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Resumo

Nosso objetivo foi obter uma formulação por carga de dopamina dos exossomos isolados de células-tronco da geleia mesenquimal de Wharton. O isolamento e caracterização dos exossomos, a carga do fármaco nos exossomos resultantes e a atividade citotóxica da formulação desenvolvida são descritos neste protocolo.

Resumo

Exossomos entre 40 e 200 nm de tamanho constituem o menor subgrupo de vesículas extracelulares. Essas vesículas bioativas secretadas pelas células desempenham um papel ativo na carga intercelular e na comunicação. Os exossomos são encontrados principalmente em fluidos corporais como plasma, líquido cefalorraquidiano, urina, saliva, líquido amniótico, colostro, leite materno, líquido articular, sêmen e ácido pleural. Considerando o tamanho dos exossomos, acredita-se que eles possam desempenhar um papel importante em doenças do sistema nervoso central, pois podem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um sistema nanocarreador baseado em exossomos por meio do encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ). Os exossomos que passaram pelo processo de caracterização foram incubados com dopamina. Os exossomos carregados de dopamina foram recaracterizados ao final da incubação. Exossomos com dopamina foram investigados em ensaios de liberação de fármacos e citotoxicidade. Os resultados mostraram que a dopamina pode ser encapsulada com sucesso dentro dos exossomos e que os exossomos carregados de dopamina não afetaram a viabilidade dos fibroblastos.

Introdução

Os exossomos, vesículas bioativas com características significativas, variam em tamanho de 40 nm a 200 nm. Os exossomos originam-se da membrana celular e são formados devido à liberação dos endossomos1. Essas estruturas servem como comunicadores célula a célula e interagem com células vizinhas para facilitar a transferência de moléculas ativas. Os exossomos podem ser isolados de muitas fontes diferentes. Estes incluem fluidos corporais como plasma, urina, líquido cefalorraquidiano, saliva, bem como linhagens celulares cultivadas em condições in vitro . Os exossomos têm papel importante na eliminação de lesões nervosas, graças às biomacromoléculas que contêm, como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos2. A glia, que são as células de suporte do sistema nervoso3, transfere proteínas e micro RNAs para os axônios dos neurônios via exossomos4.

Os lipídios que formam a bainha de mielina, característicos da condução nervosa, também são liberados dos oligodendrócitos via exossomos 4,5. Os exossomos também estão envolvidos em processos como plasticidade sináptica, resposta neuronal ao estresse, comunicação célula-célula e neurogênese no cérebro 6,7. O fato de os exossomos possuírem nanodimensões permite que eles passem pelo BBB. Existe uma rota especial de transição do líquido intersticial para o líquido cefalorraquidiano após a penetração dessa membrana8. Graças às suas propriedades de superfície, os exossomos podem interagir eficientemente com as células-alvo como um sistema de liberação de drogas e entregar ativamente os medicamentos carregados.

Devido à expressão de várias proteínas adesivas (tetraspaninas e integrinas) na superfície dos exossomos, essas vesículas extracelulares podem facilmente interagir e fundir-se com as membranas celulares dohospedeiro9. Acredita-se que os exossomos podem ser usados como um sistema de liberação de drogas, especialmente no tratamento de doenças do sistema nervoso central, devido à sua capacidade de penetrar na BHE e suas propriedades de superfície. Exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam menor risco de rejeição imunológica quando comparados às terapias celulares alogênicas e, nesse aspecto, podem ser um componente importante de aplicações de tratamento livre de células10.

A dopamina é uma molécula cuja deficiência no cérebro é a característica da doença de Parkinson (DP), agravando-se a cada dia11,12,13. Sabe-se que a DP está associada à degeneração de neurônios dopaminérgicos na substância negra do mesencéfalo e à perda das funções dos neurônios motores14,15. A morte dos neurônios dopaminérgicos impede o fornecimento do neurotransmissor dopamina para o estriado cerebral. Isso, por sua vez, resulta no surgimento de sintomas específicos da DP16. Esses sintomas da DP são bradicinesia, instabilidade postural, rigidez e, principalmente, tremor de repouso12,13. Embora a DP tenha sido descrita pela primeira vez há mais de dois séculos, estudos para entender a patologia e a etiologia da doença ainda estão em andamento e atualmente é aceito que a DP é uma doença sistêmicacomplexa17. Prevê-se que ocorra deficiência de dopamina, e sintomas clínicos de DP são observados quando mais de 80% dos neurônios degeneram18. No tratamento da doença, a suplementação incompleta de dopamina é preferida para reduzir os sintomas motores. Estudos in vivo demonstraram que a infusão direta de dopamina no cérebro reduz significativamente os sintomas em animais19. Precursores de dopamina como a L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) e drogas receptoras de dopamina são usados na clínica porque a infusão direta de dopamina no cérebro não é possível em humanos e a dopamina que entra no sistema não pode atravessar a BHE20. Esses tipos de medicamentos perdem sua eficácia com o tempo. No entanto, ainda não existe uma abordagem terapêutica curativa para a DP. Assim, há uma enorme necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas e modalidades de tratamento para revelar a fisiopatologia da doença e reduzir o impacto da DP nos pacientes.

Estudos baseados em exossomos têm recentemente atraído atenção por reunir informações sobre abordagens terapêuticas e patologias de doenças do sistema nervoso. Exossomos derivados de CTM demonstraram reduzir a inflamação no dano ao nervo e contribuir para a regeneração neuronal21,22,23. Além disso, tem sido relatado que os secretomas do exossomo derivados das CTM reduzem a apoptose por apresentarem efeitos neurotróficos e neuroprotetores, especialmente sobre os neurônios dopaminérgicos24,25. A pesquisa em plataformas nas quais exossomos são usados como sistemas terapêuticos de liberação de fármacos tem acelerado intensamente nos últimos anos. Em numerosos estudos, observou-se que drogas relevantes podem ser facilmente encapsuladas em exossomos e entregues com segurança em células-alvo, tecidos e órgãos26,27. Diferentes métodos como incubação, ciclos de congelamento/descongelamento, sonicação e extrusão podem ser utilizados para o carregamento de fármacos em exossomos28.

A coincubação com exossomos ou vesículas semelhantes a exossomos permite que pequenas moléculas lipofílicas sejam passivamente encapsuladas nesses sistemas de liberação28,29,30. Em particular, várias moléculas como curcumina 31, catalase 30, doxorrubicina32, e paclitaxel33 foram efetivamente carregadas em exossomos. Observou-se que os exossomos contendo catalase, que possuem atividade antioxidante, acumularam-se eficientemente nos neurônios e células da microglia no cérebro e exibiram forte atividade neuroprotetora30. No mesmo estudo, a saponina, adicionada ao complexo para aumentar a eficiência de carga, aumentou a porcentagem de carga do fármaco durante a incubação30,34. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer os padrões para a carga de drogas em exossomos.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema nanocarreador por encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de CTMs-WJ. Todas as etapas, incluindo o cultivo de CTMs-WJ, isolamento e caracterização de exossomos, experimentos de carregamento de drogas, caracterização de exossomos carregados de dopamina com várias técnicas e análise de citotoxicidade in vitro são explicadas em detalhes.

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Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Cultura e criopreservação de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton

  1. Remova os WJ-MSCs (do ATCC) do congelador de -80 °C. Semeando as células em um frasco contendo meio DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Incubá-los a 37 °C numa incubadora contendo 5% de CO2.
  2. Troque o meio de cultura a cada 2 dias. Passar as células quando atingirem 80% de confluência. Lavar as células a serem passadas com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: A lavagem com PBS antes da adição de tripsina garante a fácil separação das células da superfície do frasco.
  3. Retirar o PBS e adicionar 5 ml de solução de tripsina-EDTA ao balão. Incubar o balão durante 5 min a 37 °C numa estufa contendo 5% de CO2.
  4. Recolher o sobrenadante no tubo e centrifugar a 1.500 x g durante 5 min. Após a centrifugação, retirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de DMEM-F12 + 10% FBS ao tubo por pipetagem.
  5. Transferir as células para um frasco maior e continuar a cultura adicionando DMEM-F12 + 10% FBS até obter exossomos suficientes35.
    NOTA: As células cultivadas são congeladas a uma densidade de 1 milhão/mL com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenadas a -80 °C.

2. Produção de exossomos a partir de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton

NOTA: Os exossomos são isolados de cultivadas WJ-MSCs. O isolamento dos exossomos é realizado quando as células cobrem a superfície do frasco e atingem aproximadamente 80% de densidade.

  1. Retirar do balão o meio sobrenadante contendo FBS a 10% e lavar as células com 5 mL de PBS. Adicionar meio DMEM-F12 sem soro às células após enxágue com PBS. Incubar frascos durante 48 h a 37 °C numa incubadora com CO2 a 5%. Após a incubação, recolher o meio sem soro no tubo e armazenar a -20 °C.
    NOTA: Na etapa 2.1, 180 mL de meio sem soro são coletados e armazenados a -20 °C. Após o descongelamento, inicia-se o processo de centrifugação em batelada, conforme descrito abaixo.
  2. Isolamento de exossomos
    1. Centrifugar o meio sem soro recolhido a 300 x g durante 10 minutos a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
    2. Centrifugar o sobrenadante recolhido a 2.000 × g durante 10 min a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
    3. Centrifugar o sobrenadante recolhido a 10.000 × g durante 30 min a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
    4. Transfira o sobrenadante coletado para tubos de ultracentrífuga e ultracentrífuga a 110.000 × g por 130 min. Retire lentamente o sobrenadante e adicione 1 mL de PBS ao pellet.
    5. Vórtice o pellet e a ultracentrífuga a 110.000 × g por 70 min a +4 °C36 (Figura 1). Retire lentamente o sobrenadante e adicione 1 mL de PBS ao pellet.
      NOTA: Após a conclusão das etapas de ultracentrifugação, os exossomos obtidos podem ser armazenados a -80 °C. O pellet obtido já está pronto para caracterização.

figure-protocol-3566
Figura 1: Isolamento do exossomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Caracterização dos exossomos

  1. Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA)
    NOTA: A análise de rastreamento de nanopartículas é realizada para determinar o tamanho e a concentração dos exossomos isolados. Os comprimidos utilizados para 1x solução PBS devem estar na faixa de pH 7,3-7,5. 1x PBS Solution contém 10 mM tampão fosfato, 137 mM cloreto de sódio e 2,7 mM cloreto de potássio. A solução é preparada adicionando 1 comprimido de PBS em 100 mL de água destilada. Esta solução preparada é esterilizada por autoclavagem.
    1. Diluir os exossomos 100 vezes adicionando 990 μL de PBS a 10 μL de exossomos. Leve a suspensão diluída para uma seringa descartável.
    2. Ligue o dispositivo NTA e conecte o computador. Abra o software.
    3. Injete a amostra na seringa na tubulação na seção de do dispositivo. Feche a tampa do do dispositivo.
    4. No software que é aberto, clique no botão Iniciar análise . Salve os resultados obtidos pressionando o botão Gravar .
  2. Análise dinâmica de espalhamento de luz
    NOTA: Os exossomos isolados para medição do potencial zeta e tamanho também são diluídos da mesma maneira que para a análise NTA.
    1. Adicionar 980 μL de PBS a 20 μL dos exossomos.
    2. Abra o dispositivo de dimensionamento zeta e o computador conectado. Abra o software.
    3. Adicione a suspensão do passo 3.2.1 à cubeta descartável. Abra a tampa do dispositivo, coloque a cubeta no e feche a tampa.
    4. Selecione o tipo de cubeta no software do dispositivo. Clique no botão Iniciar análise para análise de potencial zeta e dimensional.
      NOTA: As análises são realizadas separadamente para análise dimensional e potencial zeta.

4. Carga de dopamina em exossomos

NOTA: Após a caracterização dos exossomos WJ-MSCs ser concluída, exossomos carregados de dopamina foram obtidos como um sistema de liberação de fármacos. O carregamento do fármaco em exossomos é realizado pelo método de incubação.

  1. Adicionar 3 ml de PBS à suspensão do exossoma a partir do passo 2.2.5. Esterilizar a suspensão diluída por filtração utilizando filtros de 0,22 μm. Transferir 500 μL da suspensão esterilizada do exossomo para outro tubo.
  2. Preparar solução de dopamina (0,5 mg/mL) com água destilada. Adicionar 500 μL de solução de dopamina nos tubos que contêm os exossomos.
  3. Adicionar saponina à suspensão no passo 4.2. Incubar a suspensão preparada de exossomatório-dopamina durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: A concentração de saponina não deve exceder 0,002% da solução total.
  4. Ultracentrifugar a suspensão a 90.000 × g por 70 min para remover dopamina livre e saponina do meio. Conservar os exossomas isolados a -20 °C até à utilização para análise posterior37.
    NOTA: Adicionar ácido ascórbico a 0,02% para a estabilidade da solução de dopamina preparada.

5. Caracterização de exossomos carregados de dopamina

  1. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    NOTA: A análise de rastreamento de nanopartículas é realizada para determinar o tamanho e a concentração dos exossomos isolados.
    1. Siga os passos 3.1.1-3.1.4 para diluir os exossomos e realizar NTA.
  2. Análise dinâmica de espalhamento de luz
    NOTA: Os exossomos isolados para medição do potencial zeta e do tamanho também são diluídos de forma semelhante à análise NTA.
    1. Siga os passos 3.2.1-3.2.4 para diluir os exossomos e realizar a análise dinâmica de espalhamento de luz.
      NOTA: O tamanho e os potenciais zeta para cada solução (saponina, dopamina, exossomo-dopamina) são analisados separadamente.

6. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

NOTA: As quantidades de dopamina carregadas em exossomos são medidas pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Para detectar a presença de dopamina dentro da formulação obtida, os exossomos são detonados por um processo especial.

  1. Coloque a formulação em um aquecedor de 75 °C para evaporar. Adicione acetonitrila (proporção 50:50) à suspensão e ao vórtice. Sonicate a solução por 10 min.
  2. Centrifugar a solução por 10 min a 10.000 × g. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm.
  3. Analisar todos os analitos usando uma coluna C18 a 30 °C a uma taxa de fluxo de 1 mL/min (fase móvel H2O/acetonitrila). Medir a absorbância a 230 nm38.

7. Mensuração da capacidade de carga (LD) e cinética de liberação in vitro do fármaco

  1. Capacidade de carga de fármacos (CD)
    NOTA: A quantidade de dopamina carregada em exossomos é quantificada usando espectroscopia UV-Vis. A absorbância é lida a 280 nm. Os sobrenadantes coletados durante a síntese são usados para medir a quantidade de droga descarregada. A concentração de dopamina no sobrenadante é determinada através de uma curva de calibração padrão para dopamina.
    1. Preparar uma solução-mãe de 1 mg/ml de dopamina. Preparar concentrações de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL da solução-mãe usando água destilada.
      NOTA: Adicionar ácido ascórbico a 0,02% para a estabilidade da solução de dopamina preparada.
    2. Gere uma curva de calibração padrão medindo a absorbância de cada diluição de dopamina a 280 nm em um espectrofotômetro UV.
    3. Medir a absorbância do sobrenadante a 280 nm.
    4. Calcular a capacidade de carga do fármaco para dopamina utilizando a Eq (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-9786 100 (1)
      OBS: A análise é realizada em triplicata.
  2. Cinética de liberação de fármacos in vitro
    NOTA: A cinética de liberação de drogas de exossomos carregados de dopamina é realizada usando uma membrana de diálise. PBS, pH 7,4, é usado como meio de liberação para simular um microambiente fisiológico.
    1. Adicionar 1 mL de exossomos carregados de dopamina à membrana de diálise. Coloque a membrana em um copo. Adicionar 15 mL de PBS ao copo.
    2. Amostra de 1 mL de meio de liberação em copo às 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 h. Em cada ponto de tempo, substitua o volume da amostra por PBS fresco. Analisar as amostras colhidas a intervalos especificados a 280 nm utilizando um espectrómetro UV-Vis.
    3. Calcule os resultados usando Eq (2)40.
      Lançamento (%) = figure-protocol-10738 100 (2)
      NOTA: Uma curva de calibração é preparada para a determinação da cinética de liberação de fármacos in vitro . A solução de dopamina é preparada nas concentrações de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5,0 mg/mL. O valor de absorbância UV de cada concentração é determinado a 280 nm com um espectrofotômetro UV-Vis.

8. Ensaio de citotoxicidade in vitro

  1. Revitalização e cultura de fibroblastos
    1. Retire os fibroblastos do congelador a -80 °C. Semeando as células em um frasco contendo DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Incubar as células a 37 °C numa estufa contendo 5% de CO2. Troque o meio de cultura a cada 2 dias.
    3. Passar pelas células até atingirem 80% de confluência. Siga as etapas 1.3-1.5. Após centrifugação a 1.500 × g por 5 min, remova o sobrenadante, adicione 1 mL de DMEM-F12 + 10% FBS e semeie 10.000 células por poço em uma placa de 96 poços.
      1. Adicionar meio DMEM-F12 + 10% FBS e incubar as células a 37 °C por 18 h em uma incubadora contendo 5% de CO2. Troque o meio dos poços ao final da incubação.
    4. Prepare o estoque de suspensão de exossomo carregado de dopamina. Diluir a formulação do exossomo dopamina com meio para obter concentrações de 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL.
    5. Adicione as concentrações preparadas nas células dentro de cada poço da placa de 96 poços. Incubar as placas a 37 °C durante 18 h numa estufa contendo 5% de CO241.
  2. Ensaio de viabilidade celular MTT
    NOTA: No final da incubação, as razões de viabilidade das células são determinadas pelo teste MTT.
    1. Preparar a solução de MTT (5 mg/mL) com PBS. Adicionar 10 μL de solução de MTT a cada poço. Incubar durante 4 h a 37 °C.
    2. Ao final da incubação, adicionar 100 μL de DMSO a cada poço. Incubar as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Medir os valores de absorbância no leitor de ELISA a 570 nm42,43.
      NOTA: O teste de viabilidade do MTT é realizado em triplicata.

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Resultados

Isolamento e caracterização de exossomos
As células-tronco da geleia de Wharton são cultivadas e incubadas em meio livre de soro por 48 h quando a cultura atinge densidade suficiente. Após o término da incubação, o sobrenadante é armazenado a -20 °C. Os sobrenadantes coletados são diluídos em PBS e submetidos à ultracentrifugação (Figura 1). A solução obtida é analisada por NTA e DLS. Os exossomos são esterilizados passando por um filtro de 0,22 μm. O...

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Discussão

Exossomos são pequenas vesículas de membrana com dimensões de 40-200 nm secretadas pela maioria dos tipos celulares, por exemplo, CTMs1. Capazes de permitir a comunicação entre as células, os exossomos podem entrar nas células de diferentes maneiras, como endocitose, fagocitose, micropinocitose, internalização mediada por lipídios e fusão33,44. Comparados a outros sistemas nanocarreadores, os lipídios e o colesterol encontrados...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado principalmente por financiamento de pesquisa fornecido por Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm membrane filterAisimoUsed for the sterilization process
0.45 µm syringe filterAisimoUsed for the sterilization process
15 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
50 mL Falcon tubeNestUsed in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasksNestUsed in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)Merck MilliporeUsed in cell culture step
AcetonitrileSigma271004-1LUsed for HPLC analysis
AutoclaveNUVE-OT 90LUsed for the sterilization process
Cell Culture CabinHera Safe KSUsed for the cell culture process
CentrifugalHitachiCF16RNUsed in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UVPanasonicUsed for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10GSigmaH8502-10GUsed in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16AIt was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °CPanasonicMDF-U5386S-PETo store cells and the resulting exosomes
FridgePanasonicMPR-215-PEUsed to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLCAgilent TechnologiesThe presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- PrimovertZeissUsed to observe cells in cell culture.
MTT AssayBiomatikUsed to measure cell viability
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalUsed for exosome characterization
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman CoulterUsed in the exosome isolation step
PBS tabletBiomatik43602In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin SolutionCapricornPB-SIt was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette AidIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMUsed in the preparation of solutions
Q500 SonicatorQsonica, LLCUsed to digest exosomes in HPLC analysis
SaponinSigma47036-50G-FIt was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-SpectrophotometryBMG LABTECHUsed for MTT and drug release analyzes
SPSS 22statistical package program
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexUsed to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-SenovaSenovaUsed in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cellsATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSUsed for exosome characterization

Referências

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