Protocolo para o Desenvolvimento de um Modelo de Osteotomia do Fêmur em Ratos Albinos Wistar

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para fraturar iatrogenicamente a diáfise do fêmur de ratos albinos Wistar e acompanhar o desenvolvimento do calo. Este modelo de osteotomia do fêmur pode ajudar os pesquisadores a avaliar o processo de cicatrização da fratura e estudar como uma droga pode influenciar a cicatrização da fratura.

Resumo

A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos. As drogas osteoanabólicas têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas têm restrições como altos custos ou efeitos colaterais indesejáveis. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Nosso objetivo era desenvolver um modelo de roedor de osteotomia do fêmur que pudesse ajudar os pesquisadores a entender o desenvolvimento da formação de calos após a fratura da diáfise do fêmur e que pudesse ajudar a estabelecer se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas. Ratos albinos Wistar machos adultos foram utilizados após liberação do Comitê de Ética Animal Institucional. Os roedores foram anestesiados e, em condições assépticas, fraturas transversais completas no terço médio das hastes dos fêmures foram criadas por osteotomia aberta. As fraturas foram reduzidas e fixadas internamente usando fios K intramedulares, e a cicatrização secundária da fratura foi permitida. Após a cirurgia, analgésicos intraperitoneais e antibióticos foram administrados por 5 dias. Raios-x semanais sequenciais avaliaram a formação de calos. Os ratos foram sacrificados com base em pontos de tempo radiologicamente pré-determinados, e o desenvolvimento do calo de fratura foi analisado radiologicamente e usando imuno-histoquímica.

Introdução

O osso é um tecido conjuntivo denso que consiste em células formadoras de osso, os osteoblastos, e células de reabsorção óssea, os osteoclastos. A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos¹. Quando há fratura, a atividade osteoblástica e osteoclástica no local da fratura são alguns dos fatores importantes que determinam a cicatrização óssea². Quando a cicatrização da fratura se desvia de seu curso normal, resulta em uma união atrasada, desunião ou não união. Diz-se que uma fratura está em não união quando há uma falha de união da fratura por 9 meses, sem progressão do reparo nos últimos 3 meses³. Aproximadamente 10%-15% de todas as fraturas experimentam um atraso no reparo que pode progredir para a não união⁴. A taxa de não consolidação para todas as fraturas é de 5%-10% e varia dependendo do osso envolvido e do local da fratura⁵.

O regime atual para o tratamento da não consolidação da fratura compreende modalidades cirúrgicas e/ou médicas. Atualmente, a tardia ou não união de fraturas pode ser superada por estratégias cirúrgicas como o enxerto ósseo. No entanto, o enxerto ósseo tem suas limitações e complicações como disponibilidade de tecido do enxerto, dor no local doador, morbidade e infecção⁶. O tratamento médico compreende drogas osteoanabólicas como proteína morfogenética óssea (BMP) e teriparatida (análogo do paratormônio). Os agentes osteoanabólicos atualmente utilizados têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas apresentam restrições como custos exorbitantes ou efeitos colaterais indesejáveis⁷. Assim, há espaço para identificar alternativas custo-efetivas e não cirúrgicas para a cicatrização óssea. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Uma droga que é conhecida por melhorar a cicatrização óssea deve ser avaliada in vitro e, se considerada promissora, pode ser usada para estudos in vivo em modelos animais. Se a droga provar promover a formação óssea e a remodelação no modelo in vivo , ela poderá prosseguir para o próximo estágio (ou seja, ensaios clínicos).

Avaliar a cicatrização de fraturas em animais é um passo lógico para avaliar um novo agente introduzido para a cicatrização óssea antes de passar por testes em humanos. Para estudos in vivo de modelos animais de cicatrização de fraturas, os roedores tornaram-se um modelo cada vez mais popular⁸. Os modelos de roedores têm gerado crescente interesse devido aos baixos custos operacionais, à necessidade limitada de espaço e ao menor tempo necessário para a cicatrização óssea⁹. Além disso, os roedores possuem um amplo espectro de anticorpos e alvos gênicos, que permitem estudos sobre os mecanismos moleculares de cicatrização e regeneração óssea¹⁰. Uma reunião de consenso destacou de forma abrangente vários modelos de cicatrização óssea de pequenos animais e enfocou os diferentes parâmetros que influenciam a cicatrização óssea, além de enfatizar vários modelos e implantes de fraturas de pequenos animais¹¹.

Os modelos básicos de fratura podem ser amplamente divididos em modelos abertos ou fechados. Os modelos de fratura fechada usam uma força de flexão de três ou quatro pontos no osso e não requerem uma abordagem cirúrgica convencional. Levam a fraturas oblíquas ou espirais, assemelhando-se a fraturas de ossos longos em humanos, mas a falta de padronização da localização e das dimensões da fratura pode atuar como fator de confusão nelas¹². Os modelos de fratura exposta requerem acesso cirúrgico para osteotomia óssea, ajudam a alcançar um padrão de fratura mais consistente no local da fratura, mas estão associados à cicatrização tardia em comparação com os modelos fechados¹³. A escolha do osso utilizado para estudar a cicatrização da fratura continua sendo principalmente a tíbia e o fêmur devido às suas dimensões e acessibilidade. A escolha do local da fratura é geralmente a diáfise ou metáfise. A região metafisária é especialmente escolhida nos casos em que a cicatrização da fratura é estudada em indivíduos osteoporóticos, pois a metáfise é mais afetada pela osteoporose¹⁴. Vários implantes como pinos intramedulares e fixadores externos podem ser utilizados para estabilizar a fratura^11,15.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de roedores simples e fácil de seguir que pudesse ajudar os pesquisadores não apenas a entender o desenvolvimento do calo após a fratura do fêmur, mas também a determinar se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas, entendendo o mecanismo pelo qual ela age.

Protocolo

Experimentos com animais foram feitos após aprovação ética do Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC), AIIMS, Nova Delhi, Índia (286/IAEC-1/2021).

1. Procedimento pré-operatório

1. Ratos albinos Wistar machos domésticos de 6 a 8 semanas de idade, pesando entre 150-200 g cada, em uma Central Animal Facility (CAF) em gaiolas individuais separadas. Isso garante que não haja lesão cirúrgica/no local da fratura quando vários ratos compartilham gaiolas.
2. Manter os ratos a uma temperatura de 23 °C ± 2 °C num ambiente com humidade controlada com humidade de 50% ± 5%, expô-los a um ciclo escuro/claro de 12 h e dar acesso ad libitum a alimentos (dieta semissintética padrão): dieta de pellets (seca) e água. A composição da dieta semissintética padrão é a seguinte: farinha de grama de Bengala torrada (60%), farinha de trigo (22%), caseína (4%), leite em pó desnatado (5%), óleo refinado (4%), mistura de sal com amido (4,8%) e mistura de colina vitamínica com amido (0,2%).
3. Aclimatar os ratos por um período de pelo menos 48 h antes da cirurgia.
4. Pese cada rato em uma balança digital e anote o peso.
5. Administrar injeções intraperitoneais (IP) de cefuroxima (100 mg/kg de peso corporal), tramadol (25 mg/kg de peso corporal) e uma combinação de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) aos ratos 15 min antes de iniciar o procedimento cirúrgico. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o olho seco.
6. Remova o pelo do membro inferior direito, da região do flanco até a articulação do joelho, com a aplicação tópica de um creme depilatório.
   NOTA: O sangue (0,5 mL) pode ser coletado da veia caudal de cada rato para a análise basal de diferentes parâmetros. O sangue pode ser coletado novamente a cada 2 semanas após a cirurgia.

2. Procedimento cirúrgico para a criação de fratura transversa completa através de osteotomia exposta

NOTA: Utilize uma sala de operações designada com uma mesa de operação e temperatura ambiente ideal (26 °C) para a realização do procedimento.

1. Coloque o bloco de cera (bandeja de alumínio 30 cm x 30 cm x 4 cm contendo cera até uma profundidade de 2,5 cm) na mesa de operação e cubra-o com cortinas estéreis. O bloco de cera impede qualquer alteração na posição do animal durante a cirurgia.
2. Confirme o início da anestesia (verificando a perda de beliscões do dedo do pé). Coloque o rato anestesiado em uma cortina estéril na posição lateral esquerda. Peça a um assistente para segurar o membro inferior direito (joelho e quadril) em extensão. Mantenha um suporte duro estéril (bloco de mármore) sob a perna direita para apoiar o fêmur. Limpe o local cirúrgico com álcool e betadine.
3. Injete anestesia local (0,25 mL de lignocaína a 1%) no local da incisão (aspecto lateral da coxa direita), corte um orifício em outra cortina estéril e exponha apenas a perna direita do rato através dela para cirurgia.
4. Dê uma incisão vertical de pele de 1 cm no lado lateral da coxa direita e estenda-a conforme a necessidade com uma lâmina cirúrgica nº 15.
5. Expor o músculo vasto lateral separando a fáscia profunda usando uma tesoura Metzenbaum. Divida o vasto lateral de acordo com as fibras musculares usando pinça arterial até que a diáfise do fêmur seja atingida.
6. Liberte o osso dos músculos ligados a ele usando o elevador periosteal.
7. Injete anestesia local (0,2 mL de lignocaína a 1%) dentro e ao redor do periósteo para prevenir o reflexo vasovagal.
8. Crie um recuo no terço médio do eixo do fêmur usando a lâmina cirúrgica no.15 e frature o osso no terço médio do eixo (fratura completa) colocando um cinzel na indentação feita (para que o cinzel não escorregue) e batendo suavemente no cinzel com um martelo. Use o suporte rígido estéril (bloco de mármore) para apoiar o osso enquanto o fratura para garantir uma ruptura limpa.
   NOTA: O suporte duro estéril geralmente não causa uma lesão significativa nos músculos por baixo.
9. Fixe internamente a fratura usando um fio K estéril (1,0 mm) mantido com a ajuda de uma furadeira elétrica operada por bateria. Passe o fio K para o canal medular do fragmento distal através do local da fratura. Em seguida, perfure o fio K através da extremidade distal do fêmur usando a furadeira elétrica operada por bateria.
   NOTA: Desinfete a superfície da furadeira elétrica com álcool antes de usar. Troque as luvas depois que o fio K for fixado.
10. Após a redução da fratura, avançar o fio K da extremidade distal para o canal do fragmento proximal até obter a compra na região trocantérica. Corte a parte distal do fio K que se projeta através da pele usando um cortador de fio.
11. Dobre a ponta do fio K a cerca de 90° usando um alicate e use uma bandagem de gaze embebida em betadine para curativo no local do alfinete. O fio K atua como uma tala intramedular para manter a fratura em uma posição reduzida.
12. Certifique-se de hemostasia completa antes de fechar a pele usando uma sutura de nylon 3-0. Aplique pressão sobre a área de sangramento usando gaze estéril ou pinça arterial para parar qualquer sangramento.
13. Limpe a ferida com betadine e cubra-a com gaze estéril e fita adesiva de microporos.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Devolver os ratos às suas gaiolas, permitir a deambulação normal e continuar a dar uma dieta semissintética padrão até os sacrificar, bem como antibióticos (injeção cefuroxima 100 mg/kg) e analgésicos (injeção tramadol 25 mg/kg/dia em duas doses fracionadas) por via intraperitoneal durante 5 dias após o procedimento.
   NOTA: Os ratos podem ser divididos em grupos de tratamento e controle para testar um determinado medicamento. Se a droga é solúvel em água, pode ser administrada por via oral através de gavagem. O peso dos animais individuais pode ser anotado para calcular a dose do medicamento a ser usado. Critérios de inclusão e exclusão podem ser seguidos para garantir a homogeneidade dos grupos de animais.
2. Abrigar os animais em gaiolas individuais em condições semelhantes ao período pré-operatório. Inspecione o local cirúrgico todos os dias para procurar quaisquer sinais de dor pós-operatória, infecção da ferida, escorregamento de suturas ou qualquer inchaço ou desconforto abdominal.
3. Avalie a cicatrização óssea por raio-X do local fraturado uma vez por semana.

4. Procedimento radiológico

1. Antes da radiografia, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (50 mg/kg de peso corporal) e xilazina (5 mg/kg de peso corporal).
2. Manter a articulação do quadril do rato em uma posição flexionada e abduzida, enquanto a articulação do joelho é mantida semi-flexionada para fazer a radiografia do membro fraturado com as seguintes configurações de exposição: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6,4; e configurações de exposição automática (Ref. mA=160).
   NOTA: As radiografias foram realizadas no início do estudo (1 dia após a cirurgia) e depois uma vez por semana até o sacrifício ou 5 semanas.

5. Eutanásia animal e recuperação de calos

1. Sacrificar os ratos por uma overdose de dióxido de carbono (administrar 100% de CO₂ a uma taxa de fluxo de 7-8 L/min por 1 min, seguido por um período de espera de 4-5 min), em dois pontos de tempo previamente determinados, com base na aparência radiológica de calos de ponte macia e dura, respectivamente.
2. Incida a pele paralela ao fêmur e separe os músculos sobrejacentes cuidadosamente para evitar danos ao tecido do calo.
3. Fratura do osso entre a articulação do quadril e o tecido do calo usando um martelo e cinzel. Da mesma forma, fratura do osso entre o calo e a articulação do joelho. Remova o fio K e limpe o pedaço ósseo em solução salina para remover coágulos sanguíneos e tecidos moles.
4. Transfira o calo imediatamente para um recipiente rotulado com formalina tamponada neutra a 10% (20 mL por amostra) e mantenha-o por 3 dias à temperatura ambiente (RT).

6. Descalcificação do tecido ósseo e calo

1. Pegue o tecido calo da formalina e mantenha-o em RT em solução de ETDA a 20%, pH 7, para descalcificação do tecido ósseo.
2. Troque a solução fresca de EDTA a cada 2 dias por aproximadamente 3 semanas e verifique se há descalcificação óssea cutucando o osso com uma agulha sem perturbar o tecido caloso. A descalcificação ideal é denotada pela perda da sensação normal de areia do tecido ósseo.
3. Após a descalcificação completa, corte a seção sagital do calo e prepare blocos de parafina do tecido do calo. Corte cortes de 4 μm de espessura do tecido caloso para histopatológico¹⁶ e qualquer outra análise comparativa¹⁷.

Resultados

Este estudo foi realizado para desenvolver um modelo de osteotomia do fêmur em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar a cicatrização óssea, bem como o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização óssea. Precauções e protocolos cirúrgicos padrão foram seguidos. Aventais estéreis, cortinas e equipamentos cirúrgicos foram utilizados para o procedimento (Figura 1). O equipamento (Tabela 1) foi esterilizado 48 h a...

Discussão

Este método descreve com lucidez os detalhes necessários para desenvolver um modelo de osteotomia de fratura em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização de fraturas, bem como compreender os meandros da cicatrização óssea. A característica saliente deste método é que ele é simples e não precisa de muito tempo ou equipamentos sofisticados. Neste método, ratos albinos Wistar machos adultos foram selecionados como ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2