Protocole pour le développement d’un modèle d’ostéotomie fémure chez le rat albinos Wistar

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour fracturer iatrogène la tige du fémur des rats albinos Wistar et suivre le développement du callus. Ce modèle d’ostéotomie du fémur peut aider les chercheurs à évaluer le processus de guérison des fractures et à étudier comment un médicament pourrait influencer la guérison des fractures.

Résumé

La cicatrisation des fractures est un processus physiologique entraînant la régénération des défauts osseux par l’action coordonnée des ostéoblastes et des ostéoclastes. Les médicaments ostéoanabolisants ont le potentiel d’augmenter la réparation des fractures, mais ont des contraintes telles que des coûts élevés ou des effets secondaires indésirables. Le potentiel de guérison osseuse d’un médicament peut initialement être déterminé par des études in vitro , mais des études in vivo sont nécessaires pour la preuve de concept finale. Notre objectif était de développer un modèle d’ostéotomie du fémur chez les rongeurs qui pourrait aider les chercheurs à comprendre le développement de la formation de cals à la suite d’une fracture de la tige du fémur et qui pourrait aider à établir si un médicament potentiel a des propriétés de guérison osseuse. Des rats adultes Wistar albinos mâles ont été utilisés après l’autorisation du Comité d’éthique animale de l’établissement. Les rongeurs ont été anesthésiés et, dans des conditions aseptiques, des fractures transversales complètes au milieu du tiers des tiges des fémurs ont été créées par ostéotomie ouverte. Les fractures ont été réduites et fixées à l’intérieur à l’aide de fils K intramédullaires, et la cicatrisation secondaire des fractures a été autorisée. Après la chirurgie, des analgésiques intrapéritonéaux et des antibiotiques ont été administrés pendant 5 jours. Des radiographies hebdomadaires séquentielles ont évalué la formation de callosités. Les rats ont été sacrifiés en fonction de points temporels radiologiquement prédéterminés, et le développement du cal de fracture a été analysé radiologiquement et en utilisant l’immunohistochimie.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif dense composé de cellules formant des os, les ostéoblastes, et de cellules résorbant les os, les ostéoclastes. La cicatrisation des fractures est un processus physiologique aboutissant à la régénération des défauts osseux par l’action coordonnée des ostéoblastes et des ostéoclastes¹. Lorsqu’il y a une fracture, l’activité ostéoblastique et ostéoclastique au site de la fracture sont quelques-uns des facteurs importants qui déterminent la guérison osseuse². Lorsque la guérison des fractures s’écarte de son cours normal, il en résulte une union retardée, une malunion ou une non-union. Une fracture est dite non consolidée lorsqu’il y a une rupture de consolidation de la fracture pendant 9 mois, sans progression de réparation au cours des 3 derniers mois³. Environ 10 % à 15 % de toutes les fractures subissent un retard de réparation qui peut évoluer vers la non-union⁴. Le taux de non-union pour toutes les fractures est de 5% à 10% et varie en fonction de l’os impliqué et du site de fracture⁵.

Le schéma thérapeutique actuel pour le traitement de la non-union des fractures comprend des modalités chirurgicales et/ou médicales. Actuellement, les fractures retardées ou non liées peuvent être surmontées par des stratégies chirurgicales telles que la greffe osseuse. Cependant, la greffe osseuse a ses limites et ses complications comme la disponibilité du tissu du greffon, la douleur au site donneur, la morbidité et l’infection⁶. Le traitement médical comprend des médicaments ostéoanabolisants comme la protéine morphogénétique osseuse (BMP) et le tériparatide (analogue de la parathormone). Les agents ostéoanabolisants actuellement utilisés ont le potentiel d’augmenter la réparation des fractures, mais ont des contraintes telles que des coûts exorbitants ou des effets secondaires indésirables⁷. Par conséquent, il est possible d’identifier des alternatives rentables et non chirurgicales pour la guérison osseuse. Le potentiel de guérison osseuse d’un médicament peut initialement être déterminé par des études in vitro , mais des études in vivo sont nécessaires pour la preuve de concept finale. Un médicament connu pour améliorer la guérison osseuse doit être évalué in vitro et, s’il s’avère prometteur, peut être utilisé pour des études in vivo sur des modèles animaux. Si le médicament s’avère favoriser la formation et le remodelage osseux dans le modèle in vivo , il pourrait passer à l’étape suivante (c.-à-d. essais cliniques).

L’évaluation de la guérison des fractures chez les animaux est une étape logique pour évaluer un nouvel agent introduit pour la guérison osseuse avant qu’il ne subisse des essais sur l’homme. Pour les études in vivo sur modèle animal de la guérison des fractures, les rongeurs sont devenus un modèle⁸ de plus en plus populaire. Les modèles de rongeurs ont suscité un intérêt croissant en raison des faibles coûts opérationnels, du besoin limité d’espace et de moins de temps nécessaire à la guérison osseuse⁹. De plus, les rongeurs disposent d’un large spectre d’anticorps et de cibles génétiques, ce qui permet d’étudier les mécanismes moléculaires de la cicatrisation et de la régénération^{osseuses 10}. Une réunion de consensus a mis en évidence de manière exhaustive divers modèles de guérison osseuse de petits animaux et s’est concentrée sur les différents paramètres influençant la guérison osseuse, ainsi que sur plusieurs modèles de fractures et d’implants de petits animaux¹¹.

Les modèles de fracture de base peuvent être largement divisés en modèles ouverts ou fermés. Les modèles de fracture fermée utilisent une force de flexion à trois ou quatre points sur l’os et ne nécessitent pas d’approche chirurgicale conventionnelle. Ils conduisent à des fractures obliques ou en spirale, ressemblant à des fractures des os longs chez l’homme, mais le manque de normalisation de l’emplacement et des dimensions des fractures peut agir comme un facteur de confusion en eux¹². Les modèles de fracture ouverte nécessitent un accès chirurgical pour l’ostéotomie de l’os, aident à obtenir un schéma de fracture plus cohérent au site de la fracture, mais sont associés à une cicatrisation retardée par rapport aux modèles fermés¹³. Le choix de l’os utilisé pour étudier la cicatrisation des fractures reste principalement le tibia et le fémur en raison de leurs dimensions et de leur accessibilité. Le choix du site de fracture est généralement la diaphyse ou la métaphyse. La région métaphysaire est spécialement choisie dans les cas où la cicatrisation des fractures est étudiée chez les sujets ostéoporotiques, car la métaphyse est plus affectée par l’ostéoporose¹⁴. Plusieurs implants comme les broches intramédullaires et les fixateurs externes peuvent être utilisés pour stabiliser la fracture^11,15.

L’objectif de cette étude était de développer un modèle de rongeur simple et facile à suivre qui pourrait aider les chercheurs non seulement à comprendre le développement du cal après une fracture du fémur, mais pourrait aider à déterminer si un médicament potentiel a des propriétés de guérison osseuse en comprenant le mécanisme par lequel il agit.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été réalisées après avoir obtenu l’approbation éthique du Comité institutionnel d’éthique animale (IAEC), AIIMS, New Delhi, Inde (286/IAF-1/2021).

1. Procédure préopératoire

1. Hébergez des rats albinos Wistar mâles âgés de 6 à 8 semaines, pesant entre 150 et 200 g chacun, dans une animalerie centrale (CAF) dans des cages individuelles séparées. Cela garantit qu’il n’y a pas de blessure chirurgicale ou au site de fracture lorsque plusieurs rats partagent des cages.
2. Maintenir les rats à une température de 23 °C ± 2 °C dans un environnement à humidité contrôlée avec une humidité relative de 50% ± 5%, les exposer à un cycle obscurité/lumière de 12 h et leur donner un accès ad libitum à la nourriture (régime semi-synthétique standard): régime granulé (sec) et eau. La composition du régime semi-synthétique standard est la suivante: farine de gramme de Bengale grillée (60%), farine de blé (22%), caséine (4%), poudre de lait écrémé (5%), huile raffinée (4%), mélange de sel avec de l’amidon (4,8%) et mélange de vitamines choline avec de l’amidon (0,2%).
3. Acclimater les rats pendant une période d’au moins 48 heures avant la chirurgie.
4. Pesez chaque rat sur une balance numérique et notez le poids.
5. Administrer des injections intrapéritonéales (IP) de céfuroxime (100 mg/kg de poids corporel), de tramadol (25 mg/kg de poids corporel) et une combinaison de kétamine (75 mg/kg de poids corporel) avec de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) aux rats 15 minutes avant de commencer l’intervention chirurgicale. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse oculaire.
6. Enlevez les poils du membre inférieur droit, de la région du flanc jusqu’à l’articulation du genou, avec l’application topique d’une crème dépilatoire.
   REMARQUE : Le sang (0,5 mL) peut être prélevé dans la veine de la queue de chaque rat pour l’analyse de base de différents paramètres. Le sang peut être prélevé à nouveau toutes les 2 semaines après la chirurgie.

2. Procédure chirurgicale pour créer une fracture transversale complète par ostéotomie ouverte

REMARQUE : Utilisez une salle d’opération désignée avec une table d’opération et une température ambiante optimale (26 °C) pour effectuer la procédure.

1. Placez le bloc de cire (plateau en aluminium de 30 cm x 30 cm x 4 cm contenant de la cire jusqu’à une profondeur de 2,5 cm) sur la table d’opération et recouvrez-le de champs stériles. Le bloc de cire empêche tout changement de position de l’animal pendant la chirurgie.
2. Confirmer le début de l’anesthésie (en vérifiant la perte de pincement de l’orteil). Placez le rat anesthésié sur un champ stérile en position latérale gauche. Demandez à un assistant de tenir le membre inférieur droit (genou et hanche) en extension. Gardez un support dur stérile (bloc de marbre) sous la jambe droite pour soutenir le fémur. Nettoyez le site chirurgical avec de l’alcool et de la bétadine.
3. Injectez une anesthésie locale (0,25 mL de lignocaïne à 1 %) au site d’incision (aspect latéral de la cuisse droite), percez un trou dans un autre champ stérile et n’exposez que la jambe droite du rat à travers elle pour la chirurgie.
4. Donnez une incision cutanée verticale de 1 cm sur le côté latéral de la cuisse droite et étendez-la selon les besoins avec une lame chirurgicale n ° 15.
5. Exposez le muscle vastus lateralis en séparant le fascia profond à l’aide de ciseaux Metzenbaum. Diviser le vastus latéral en ligne avec les fibres musculaires à l’aide d’une pince artérielle jusqu’à ce que la tige du fémur soit atteinte.
6. Libérez l’os des muscles qui y sont attachés à l’aide de l’ascenseur périosté.
7. Injecter une anesthésie locale (0,2 mL de 1 % de lignocaïne) dans et autour du périoste pour prévenir le réflexe vasovagal.
8. Créez une indentation dans le tiers moyen de la tige du fémur à l’aide de la lame chirurgicale n°15 et fracturez l’os dans le tiers médian de la tige (fracture complète) en plaçant un burin sur l’échancrure faite (pour que le burin ne glisse pas) et en tapotant doucement le ciseau avec un marteau. Utilisez le support dur stérile (bloc de marbre) pour soutenir l’os tout en le fracturant pour assurer une rupture propre.
   REMARQUE: Le support dur stérile ne cause généralement pas de blessure importante aux muscles en dessous.
9. Réparez la fracture à l’intérieur à l’aide d’un fil K stérile (1,0 mm) maintenu à l’aide d’une perceuse électrique à piles. Passez le fil K dans le canal médullaire du fragment distal à travers le site de fracture. Ensuite, percez le fil K à travers l’extrémité distale du fémur à l’aide de la perceuse électrique à piles.
   REMARQUE: Désinfectez la surface de la perceuse électrique avec de l’alcool avant utilisation. Changez de gants une fois le fil K fixé.
10. Après avoir réduit la fracture, avancer le fil K de l’extrémité distale dans le canal du fragment proximal jusqu’à ce qu’il obtienne l’achat dans la région trochantérienne. Coupez la partie distale du fil K qui dépasse de la peau à l’aide d’un coupe-fil.
11. Pliez la pointe du fil K à environ 90° à l’aide d’une pince et utilisez un bandage de gaze imbibé de bétadine pour le pansement au site d’épingle. Le fil K agit comme une attelle intramédullaire pour maintenir la fracture dans une position réduite.
12. Assurez-vous d’une hémostase complète avant de fermer la peau à l’aide d’une suture en nylon 3-0. Appliquez une pression sur la zone de saignement à l’aide d’une gaze stérile ou d’une pince artérielle pour arrêter tout saignement.
13. Nettoyez la plaie avec de la bétadine et recouvrez-la de gaze stérile et de ruban adhésif micropore.

3. Soins postopératoires

1. Remettez les rats dans leurs cages, permettez une marche normale et continuez à leur donner un régime semi-synthétique standard jusqu’à ce qu’ils soient sacrifiés, ainsi que des antibiotiques (céfuroxime injectable 100 mg / kg) et des analgésiques (injection de tramadol 25 mg / kg / jour en deux doses fractionnées) par voie intrapéritonéale pendant 5 jours après la procédure.
   REMARQUE: Les rats peuvent être divisés en groupes de traitement et de contrôle pour tester un médicament particulier. Si le médicament est soluble dans l’eau, il peut être administré par voie orale par gavage. Le poids de chaque animal peut être noté pour calculer la dose du médicament à utiliser. Des critères d’inclusion et d’exclusion peuvent être suivis pour assurer l’homogénéité des groupes d’animaux.
2. Hébergez les animaux dans des cages individuelles dans des conditions similaires à celles de la période préopératoire. Inspectez le site chirurgical tous les jours pour rechercher tout signe de douleur postopératoire, d’infection de la plaie, de glissement des sutures ou de gonflement ou d’inconfort abdominal.
3. Évaluer la guérison osseuse par radiographie du site fracturé une fois par semaine.

4. Procédure radiologique

1. Avant la radiographie, anesthésier les rats avec une injection intrapéritonéale de kétamine (50 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (5 mg / kg de poids corporel).
2. Maintenir l’articulation de la hanche du rat dans une position fléchie et enlevée tandis que l’articulation du genou est maintenue semi-fléchie pour prendre la radiographie du membre fracturé avec les réglages d’exposition suivants: Réf. kVp ≈ 62; Réf. mAS = 6,4; et les réglages d’exposition automatiques (réf. mA=160).
   REMARQUE: Les radiographies ont été prises au départ (1 jour après la chirurgie), puis une fois par semaine jusqu’au sacrifice ou 5 semaines.

5. Euthanasie animale et prélèvement de callosités

1. Sacrifier les rats par une surdose de dioxyde de carbone (administrer 100% de CO₂ à un débit de 7-8 L / min pendant 1 min, suivi d’une période d’attente de 4-5 min), à deux points temporels préalablement déterminés, en fonction de l’aspect radiologique des callosités molles et dures, respectivement.
2. Inciser la peau parallèlement au fémur et séparer soigneusement les muscles sus-jacents pour éviter d’endommager le tissu calleux.
3. Fracturez l’os entre l’articulation de la hanche et le tissu calleux à l’aide d’un marteau et d’un burin. De même, fracturer l’os entre le cal et l’articulation du genou. Retirez le fil K et nettoyez la pièce osseuse dans une solution saline pour éliminer les caillots sanguins et les tissus mous.
4. Transférer immédiatement les callosités dans un contenant étiqueté contenant du formol tamponné neutre à 10 % (20 ml par échantillon) et le conserver pendant 3 jours à température ambiante (RT).

6. Décalcification des os et des cals

1. Prenez le tissu de cals du formol et conservez-le à TA dans une solution ETDA à 20%, pH 7, pour la décalcification du tissu osseux.
2. Changez la solution fraîche d’EDTA tous les 2 jours pendant environ 3 semaines et vérifiez la décalcification osseuse en piquant l’os avec une aiguille sans perturber le tissu calleux. Une décalcification optimale est indiquée par la perte de la sensation granuleuse normale du tissu osseux.
3. Après décalcification complète, coupez la section sagittale du cal et préparez des blocs de paraffine du tissu calleux. Couper des sections de 4 μm d’épaisseur du tissu cal pour l’histopathologie¹⁶ et toute autre analyse comparative¹⁷.

Résultats

Cette étude a été entreprise pour développer un modèle d’ostéotomie du fémur chez des rats albinos Wistar. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer la guérison osseuse, ainsi que l’effet ostéogénique d’un médicament ostéoanabolisant prometteur dans la guérison osseuse. Les précautions et protocoles chirurgicaux standard ont été suivis. Des blouses stériles, des champs et du matériel chirurgical ont été utilisés pour l’intervention (figure 1). L’équipement ...

Discussion

Cette méthode décrit avec lucidité les détails nécessaires pour développer un modèle d’ostéotomie de fracture chez les rats albinos Wistar. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’effet ostéogénique d’un médicament ostéoanabolisant prometteur dans la guérison des fractures, ainsi que pour comprendre les subtilités de la guérison osseuse. La caractéristique principale de cette méthode est qu’elle est simple et ne nécessite pas trop de temps ou d’équipement sophistiqué. Dans cette méth...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2