Protocollo per lo sviluppo di un modello di osteotomia femorale in ratti albini Wistar

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per fratturare iatrogenicamente l'asta del femore dei ratti albini Wistar e seguire lo sviluppo del callo. Questo modello di osteotomia del femore può aiutare i ricercatori a valutare il processo di guarigione delle fratture e a studiare come un farmaco potrebbe influenzare la guarigione delle fratture.

Abstract

La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l'azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti. I farmaci osteoanabolizzanti hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi elevati o effetti collaterali indesiderati. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di roditore osteotomia del femore che potesse aiutare i ricercatori a comprendere lo sviluppo della formazione di callo dopo la frattura dell'albero del femore e che potesse aiutare a stabilire se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea. I ratti albini Wistar maschi adulti sono stati utilizzati dopo l'autorizzazione del Comitato etico istituzionale per gli animali. I roditori sono stati anestetizzati e, in condizioni asettiche, sono state create fratture trasversali complete al terzo centrale degli alberi dei femori utilizzando l'osteotomia aperta. Le fratture sono state ridotte e fissate internamente utilizzando fili K intramidollari e la guarigione secondaria delle fratture è stata consentita. Dopo l'intervento chirurgico, analgesici intraperitoneali e antibiotici sono stati somministrati per 5 giorni. Le radiografie settimanali sequenziali hanno valutato la formazione di callo. I ratti sono stati sacrificati sulla base di punti temporali radiologicamente predeterminati e lo sviluppo del callo della frattura è stato analizzato radiologicamente e utilizzando l'immunoistochimica.

Introduzione

L'osso è un tessuto connettivo denso costituito da cellule che formano l'osso, gli osteoblasti e le cellule che riassorbono l'osso, gli osteoclasti. La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l'azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti¹. Quando c'è una frattura, l'attività osteoblastica e osteoclastica nel sito della frattura sono alcuni dei fattori importanti che determinano la guarigione ossea². Quando la guarigione delle fratture devia dal suo corso normale, si traduce in un'unione ritardata, in una malunione o in una non unione. Una frattura si dice non unione quando c'è un fallimento dell'unione della frattura per 9 mesi, senza progressione di riparazione negli ultimi 3 mesi³. Circa il 10%-15% di tutte le fratture subisce un ritardo nella riparazione che può progredire fino alla non-unione⁴. Il tasso di non unione per tutte le fratture è del 5% -10% e varia a seconda dell'osso coinvolto e del sito di frattura⁵.

L'attuale regime per il trattamento della non unione delle fratture comprende modalità chirurgiche e/o mediche. Attualmente, il ritardo o la mancata unione delle fratture può essere superato da strategie chirurgiche come l'innesto osseo. Tuttavia, l'innesto osseo ha i suoi limiti e complicazioni come la disponibilità di tessuto di innesto, il dolore del sito donatore, la morbilità e l'infezione⁶. Il trattamento medico comprende farmaci osteoanabolizzanti come la proteina morfogenetica ossea (BMP) e teriparatide (analogo paratormonale). Gli agenti osteoanabolizzanti attualmente utilizzati hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi esorbitanti o effetti collaterali indesiderati⁷. Quindi, c'è spazio per identificare alternative economiche e non chirurgiche per la guarigione ossea. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Un farmaco noto per migliorare la guarigione ossea deve essere valutato in vitro e, se trovato promettente, può essere utilizzato per studi su modelli animali in vivo . Se il farmaco dimostra di promuovere la formazione e il rimodellamento osseo nel modello in vivo , potrebbe procedere alla fase successiva (cioè studi clinici).

Valutare la guarigione delle fratture negli animali è un passo avanti logico per valutare un nuovo agente introdotto per la guarigione ossea prima che venga sottoposto a prove umane. Per gli studi in vivo su modelli animali di guarigione delle fratture, i roditori sono diventati^{un modello 8} sempre più popolare. I modelli di roditori hanno generato un crescente interesse a causa dei bassi costi operativi, della limitata necessità di spazio e del minor tempo necessario per la guarigione delle ossa⁹. Inoltre, i roditori hanno un ampio spettro di anticorpi e bersagli genici, che consentono studi sui meccanismi molecolari di guarigione e rigenerazione ossea¹⁰. Una riunione di consenso ha evidenziato in modo completo vari modelli di guarigione delle ossa di piccoli animali e si è concentrata sui diversi parametri che influenzano la guarigione ossea, oltre a sottolineare diversi modelli di fratture e impianti di piccoli animali¹¹.

I modelli di frattura di base possono essere ampiamente suddivisi in modelli aperti o chiusi. I modelli di frattura chiusa utilizzano una forza di flessione a tre o quattro punti sull'osso e non richiedono un approccio chirurgico convenzionale. Portano a fratture oblique o a spirale, simili a fratture ossee lunghe negli esseri umani, ma la mancanza di standardizzazione della posizione e delle dimensioni della frattura può agire come fattore di confusione in loro¹². I modelli di frattura aperti richiedono l'accesso chirurgico per l'osteotomia dell'osso, aiutano a raggiungere un modello di frattura più coerente nel sito di frattura, ma sono associati a una guarigione ritardata rispetto ai modelli chiusi¹³. La scelta dell'osso utilizzato per studiare la guarigione delle fratture rimane principalmente la tibia e il femore a causa delle loro dimensioni e accessibilità. La scelta del sito di frattura è di solito la diafisi o metafisi. La regione metafisaria è appositamente scelta nei casi in cui la guarigione delle fratture è studiata in soggetti osteoporotici, poiché la metafisi è più influenzata dall'osteoporosi¹⁴. Diversi impianti come perni intramidollari e fissatori esterni possono essere utilizzati per stabilizzare la frattura^11,15.

L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un modello di roditore semplice e facile da seguire che potesse aiutare i ricercatori non solo a comprendere lo sviluppo del callo dopo la frattura del femore, ma potrebbe aiutare a determinare se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea comprendendo il meccanismo con cui agisce.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti dopo aver ottenuto l'approvazione etica dall'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, Nuova Delhi, India (286 / IAEC-1 / 2021).

1. Procedura preoperatoria

1. Ratti albini Wistar maschi di 6-8 settimane di età, del peso compreso tra 150-200 g ciascuno, in una struttura animale centrale (CAF) in gabbie individuali separate. Ciò garantisce l'assenza di lesioni chirurgiche / fratture quando più ratti condividono le gabbie.
2. Mantenere i ratti ad una temperatura di 23 °C ± 2 °C in un ambiente a umidità controllata con un'umidità relativa del 50% ± del 5%, esporli a un ciclo buio/luce di 12 ore e dare accesso ad libitum al cibo (dieta semisintetica standard): dieta pellet (secca) e acqua. La composizione della dieta semi-sintetica standard è la seguente: farina di grammo del Bengala tostata (60%), farina di frumento (22%), caseina (4%), latte scremato in polvere (5%), olio raffinato (4%), miscela di sale con amido (4,8%) e miscela di colina vitaminica con amido (0,2%).
3. Acclimatare i ratti per un periodo di almeno 48 ore prima dell'intervento chirurgico.
4. Pesare ogni ratto su una bilancia digitale e annotare il peso.
5. Somministrare iniezioni intraperitoneali (IP) di cefuroxima (100 mg/kg di peso corporeo), tramadolo (25 mg/kg di peso corporeo) e una combinazione di ketamina (75 mg/kg di peso corporeo) con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) ai ratti 15 minuti prima di iniziare la procedura chirurgica. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'occhio secco.
6. Rimuovere i peli dall'arto inferiore destro, dalla regione del fianco fino all'articolazione del ginocchio, con applicazione topica di una crema depilatoria.
   NOTA: Il sangue (0,5 ml) può essere raccolto dalla vena caudale di ciascun ratto per l'analisi di base di diversi parametri. Il sangue può essere raccolto di nuovo ogni 2 settimane dopo l'intervento.

2. Procedura chirurgica per la creazione di una frattura trasversale completa attraverso osteotomia aperta

NOTA: Utilizzare una sala operatoria designata con un tavolo operatorio e una temperatura ambiente ottimale (26 °C) per eseguire la procedura.

1. Posizionare il blocco di cera (vassoio in alluminio 30 cm x 30 cm x 4 cm contenente cera fino a una profondità di 2,5 cm) sul tavolo operatorio e coprirlo con teli sterili. Il blocco di cera impedisce qualsiasi cambiamento nella posizione dell'animale durante l'intervento chirurgico.
2. Confermare l'inizio dell'anestesia (controllando la perdita del pizzico del dito del piede). Posizionare il ratto anestetizzato su un drappo sterile in posizione laterale sinistra. Chiedi a un assistente di tenere l'arto inferiore destro (ginocchio e anca) in estensione. Tenere un supporto duro sterile (blocco di marmo) sotto la gamba destra per sostenere il femore. Pulire il sito chirurgico con alcool e betadine.
3. Iniettare l'anestesia locale (0,25 ml di lignocaina all'1%) nel sito di incisione (aspetto laterale della coscia destra), praticare un foro in un altro drappeggio sterile ed esporre solo la gamba destra del ratto attraverso di esso per un intervento chirurgico.
4. Dare un'incisione cutanea verticale di 1 cm sul lato laterale della coscia destra ed estenderla secondo necessità con una lama chirurgica n. 15.
5. Esporre il muscolo vasto laterale separando la fascia profonda usando le forbici Metzenbaum. Dividere il vasto laterale in linea con le fibre muscolari usando una pinza arteriosa fino a raggiungere l'asta del femore.
6. Liberare l'osso dai muscoli ad esso attaccati usando l'ascensore periostale.
7. Iniettare l'anestesia locale (0,2 ml di lignocaina all'1%) all'interno e intorno al periostio per prevenire il riflesso vasovagale.
8. Creare una rientranza nel terzo centrale dell'asta del femore usando la lama chirurgica n. 15 e fratturare l'osso nel terzo medio dell'asta (frattura completa) posizionando uno scalpello sulla rientranza fatta (in modo che lo scalpello non scivoli) e picchiettando delicatamente lo scalpello con un martello. Utilizzare il supporto duro sterile (blocco di marmo) per sostenere l'osso mentre lo frattura per garantire una rottura pulita.
   NOTA: Il supporto duro sterile di solito non causa lesioni significative ai muscoli sottostanti.
9. Fissare internamente la frattura utilizzando un filo K sterile (1,0 mm) tenuto con l'aiuto di un trapano elettrico a batteria. Passare il filo K nel canale midollare del frammento distale attraverso il sito di frattura. Quindi, perforare il filo K attraverso l'estremità distale del femore utilizzando il trapano elettrico a batteria.
   NOTA: Disinfettare la superficie del trapano elettrico con alcool prima dell'uso. Cambiare i guanti dopo aver fissato il filo K.
10. Dopo aver ridotto la frattura, far avanzare il filo K dall'estremità distale nel canale del frammento prossimale fino a quando non ottiene l'acquisto nella regione trocanterica. Tagliare la parte distale del filo K che sporge attraverso la pelle usando un tagliafilo.
11. Piegare la punta del filo K a circa 90° usando una pinza e utilizzare una benda di garza imbevuta di betadine per la medicazione del sito di spillo. Il filo K agisce come una stecca intramidollare per mantenere la frattura in una posizione ridotta.
12. Assicurarsi un'emostasi completa prima di chiudere la pelle utilizzando una sutura di nylon 3-0. Applicare pressione sull'area sanguinante utilizzando una garza sterile o una pinza arteriosa per fermare qualsiasi sanguinamento.
13. Pulire la ferita con betadine e coprirla con garza sterile e nastro adesivo a micropori.

3. Cure postoperatorie

1. Riportare i ratti nelle loro gabbie, consentire la normale deambulazione e continuare a dare una dieta semi-sintetica standard fino a sacrificarli, così come antibiotici (iniezione cefuroxima 100 mg / kg) e analgesici (iniezione tramadolo 25 mg / kg / die in due dosi divise) per via intraperitoneale per 5 giorni dopo la procedura.
   NOTA: I ratti possono essere suddivisi in gruppi di trattamento e di controllo per testare un particolare farmaco. Se il farmaco è solubile in acqua, può essere somministrato per via orale attraverso il gavage. Il peso dei singoli animali può essere annotato per calcolare la dose del farmaco da utilizzare. I criteri di inclusione ed esclusione possono essere seguiti per garantire l'omogeneità dei gruppi di animali.
2. Ospitare gli animali in gabbie individuali in condizioni simili al periodo preoperatorio. Ispezionare il sito chirurgico ogni giorno per cercare eventuali segni di dolore postoperatorio, infezione della ferita, scivolamento dei punti di sutura o qualsiasi gonfiore o disagio addominale.
3. Valutare la guarigione ossea mediante radiografia del sito fratturato una volta alla settimana.

4. Procedura radiologica

1. Prima della radiografia, anestetizzare i ratti con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (5 mg/kg di peso corporeo).
2. Mantenere l'articolazione dell'anca del ratto in posizione flessa e abdotta mentre l'articolazione del ginocchio viene mantenuta semiflessa per eseguire la radiografia dell'arto fratturato con le seguenti impostazioni di esposizione: Rif. kVp ≈ 62; mAS = 6.4; e impostazioni di esposizione automatica (Rif. mA=160).
   NOTA: I raggi X sono stati presi al basale (1 giorno dopo l'intervento chirurgico) e poi una volta alla settimana fino al sacrificio o 5 settimane.

5. Eutanasia animale e recupero del callo

1. Sacrificare i ratti con un sovradosaggio di anidride carbonica (somministrare il 100% di CO₂ ad una portata di 7-8 L/min per 1 minuto, seguito da un periodo di attesa di 4-5 minuti), in due punti temporali precedentemente determinati, in base all'aspetto radiologico di calli morbidi e duri, rispettivamente.
2. Incidere la pelle parallelamente al femore e separare accuratamente i muscoli sovrastanti per evitare danni al tessuto calloso.
3. Frattura dell'osso tra l'articolazione dell'anca e il tessuto callo usando un martello e uno scalpello. Allo stesso modo, frattura dell'osso tra il callo e l'articolazione del ginocchio. Rimuovere il filo K e pulire il pezzo di osso in soluzione salina per rimuovere coaguli di sangue e tessuti molli.
4. Trasferire immediatamente il callo in un contenitore marcato con formalina tamponata neutra al 10% (20 ml per campione) e conservarlo per 3 giorni a temperatura ambiente (RT).

6. Decalcificazione dell'osso e del tessuto callo

1. Prelevare il callo dalla formalina e mantenerlo a RT in soluzione ETDA al 20%, pH 7, per la decalcificazione del tessuto osseo.
2. Cambiare la soluzione di EDTA fresca ogni 2 giorni per circa 3 settimane e controllare la decalcificazione ossea colpendo l'osso con un ago senza disturbare il tessuto calloso. La decalcificazione ottimale è denotata dalla perdita della normale sensazione granulosa del tessuto osseo.
3. Dopo completa decalcificazione, tagliare la sezione sagittale del callo e preparare blocchi di paraffina del tessuto calloso. Tagliare sezioni spesse 4 μm del tessuto del callo per istopatologico¹⁶ e qualsiasi altra analisi comparativa¹⁷.

Risultati

Questo studio è stato intrapreso per sviluppare un modello di osteotomia del femore in ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare la guarigione ossea, così come l'effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione ossea. Sono state seguite le precauzioni chirurgiche e i protocolli standard. Per la procedura sono stati utilizzati camici sterili, tende e attrezzature chirurgiche (Figura 1). L'apparecchiatura (Tabella 1)...

Discussione

Questo metodo descrive lucidamente i dettagli necessari per sviluppare un modello di osteotomia per frattura nei ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione delle fratture, nonché per comprendere la complessità della guarigione ossea. La caratteristica saliente di questo metodo è che è semplice e non richiede troppo tempo o attrezzature sofisticate. In questo metodo, i ratti albini maschi adulti Wistar sono sta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2