. Прогнозируется, что дефицит дофамина возникает, а клинические симптомы болезни Паркинсона наблюдаются при дегенерации более 80% нейронов18. При лечении заболевания предпочтение отдается неполному приему дофамина для уменьшения двигательных симптомов. Исследования in vivo показали, что прямая инфузия дофамина в мозг значительно уменьшает симптомыу животных. Предшественники дофамина, такие как L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин) и препараты дофаминовых рецепторов, используются в клинике, потому что прямая инфузия дофамина в мозг у человека невозможна, и дофамин, попадая в систему, не может пересечьГЭБ-20. Эти виды препаратов со временем теряют свою эффективность. Тем не менее, до сих пор не существует подхода к лечению болезни Паркинсона. Следовательно, существует огромная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий и методов лечения для выявления патофизиологии заболевания и снижения влияния БП на пациентов.

Исследования на основе экзосом в последнее время привлекли внимание в связи со сбором информации как о терапевтических подходах, так и о патологиях заболеваний нервной системы. Было показано, что экзосомы, полученные из МСК, уменьшают воспаление при повреждении нервов и способствуют регенерации нейронов21,22,23. Кроме того, сообщалось, что секретомы экзосом, полученные из МСК, снижают апоптоз, проявляя нейротрофические и нейропротекторные эффекты, особенно на дофаминергических нейронах24,25. Исследования платформ, в которых экзосомы используются в качестве терапевтических систем доставки лекарств, интенсивно ускорились в последние годы. В многочисленных исследованиях было замечено, что соответствующие лекарственные препараты могут быть легко инкапсулированы в экзосомы и безопасно доставлены в клетки, ткани и органы-мишени26,27. Различные методы, такие как инкубация, циклы замораживания/оттаивания, ультразвуковая обработка и экструзия, могут быть использованы для загрузки лекарств в экзосомы28.

Коинкубация с экзосомами или экзосомоподобными везикулами позволяет пассивно инкапсулировать липофильные малые молекулы в эти системы доставки28,29,30. В частности, различные молекулы, такие как куркумин31, каталаза30, доксорубицин 32 и паклитаксел33, были эффективно загружены в экзосомы. Было замечено, что каталазосодержащие экзосомы, обладающие антиоксидантной активностью, эффективно накапливаются в нейронах и клетках микроглии головного мозга и проявляют сильную нейропротекторную активность30. В этом же исследовании было обнаружено, что сапонин, добавленный в комплекс для повышения эффективности загрузки, увеличивает процент загрузки препарата во время инкубации30,34. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить стандарты загрузки лекарств в экзосомы.

В данной работе описывается разработка системы наноносителей путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, которые были выделены из WJ-MSCs. Подробно объясняются все этапы, включая культивирование WJ-МСК, выделение и характеристику экзосом, эксперименты по загрузке лекарственными препаратами, характеристику экзосом, нагруженных дофамином, с помощью различных методов и анализ цитотоксичности in vitro .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Культивирование и криоконсервация желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона

  1. Извлеките WJ-MSC (из ATCC) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Высевают клетки в колбу, содержащую среду DMEM-F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубируют их при температуре 37 °C в инкубаторе, содержащем 5%СО2.
  2. Меняйте питательную среду каждые 2 дня. Проходите клетки, когда они достигнут 80% слияния. Промойте клетки, которые нужно пассировать, 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка PBS перед добавлением трипсина обеспечивает легкое отделение клеток от поверхности колбы.
  3. Снимите PBS и добавьте в колбу 5 мл раствора трипсина-ЭДТА. Инкубируют колбу в течение 5 мин при 37 °С в инкубаторе, содержащем 5%СО2.
  4. Соберите надосадочную жидкость в пробирку и центрифугируйте при 1 500 x g в течение 5 минут. После центрифугирования удалить надосадочную жидкость и путем пипетирования добавить в пробирку 1 мл DMEM-F12 + 10% FBS.
  5. Переносят клетки в колбу большего размера и продолжают культивирование, добавляя DMEM-F12 + 10% FBS до получения достаточного количества экзосом35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируемые клетки замораживают при плотности 1 миллион/мл с 10% диметилсульфоксидом (ДМСО) и хранят при -80 °C.

2. Получение экзосом из мезенхимальных стволовых клеток Wharton's Jelly

ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы выделяют из культивируемых WJ-MSCs. Выделение экзосом выполняется, когда клетки покрывают поверхность колбы и достигают примерно 80% плотности.

  1. Удалить из колбы надосадочную среду, содержащую 10% ФБС, и промыть клетки 5 мл ПБС. Добавьте в клетки безсывороточную среду DMEM-F12 после промывки PBS. Инкубируют колбы в течение 48 ч при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2. После инкубации соберите свободную от сыворотки среду в пробирку и храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 2.1 собирается и хранится 180 мл среды, не содержащей сыворотки, при -20 °C. После размораживания запускается процесс периодического центрифугирования, как описано ниже.
  2. Выделение экзосом
    1. Центрифугируют собранную свободную от сыворотки среду при 300 x g в течение 10 мин при +4 °C. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
    2. Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при 2 000 × г в течение 10 мин при +4 °С. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
    3. Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при 10 000 × г в течение 30 мин при +4 °С. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
    4. Собранную надосадочную жидкость переносят в ультрацентрифужные пробирки и ультрацентрифугу при 110 000 × г в течение 130 мин. Медленно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS к грануле.
    5. Вихрят гранулу и ультрацентрифугу при 110 000 × г в течение 70 мин при +4 °C36 (рисунок 1). Медленно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS к грануле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этапов ультрацентрифугирования полученные экзосомы можно хранить при -80 °C. Теперь полученная гранула готова к определению характеристик.

figure-protocol-3730
Рисунок 1: Изоляция экзосом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Характеристика экзосом

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ отслеживания наночастиц выполняется для определения размера и концентрации изолированных экзосом. Таблетки, используемые для 1х раствора PBS, должны быть в пределах рН 7,3-7,5. 1x Раствор PBS содержит 10 мМ фосфатного буфера, 137 мМ хлорида натрия и 2,7 мМ хлорида калия. Раствор готовят, добавляя 1 таблетку PBS в 100 мл дистиллированной воды. Приготовленный раствор стерилизуют автоклавированием.
    1. Разбавьте экзосомы в 100 раз, добавив 990 мкл PBS к 10 мкл экзосом. Разведенную суспензию набрать в одноразовый шприц.
    2. Включите устройство NTA и подключите компьютер. Откройте программное обеспечение.
    3. Введите образец в шприце в трубку в кассетной секции устройства. Закройте крышку кассеты устройства.
    4. В открывшемся программном обеспечении нажмите на кнопку «Начать анализ ». Сохраните результаты, полученные нажатием кнопки Запись .
  2. Динамический анализ рассеяния света
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы, выделенные для измерения дзета-потенциала и размера, также разбавляются таким же образом, как и для анализа NTA.
    1. Добавьте 980 мкл PBS к 20 мкл экзосом.
    2. Откройте устройство определения размера дзета и подключенный компьютер. Откройте программное обеспечение.
    3. Добавьте суспензию из шага 3.2.1 в одноразовую кювету. Откройте крышку устройства, поместите кювету в кассету и закройте крышку.
    4. Выберите тип кюветы в программном обеспечении устройства. Нажмите кнопку «Начать анализ » для анализа дзета-потенциала и размерности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы выполняются отдельно для размерного анализа и дзета-потенциала.

4. Загрузка дофамина в экзосомы

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как характеристика экзосом WJ-MSC завершена, были получены дофаминовые экзосомы в качестве системы доставки лекарств. Загрузка препарата в экзосомы производится инкубационным методом.

  1. Добавьте 3 мл PBS к суспензии экзосом, начиная с шага 2.2.5. Стерилизуют разбавленную суспензию фильтрацией с помощью фильтров 0,22 мкм. Переложите 500 мкл стерилизованной суспензии экзосом в другую пробирку.
  2. Раствор дофамина (0,5 мг/мл) приготовить с дистиллированной водой. Добавьте 500 мкл раствора дофамина в пробирки, содержащие экзосомы.
  3. Добавьте сапонин в суспензию на шаге 4.2. Готовую экзосомно-дофаминовую суспензию инкубируют в течение 24 ч при 37 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация сапонина не должна превышать 0,002% от общего раствора.
  4. Ультрацентрифугируют суспензию при концентрации 90 000 × г в течение 70 мин, чтобы удалить свободный дофамин и сапонин из среды. Изолированные экзосомы хранят при -20 °C до использования для дальнейшего анализа37.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,02% аскорбиновой кислоты для стабильности приготовленного раствора дофамина.

5. Характеристика экзосом, нагруженных дофамином

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ отслеживания наночастиц выполняется для определения размера и концентрации изолированных экзосом.
    1. Выполните шаги 3.1.1-3.1.4, чтобы разбавить экзосомы и выполнить NTA.
  2. Динамический анализ рассеяния света
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы, выделенные для измерения дзета-потенциала и размера, также разбавляются аналогично анализу NTA.
    1. Выполните шаги 3.2.1-3.2.4, чтобы разбавить экзосомы и выполнить динамический анализ рассеяния света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер и дзета-потенциалы для каждого раствора (сапонин, дофамин, экзосома-дофамин) анализируются отдельно.

6. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дофамина, загруженного в экзосомы, измеряется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для обнаружения присутствия дофамина в полученном препарате экзосомы детонируют специальным процессом.

  1. Поместите состав в нагреватель с температурой 75 °C, чтобы он испарился. Добавьте ацетонитрил (соотношение 50:50) в суспензию и вихрь. Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 10 мин.
  2. Центрифугируют раствор в течение 10 мин при 10 000 × г. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм.
  3. Анализируют все аналиты с помощью колонки С18 при 30 °C при скорости потока 1 мл/мин (подвижная фаза H2O/ацетонитрил). Измерьте абсорбцию при 230 нм38.

7. Измерение нагружающей способности лекарственного средства (DL) и кинетики высвобождения лекарств in vitro

  1. Емкость загрузки лекарственными препаратами (DL)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дофамина, загруженного в экзосомы, количественно оценивается с помощью УФ-видимой спектроскопии. Поглощение считывается на длине волны 280 нм. Собранные надосадочные жидкости во время синтеза используются для измерения количества незагруженного препарата. Концентрация дофамина в надосадочной жидкости определяется с помощью стандартной калибровочной кривой для дофамина.
    1. Приготовьте исходный раствор 1 мг/мл дофамина. Готовят концентрации 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл из исходного раствора, используя дистиллированную воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,02% аскорбиновой кислоты для стабильности приготовленного раствора дофамина.
    2. Сгенерируйте стандартную калибровочную кривую, измерив поглощение каждого разведения дофамина на длине волны 280 нм в УФ-спектрофотометре.
    3. Измерьте абсорбцию надосадочной жидкости при длине волны 280 нм.
    4. Рассчитайте емкость лекарственной нагрузки для дофамина, используя уравнение (1)39.
      ДЛ (%) = figure-protocol-10065 100 (1)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ выполняется в трех экземплярах.
  2. Кинетика высвобождения лекарств in vitro
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кинетика высвобождения лекарственных средств экзосом, нагруженных дофамином, осуществляется с помощью диализной мембраны. PBS, рН 7,4, используется в качестве разделительной среды для моделирования физиологического микроокружения.
    1. Добавьте 1 мл экзосом, нагруженных дофамином, в диализную мембрану. Поместите мембрану в стакан. Добавьте 15 мл PBS в стакан.
    2. Отобразить 1 мл разделительной среды в стакане через 0,5, 1, 2, 4, 6 и 8 ч. В каждый момент времени заменяйте объем образца свежим PBS. Анализируйте образцы, взятые через заданные интервалы на длине волны 280 нм, с помощью УФ-видимого спектрометра.
    3. Вычислите результаты, используя уравнение (2)40.
      Выпуск (%) = figure-protocol-11061 100 (2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения кинетики высвобождения лекарственного препарата in vitro составляется калибровочная кривая. Раствор дофамина готовят в концентрациях 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 и 5,0 мг/мл. Значение поглощения УФ-излучения каждой концентрации определяется на длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра УФ-ВИДИМОГО диапазона.

8. Тест на цитотоксичность in vitro

  1. Ревитализация и культивирование фибробластов
    1. Извлеките фибробласты из морозильной камеры с температурой -80 °C. Высейте клетки в колбу, содержащую DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Инкубируют клетки при температуре 37 °C в инкубаторе, содержащем 5%СО2. Меняйте питательную среду каждые 2 дня.
    3. Проходите ячейки до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния. Выполните шаги 1.3-1.5. После центрифугирования при 1 500 × г в течение 5 мин удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл DMEM-F12 + 10% FBS и засейте 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет.
      1. Добавляют DMEM-F12 medium + 10% FBS и инкубируют клетки при 37 °C в течение 18 ч в инкубаторе, содержащем 5% CO2. Смените среду лунок в конце инкубации.
    4. Подготовьте запас дофаминовой суспензии экзосом. Разбавьте экзосомную формулу, насыщенную дофамином, средой для получения концентраций 100 мкл/мл, 250 мкл/мл, 500 мкл/мл и 1000 мкл/мл.
    5. Добавьте подготовленные концентрации в ячейки внутри каждой лунки 96-луночной планшета. Инкубируют планшеты при 37 °С в течение 18 ч в инкубаторе, содержащем 5%СО241.
  2. Анализ жизнеспособности клеток МТТ
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце инкубации коэффициенты жизнеспособности клеток определяются с помощью теста МТТ.
    1. Приготовьте раствор МТТ (5 мг/мл) с PBS. Добавьте 10 мкл раствора МТТ в каждую лунку. Выдерживают 4 ч при температуре 37 °C.
    2. В конце инкубации добавьте в каждую лунку по 100 мкл ДМСО. Выдерживают планшеты в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Измерьте значения абсорбции в ИФА-ридере при длине волны 570 нм42,43.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на жизнеспособность МТТ проводится в трех экземплярах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Выделение и характеристика экзосом
Стволовые клетки Уортонского желе культивируют и инкубируют в безсывороточной среде в течение 48 ч, когда культура достигает достаточной плотности. После окончания инкубации надосадочную жидкость хранят при температуре -20 °С. Собранные н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК1. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа была в основном поддержана финансированием исследований, предоставленным Научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm membrane filterAisimoUsed for the sterilization process
0.45 µm syringe filterAisimoUsed for the sterilization process
15 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
50 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)Merck MilliporeUsed in cell culture step
AcetonitrileSigma271004-1LUsed for HPLC analysis
AutoclaveNUVE-OT 90LUsed for the sterilization process
Cell Culture CabinHera Safe KSUsed for the cell culture process
CentrifugalHitachiCF16RNUsed in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UVPanasonicUsed for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10GSigmaH8502-10GUsed in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16AIt was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °CPanasonicMDF-U5386S-PETo store cells and the resulting exosomes
FridgePanasonicMPR-215-PEUsed to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLCAgilent TechnologiesThe presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- PrimovertZeissUsed to observe cells in cell culture.
MTT AssayBiomatikUsed to measure cell viability
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalUsed for exosome characterization
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman CoulterUsed in the exosome isolation step
PBS tabletBiomatik43602In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin SolutionCapricornPB-SIt was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette AidIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMUsed in the preparation of solutions
Q500 SonicatorQsonica, LLCUsed to digest exosomes in HPLC analysis
SaponinSigma47036-50G-FIt was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-SpectrophotometryBMG LABTECHUsed for MTT and drug release analyzes
SPSS 22statistical package program
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexUsed to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-SenovaSenovaUsed in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cellsATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSUsed for exosome characterization

Ссылки

  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены