Protocolo para el desarrollo de un modelo de osteotomía de fémur en ratas albinas Wistar

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para fracturar iatrogénicamente el eje del fémur de ratas albinas Wistar y hacer un seguimiento del desarrollo del callo. Este modelo de osteotomía de fémur puede ayudar a los investigadores a evaluar el proceso de curación de fracturas y a estudiar cómo un medicamento podría influir en la curación de fracturas.

Resumen

La curación de fracturas es un proceso fisiológico que resulta en la regeneración de defectos óseos por la acción coordinada de osteoblastos y osteoclastos. Los fármacos osteoanabólicos tienen el potencial de aumentar la reparación de fracturas, pero tienen limitaciones como altos costos o efectos secundarios indeseables. El potencial de curación ósea de un fármaco puede determinarse inicialmente mediante estudios in vitro , pero se necesitan estudios in vivo para la prueba final de concepto. Nuestro objetivo era desarrollar un modelo de roedor con osteotomía de fémur que pudiera ayudar a los investigadores a comprender el desarrollo de la formación de callos después de la fractura del eje del fémur y que pudiera ayudar a establecer si un fármaco potencial tiene propiedades curativas óseas. Se utilizaron ratas albinas Wistar macho adultas después de la autorización del Comité Institucional de Ética Animal. Los roedores fueron anestesiados y, en condiciones asépticas, se crearon fracturas transversales completas en el tercio medio de los ejes de los fémures mediante osteotomía abierta. Las fracturas se redujeron y se fijaron internamente utilizando cables K intramedulares, y se permitió la curación secundaria de la fractura. Después de la cirugía, se administraron analgésicos intraperitoneales y antibióticos durante 5 días. Las radiografías semanales secuenciales evaluaron la formación de callos. Las ratas fueron sacrificadas en base a puntos de tiempo predeterminados radiológicamente, y el desarrollo del callo de fractura se analizó radiológicamente y utilizando inmunohistoquímica.

Introducción

El hueso es un tejido conectivo denso que consiste en células formadoras de hueso, los osteoblastos y las células de reabsorción ósea, los osteoclastos. La curación de fracturas es un proceso fisiológico que resulta en la regeneración de defectos óseos por la acción coordinada de osteoblastos y osteoclastos¹. Cuando hay una fractura, la actividad osteoblástica y osteoclástica en el sitio de la fractura son algunos de los factores importantes que determinan la cicatrización ósea². Cuando la curación de la fractura se desvía de su curso normal, resulta en una unión retrasada, mala unión o falta de unión. Se dice que una fractura está en falta de unión cuando hay una falla de unión de la fractura durante 9 meses, sin progresión de reparación en los últimos 3 meses³. Aproximadamente el 10% -15% de todas las fracturas experimentan un retraso en la reparación que puede progresar a falta de unión⁴. La tasa de no unión para todas las fracturas es del 5% al 10% y varía según el hueso involucrado y el sitio de la fractura⁵.

El régimen actual para el tratamiento de la falta de unión de fracturas comprende modalidades quirúrgicas y/o médicas. Actualmente, el retraso o la no unión de las fracturas pueden superarse mediante estrategias quirúrgicas como el injerto óseo. Sin embargo, el injerto óseo tiene sus limitaciones y complicaciones como la disponibilidad de tejido del injerto, el dolor en el sitio donante, la morbilidad y la infección⁶. El tratamiento médico comprende fármacos osteoanabólicos como la proteína morfogenética ósea (BMP) y la teriparatida (análogo de la parathormona). Los agentes osteoanabólicos utilizados actualmente tienen el potencial de aumentar la reparación de fracturas, pero tienen limitaciones como costos exorbitantes o efectos secundarios indeseables⁷. Por lo tanto, hay margen para identificar alternativas rentables y no quirúrgicas para la curación ósea. El potencial de curación ósea de un fármaco puede determinarse inicialmente mediante estudios in vitro , pero se necesitan estudios in vivo para la prueba final de concepto. Un fármaco que se sabe que mejora la curación ósea debe evaluarse in vitro y, si se encuentra prometedor, puede usarse para estudios de modelos animales in vivo . Si el fármaco demuestra promover la formación y remodelación ósea en el modelo in vivo , podría pasar a la siguiente etapa (es decir, ensayos clínicos).

Evaluar la curación de fracturas en animales es un paso lógico para evaluar un nuevo agente introducido para la curación ósea antes de que se someta a ensayos en humanos. Para los estudios in vivo con modelos animales de curación de fracturas, los roedores se han convertido en un modelo cada vez más popular⁸. Los modelos de roedores han generado un creciente interés debido a los bajos costos operativos, la necesidad limitada de espacio y el menor tiempo necesario para la curación ósea⁹. Además, los roedores tienen un amplio espectro de anticuerpos y dianas genéticas, que permiten estudios sobre los mecanismos moleculares de curación y regeneración ósea¹⁰. Una reunión de consenso destacó exhaustivamente varios modelos de curación ósea de animales pequeños y se centró en los diferentes parámetros que influyen en la cicatrización ósea, así como en varios modelos e implantes de fracturas de animales pequeños¹¹.

Los modelos básicos de fractura se pueden dividir ampliamente en modelos abiertos o cerrados. Los modelos de fractura cerrada utilizan una fuerza de flexión de tres o cuatro puntos en el hueso y no requieren un enfoque quirúrgico convencional. Conducen a fracturas oblicuas o espirales, parecidas a las fracturas de huesos largos en humanos, pero la falta de estandarización de la ubicación y las dimensiones de la fractura puede actuar como un factor de confusión en ellas¹². Los modelos de fractura abierta requieren acceso quirúrgico para la osteotomía del hueso, ayudan a lograr un patrón de fractura más consistente en el sitio de la fractura, pero se asocian con retraso en la cicatrización en comparación con los modelos cerrados¹³. La elección del hueso utilizado para estudiar la curación de fracturas sigue siendo principalmente la tibia y el fémur debido a sus dimensiones y accesibilidad. La elección del sitio de fractura suele ser la diáfisis o metáfisis. La región metafisaria es especialmente elegida en los casos en que la curación de fracturas es estudiada en sujetos osteoporóticos, ya que la metáfisis está más afectada por la osteoporosis¹⁴. Se pueden utilizar varios implantes como clavos intramedulares y fijadores externos para estabilizar la fractura^11,15.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo de roedor simple y fácil de seguir que podría ayudar a los investigadores no solo a comprender el desarrollo del callo después de la fractura del fémur, sino que también podría ayudar a determinar si un medicamento potencial tiene propiedades de curación ósea al comprender el mecanismo por el cual actúa.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron después de obtener la aprobación ética del Comité Institucional de Ética Animal (AIEC), AIIMS, Nueva Delhi, India (286 / IAEC-1 / 2021).

1. Procedimiento preoperatorio

1. Ratas albinas Wistar macho doméstico de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de entre 150 y 200 g cada una, en una Instalación Central de Animales (CAF) en jaulas individuales separadas. Esto asegura que no haya lesiones quirúrgicas / fracturas cuando varias ratas comparten jaulas.
2. Mantener a las ratas a una temperatura de 23 °C ± 2 °C en un ambiente con humedad controlada con una humedad relativa del 50% ± 5%, exponerlas a un ciclo oscuro/claro de 12 h y dar acceso ad libitum a los alimentos (dieta semisintética estándar): dieta de pellets (seca) y agua. La composición de la dieta semisintética estándar es la siguiente: harina de gramo de bengala tostada (60%), harina de trigo (22%), caseína (4%), leche descremada en polvo (5%), aceite refinado (4%), mezcla de sal con almidón (4,8%) y mezcla de vitamina colina con almidón (0,2%).
3. Aclimatar a las ratas durante un período de al menos 48 h antes de la cirugía.
4. Pese cada rata en una báscula de pesaje digital y anote el peso.
5. Administrar inyecciones intraperitoneales (IP) de cefuroxima (100 mg/kg de peso corporal), tramadol (25 mg/kg de peso corporal) y una combinación de ketamina (75 mg/kg de peso corporal) con xilazina (10 mg/kg de peso corporal) a las ratas 15 min antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir el ojo seco.
6. Retire el vello de la extremidad inferior derecha, desde la región del flanco hasta la articulación de la rodilla, con la aplicación tópica de una crema depilatoria.
   NOTA: Se puede recolectar sangre (0,5 ml) de la vena de la cola de cada rata para el análisis basal de diferentes parámetros. La sangre se puede recolectar nuevamente cada 2 semanas después de la cirugía.

2. Procedimiento quirúrgico para crear fractura transversa completa mediante osteotomía abierta

NOTA: Utilice una sala de operaciones designada con una mesa de operaciones y una temperatura ambiente óptima (26 °C) para realizar el procedimiento.

1. Coloque el bloque de cera (bandeja de aluminio de 30 cm x 30 cm x 4 cm que contiene cera hasta una profundidad de 2,5 cm) en la mesa de operaciones y cúbrala con cortinas estériles. El bloque de cera evita cualquier cambio en la posición del animal durante la cirugía.
2. Confirme el inicio de la anestesia (comprobando la pérdida del pellizco del dedo del pie). Coloque la rata anestesiada en una cortina estéril en la posición lateral izquierda. Pídale a un asistente que sostenga la extremidad inferior derecha (rodilla y cadera) en extensión. Mantenga un soporte duro estéril (bloqueo de mármol) debajo de la pierna derecha para apoyar el fémur. Limpie el sitio quirúrgico con alcohol y betadina.
3. Inyecte anestesia local (0.25 ml de lignocaína al 1%) en el sitio de la incisión (aspecto lateral del muslo derecho), corte un agujero en otra cortina estéril y exponga solo la pierna derecha de la rata a través de ella para la cirugía.
4. Dé una incisión vertical de 1 cm en la piel en el lado lateral del muslo derecho y extiéndala según sea necesario con una cuchilla quirúrgica no. 15.
5. Exponga el músculo vasto lateral separando la fascia profunda con tijeras Metzenbaum. Divida el vasto lateral en línea con las fibras musculares usando pinzas arteriales hasta que se alcance el eje del fémur.
6. Libere el hueso de los músculos unidos a él usando el elevador perióstico.
7. Inyecte anestesia local (0,2 ml de lignocaína al 1%) en y alrededor del periostio para prevenir el reflejo vasovagal.
8. Cree una hendidura en el tercio medio del eje del fémur usando la cuchilla quirúrgica no.15, y fracture el hueso en el tercio medio del eje (fractura completa) colocando un cincel en la hendidura hecha (para que el cincel no se deslice) y golpeando suavemente el cincel con un martillo. Use el soporte duro estéril (bloque de mármol) para sostener el hueso mientras lo fractura para asegurar una rotura limpia.
   NOTA: El soporte duro estéril generalmente no causa una lesión significativa en los músculos debajo.
9. Fije internamente la fractura con un cable K estéril (1,0 mm) sostenido con la ayuda de un taladro eléctrico que funciona con baterías. Pase el cable K en el canal medular del fragmento distal a través del sitio de la fractura. Luego, perfore el cable K a través del extremo distal del fémur con el taladro eléctrico que funciona con baterías.
   NOTA: Desinfecte la superficie del taladro eléctrico con alcohol antes de usarlo. Cambie los guantes después de fijar el cable K.
10. Después de reducir la fractura, avance el cable K desde el extremo distal hacia el canal del fragmento proximal hasta que obtenga la compra en la región trocantérea. Corte la parte distal del alambre K que sobresale a través de la piel con un cortador de alambre.
11. Doble la punta del cable K a alrededor de 90 ° con alicates y use un vendaje de gasa empapado en betadina para el apósito del pin. El cable K actúa como una férula intramedular para mantener la fractura en una posición reducida.
12. Asegurar la hemostasia completa antes de cerrar la piel con una sutura de nylon 3-0. Aplique presión sobre el área de sangrado con gasa estéril o fórceps arteriales para detener cualquier sangrado.
13. Limpie la herida con betadina y cúbrala con gasa estéril y cinta adhesiva de microporos.

3. Cuidados postoperatorios

1. Devolver a las ratas a sus jaulas, permitir la deambulación normal y continuar dando una dieta semisintética estándar hasta sacrificarlas, así como antibióticos (inyección de cefuroxima 100 mg / kg) y analgésicos (inyección de tramadol 25 mg / kg / día en dos dosis divididas) por vía intraperitoneal durante 5 días después del procedimiento.
   NOTA: Las ratas se pueden dividir en grupos de tratamiento y control para probar un medicamento en particular. Si el medicamento es soluble en agua, se puede administrar por vía oral a través de sonda nasogástrica. El peso de los animales individuales se puede anotar para calcular la dosis del medicamento que se utilizará. Se pueden seguir criterios de inclusión y exclusión para garantizar la homogeneidad de los grupos de animales.
2. Alojar a los animales en jaulas individuales en condiciones similares al período preoperatorio. Inspeccione el sitio quirúrgico todos los días para buscar cualquier signo de dolor postoperatorio, infección de la herida, deslizamiento de las suturas o cualquier hinchazón o molestia abdominal.
3. Evaluar la curación ósea mediante radiografía del sitio fracturado una vez a la semana.

4. Procedimiento radiológico

1. Antes de la radiografía, anestesiar a las ratas con una inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg de peso corporal) y xilazina (5 mg/kg de peso corporal).
2. Mantenga la articulación de la cadera de la rata en una posición flexionada y abducida mientras la articulación de la rodilla se mantiene semiflexionada para tomar la radiografía de la extremidad fracturada con los siguientes ajustes de exposición: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6,4; y ajustes de exposición automáticos (Ref. mA=160).
   NOTA: Las radiografías se tomaron al inicio del estudio (1 día después de la cirugía) y luego una vez a la semana hasta el sacrificio o 5 semanas.

5. Eutanasia animal y recuperación de callos

1. Sacrificar las ratas por una sobredosis de dióxido de carbono (administrar 100% de_CO2 a un caudal de 7-8 L/min durante 1 min, seguido de un período de espera de 4-5 min), en dos puntos de tiempo previamente determinados, basados en la apariencia radiológica de callos puente blandos y duros, respectivamente.
2. Incide la piel paralela al fémur y separa los músculos suprayacentes con cuidado para evitar daños en el tejido del callo.
3. Fracturar el hueso entre la articulación de la cadera y el tejido del callo con un martillo y un cincel. Del mismo modo, fracturar el hueso entre el callo y la articulación de la rodilla. Retire el cable K y limpie la pieza ósea con solución salina para eliminar los coágulos de sangre y los tejidos blandos.
4. Transfiera el callo inmediatamente a un recipiente etiquetado con formalina tamponada neutra al 10% (20 ml por muestra) y manténgalo durante 3 días a temperatura ambiente (RT).

6. Descalcificación del hueso y el tejido del callo

1. Tome el tejido del callo de formalina y manténgalo en RT en solución ETDA al 20%, pH 7, para la descalcificación del tejido óseo.
2. Cambie la solución fresca de EDTA cada 2 días durante aproximadamente 3 semanas y verifique la descalcificación ósea pinchando el hueso con una aguja sin alterar el tejido del callo. La descalcificación óptima se denota por la pérdida de la sensación arenosa normal del tejido óseo.
3. Después de la descalcificación completa, corte la sección sagital del callo y prepare bloques de parafina del tejido del callo. Cortar secciones de 4 μm de espesor del tejido del callo para histopatológico¹⁶ y cualquier otro análisis comparativo¹⁷.

Resultados

Este estudio se llevó a cabo para desarrollar un modelo de osteotomía de fémur en ratas albinas Wistar. Este modelo se puede utilizar para evaluar la curación ósea, así como el efecto osteogénico de un fármaco osteoanabólico prometedor en la curación ósea. Se siguieron las precauciones y protocolos quirúrgicos estándar. Para el procedimiento se utilizaron batas estériles, cortinas y equipo quirúrgico (Figura 1). El equipo (Tabla 1) fue esterilizado 48 h antes ...

Discusión

Este método describe lúcidamente los detalles necesarios para desarrollar un modelo de osteotomía de fractura en ratas albinas Wistar. Este modelo se puede utilizar para evaluar el efecto osteogénico de un fármaco osteoanabólico prometedor en la curación de fracturas, así como para comprender las complejidades de la curación ósea. La característica más destacada de este método es que es simple y no necesita demasiado tiempo o equipo sofisticado. En este método, se seleccionaron ratas albinas Wistar macho ad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2