Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Resumen

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente > 6 × 10⁹ unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Resumen

El virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), también conocido como serotipo 1 del ortoavulavirus aviar, es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo que se ha desarrollado como un virus oncolítico y una vacuna vectorizada viralmente. El VEN es un agente terapéutico y profiláctico atractivo debido a su sistema genético inverso bien establecido, potentes propiedades inmunoestimulantes y excelente perfil de seguridad. Cuando se administra como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viralmente, el VEN provoca una respuesta inmune antitumoral o antígeno robusta, activando los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario.

Dadas estas características deseables, el VEN ha sido evaluado en numerosos ensayos clínicos y es uno de los virus oncolíticos mejor estudiados. Actualmente, hay dos ensayos clínicos registrados que involucran el VEN: uno que evalúa una vacuna recombinante vectorizada por el VEN para el SARS-CoV-2 (NCT04871737), y un segundo que evalúa un NDV recombinante que codifica la interleucina-12 en combinación con Durvalumab, un anticuerpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar un mayor avance de este vector viral altamente prometedor, se necesitan métodos simplificados para generar UN VEN (rNDV) recombinante de alto título, de grado in vivo.

Este documento describe un procedimiento detallado para amplificar el rNDV en huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados (SPF) y purificar el rNDV a partir de líquido alantoico, con mejoras para reducir la pérdida durante la purificación. También se incluyen descripciones de los ensayos de control de calidad recomendados, que deben realizarse para confirmar la falta de contaminantes y la integridad del virus. En general, este procedimiento detallado permite la síntesis, purificación y almacenamiento de VEN de alto título, de grado in vivo, recombinante, lentogénico y mesogénico para su uso en estudios preclínicos.

Introducción

El virus de la enfermedad de Newcastle, también conocido como ortoavulavirus aviar-1, es un paramixovirus aviar envuelto con el potencial de ser utilizado como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viral 1,2,3,4,5,6,7. Más recientemente, el VEN diseñado para expresar la proteína espiga del SARS-CoV-2 se ha caracterizado como una vacuna intranasal efectiva en modelos^de desafío de ratón y hámster ^7,8,9. Cuando se usa como inmunoterapia contra el cáncer, resulta en el reclutamiento de células inmunes innatas, específicamente células asesinas naturales, producción de interferón tipo I y la generación de células T antitumorales específicas 10,11,12,13. Además de estas potentes propiedades inmunoestimulantes, el VEN tiene un fuerte perfil de seguridad y un sistema de genética inversa bien establecido^14,15. Estas características deseables han impulsado la evaluación del VEN en numerosos ensayos clínicos preclínicos y humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Para avanzar aún más en este vector viral inmunoestimulador altamente prometedor, se necesitan métodos detallados para producir y purificar el VEN ultrapuro de alto título que se puede administrar de manera segura in vivo.

Como el VEN es un paramixovirus aviar, se amplifica con mayor frecuencia en los huevos de gallina embrionados. Si bien existen sistemas basados en células disponibles para propagar el VEN, la mayoría no ha podido producir títulos similares a los logrados en los huevos de gallina embrionados¹⁸. Sin embargo, existen algunos inconvenientes en la producción de VEN en los huevos, incluido el hecho de que la producción a base de huevos es larga y no fácilmente escalable, el abastecimiento de grandes cantidades de huevos de gallina SPF puede ser problemático, y existe el potencial de contaminación con alérgenos de huevo 13,18,19,20 . Recientemente, un grupo ha demostrado que las células Vero cultivadas en suspensión en medio libre de suero pueden soportar la replicación del VEN a títulos comparables a los logrados en los óvulos, antes de la purificación²¹. Sin embargo, esto requirió el paso en serie del virus para adaptar el virus a las células Vero, y la optimización de un método para purificar el VEN de las células Vero en suspensión todavía se requiere²¹.

Como se destacó anteriormente, los métodos utilizados para purificar el virus de alto título e in vivo varían según el virus en cuestión²². Existe un sistema de genética inversa bien establecido disponible para la generación de VEN recombinante. Este proceso, que implica el uso de un clon de ADNc, plásmidos ayudantes y un virus ayudante que expresa ARN polimerasa T7, ha sido descrito previamente en detalle^15,23. Este protocolo se puede aplicar al VEN lentogénico o mesogénico. El virus descrito en este protocolo es un NDV mesogénico recombinante que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria insertada entre los genes virales P y M como una unidad de transcripción individual, ya que este ha sido descrito previamente como el sitio óptimo para la inserción de transgenes extraños²⁴.

Los métodos cerrados describen la purificación del VEN en función de su tamaño, que varía de 100 a 500 nm, y su densidad¹⁵. Esto ha permitido la generación de existencias de VEN de alto título de grado in vivo en aproximadamente 3 semanas, desde que se reciben los huevos hasta que se tienen un título final. Se describen las técnicas utilizadas con frecuencia en la producción a gran escala de virus a base de huevos, como la filtración de flujo tangencial, la filtración de profundidad y la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que permite la traducción de estos métodos a una producción a mayor escala. Las técnicas descritas anteriormente para la purificación del VEN se han mejorado mediante la incorporación de un tampón estabilizador de virus, el uso de iodixanol durante la ultracentrifugación del gradiente de densidad y la descripción de diversas medidas de control de calidad para garantizar la calidad de grado in vivo ¹⁵. Esto ha permitido que la purificación del VEN de grado in vivo alcance títulos tan altos como 3 × 10¹⁰ PFU / ml de 0.8 a 1.0 L de líquido alantoico.

Protocolo

Todo el trabajo que involucra el uso de animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Todo el trabajo se realiza en un laboratorio de Nivel 2 de Bioseguridad (BSL2) en Canadá, donde el VEN mesogénico es un patógeno del grupo de riesgo 2. Todos los pasos involucrados en la amplificación y purificación del VEN deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica Tipo IIA para fines de seguridad y esterilidad.

1. Amplificación del VEN utilizando huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados

1. Inoculación de huevos de gallina embrionados con SPF
   NOTA: Por lo general, ocho docenas de huevos de gallina embrionados con SPF se utilizan para generar un lote de NDV de grado in vivo. Ordene una o dos docenas de huevos adicionales para tener en cuenta los daños durante el envío, así como la variabilidad en la viabilidad. Los huevos de gallina embrionados son material biológico y deben manipularse de acuerdo con las directrices institucionales. Sin embargo, dado que los embriones no nacen, no se requiere la aprobación del Comité de Cuidado Animal institucional.
   1. Después de recibir huevos de gallina embrionados SPF, incubar en una incubadora de huevos a 37 ° C, 60% de humedad durante 9 días. Asegúrese de que la incubadora esté configurada para balancear / rotar automáticamente los huevos cada hora.
      NOTA: Los huevos se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 24 h o 4 °C durante un máximo de 72 h; sin embargo, esto puede disminuir la viabilidad del embrión.
   2. Después de 8-11 días de incubación (idealmente el día 9), incite los huevos para determinar la viabilidad del embrión. Busque vasculatura similar a una red (Figura 1A) y movimiento embrionario como indicadores de embriones viables. Deseche los huevos que carezcan de estas características (Figura 1B).
   3. En los óvulos viables, marque la interfaz entre el saco de aire y el embrión a lápiz con una 'X' (Figura 1A). Asegúrese de que este sitio de inyección no cause perforación de la vasculatura. Devuelva los huevos marcados a la incubadora mientras se prepara el inóculo.
   4. Calcule la cantidad de virus requerida para inyectar todos los huevos de gallina embrionados SPF. Asegúrese de que cada óvulo reciba 100 PFU de virus en un volumen de 100 μL; diluir el virus en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 × 10³ PFU/ml. Prepare un 20% adicional del inóculo para tener en cuenta las imprecisiones en la administración del virus.
   5. Usando una toallita antiestática, limpie la parte superior de los huevos marcados con una solución de yodo al 10%, diluida en etanol al 70%. Espere aproximadamente 1-2 minutos para que la solución se seque.
   6. Perfore cuidadosamente la cáscara con un par de pinzas afiladas estériles. Desinfectar las pinzas en etanol al 70% entre los huevos.
   7. Utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G, inyectar 100 μL del inóculo preparado en el paso 1.1.4 en la cavidad corioalantoica (Figura 1C). Acércate con la aguja en un ángulo de casi 90° al huevo. Inserte la aguja justo en la parte superior de la membrana corioalantoica.
   8. Después de la inoculación, use esmalte de uñas para cubrir el sitio de punción y devuelva los huevos a la incubadora. Asegúrese de que el ajuste del balanceo esté ENCENDIDO hasta las 24 horas posteriores a la inoculación.
   9. Comprobar la viabilidad del huevo 24 h después de la inoculación. Descartar óvulos muertos que carezcan de vasculatura en la membrana corioalantoica y movimiento embrionario (Figura 1B).
      NOTA: Estos óvulos han muerto debido al proceso de inoculación y no por el VEN.
   10. Devuelva los huevos a la incubadora, con el balancín apagado para evitar la contaminación del líquido alantoico con proteínas de huevo.
   11. Compruebe los huevos cada 12-24 h como se describe en el paso 1.1.9 para identificar los huevos muertos. Mueva los óvulos que mueren después de 24 horas después de la inoculación a 4 ° C para minimizar la autólisis. Cosechar el líquido alantoico dentro de las 2-12 h posteriores al enfriamiento.
   12. Incubar los huevos durante al menos 72 h.
       NOTA: Si se propaga una cepa mesogénica de NDV, el tiempo óptimo de incubación es de 60-72 h, ya que los tiempos de incubación prolongados pueden afectar el proceso de purificación debido a la claridad reducida del líquido alantoico. Este problema no es tan importante cuando se propagan cepas lentogénicas del VEN, ya que tardan mucho más en matar al embrión.
   13. Después del período de incubación apropiado, mueva los huevos restantes a 4 ° C durante 2-12 h antes de cosechar el líquido alantoico.
2. Recolección de líquido alantoico que contiene VEN
   1. Mueva los huevos refrigerados al gabinete de bioseguridad. Limpia la parte superior de los huevos con etanol al 70%.
   2. Use pinzas estériles y tijeras quirúrgicas para abrir el lado apical del huevo donde se encuentra el saco de aire.
   3. Retire la cáscara para revelar la membrana corioalantoica (Figura 1D).
   4. Perfore cuidadosamente la membrana y péguela hacia atrás para exponer la cavidad alantoica (Figura 1E). Asegúrese de que el saco vitelino no se perfore accidentalmente, ya que esto estropeará el huevo.
   5. Use fórceps contundentes para agarrar el embrión y abrir el saco embrionario.
      NOTA: El líquido dentro del saco embrionario también contiene VEN.
   6. Deprimir el embrión con los fórceps y recoger el líquido alantoico utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
   7. Guarde el líquido alantoico en hielo en tubos cónicos de 15 ml hasta su clarificación.
      NOTA: Si el líquido alantoico es amarillo, el saco vitelino se ha visto comprometido y el líquido alantoico debe desecharse.
   8. Centrifugar los tubos cónicos que contienen el líquido alantoico a 1.500 × g durante 10 min a 4 °C.
   9. Punto de pausa: Alícuota el líquido alantoico clarificado en tubos cónicos de 50 ml y guárdelos a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, semanas o meses), complementando el líquido con sacarosa a una concentración final del 5% para proteger el virus de los duros efectos de la congelación-descongelación. Alternativamente, para el almacenamiento a corto plazo (por ejemplo, 1-3 días), complemente el líquido alantoico con sacarosa (5% final) o con 3 tampones de manitol-lisina (ML) (15% de manitol, 3% de lisina; consulte la Tabla suplementaria S1 para recetas de tampón) para obtener una concentración final de 1x (5% de manitol, 1% de lisina) antes del almacenamiento a 4 ° C.

2. Purificación del VEN a partir de líquido alantoico

1. Filtración en profundidad del fluido alantoico
   1. Guarde el líquido alantoico clarificado a -80 °C y descongele a 4 °C la noche antes de purificarlo.
   2. En un gabinete de seguridad biológica, configure el tubo y la bomba peristáltica como se muestra en la Figura 2.
   3. Si aún no se ha realizado, combine el líquido alantoico con 3x ML tampón a una concentración final de 1x.
   4. Antes de conectar el filtro de profundidad, esterilize el tubo pasando 50 ml de 0,5 M de NaOH a través del sistema a un recipiente de desechos.
   5. Enjuague el tubo pasando 100 ml de agua estéril de grado molecular a través del sistema y hacia el recipiente de desechos.
      NOTA: Como el NaOH inactivará el VEN, es importante que las líneas se laven adecuadamente antes de introducir el líquido alantoico que contiene el virus.
   6. Cebar el sistema haciendo funcionar 50 ml de PBS a través de él, deteniendo la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de PBS en el tubo.
   7. Conecte el filtro de profundidad con una clasificación de retención de 1-3 μM al tubo y retire la segunda tapa en el lado apical del filtro de profundidad para ventilar el filtro. Comience a ejecutar 50 ml adicionales de PBS a través del sistema.
   8. Una vez que PBS comience a fluir a través de la ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe fluyendo PBS a través de las líneas.
      NOTA: Las burbujas de aire menores son aceptables, pero la presencia de grandes cantidades de aire requerirá que el filtro se ventile nuevamente como se describe en los pasos 2.1.7 y 2.1.8.
   9. Detenga la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de PBS en el tubo.
   10. Reemplace el recipiente de desechos con un nuevo recipiente de recolección estéril y comience a pasar el líquido alantoico a través del filtro de profundidad.
       NOTA: La presión no debe exceder los 10 psi, ya que esto resulta en la cizalladura del virus. La presión se puede manipular disminuyendo o aumentando el caudal de la bomba. Si la presión comienza a exceder los 10 psi y el caudal no se puede disminuir más, se debe usar un nuevo filtro de profundidad. En este caso, los pasos 2.1.6-2.1.8 deben realizarse antes de reanudar el flujo de líquido alantoico.
   11. Una vez que todo el líquido alantoico haya pasado a través del filtro, ejecute 50 ml de búfer de 1 ml a través de las líneas para maximizar la recuperación del virus.
   12. Recoge el líquido hasta que las líneas se sequen. Conservar el virus durante la noche o hasta 36 h a 4 °C.
       NOTA: Una vez que el virus haya sido filtrado en profundidad, continúe el proceso de purificación dentro de las 36 h posteriores a la finalización de la filtración en profundidad.
   13. Desconecte el filtro de profundidad y desinfecte el tubo haciendo funcionar 100 mL de 0.5 M NaOH, 400 PPM de lejía precalentada a 42 °C a través del sistema antes de almacenarla en 0.5 M NaOH.
2. Filtración de flujo tangencial para la concentración de NDV
   1. Ensamble los componentes del casete como se muestra en la Figura 3A (y como se muestra anteriormente²⁵) en un gabinete de seguridad biológica.
      NOTA: El colector y la placa final deben lavarse en detergente y secarse antes de su uso. Las juntas de silicio son reutilizables y deben almacenarse en 0,5 M NaOH con el cassette.
   2. Configure el sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (también conocido como filtración de flujo cruzado) en una conformación "abierta" (Figura 3B).
      1. Si usa un cassette por primera vez, ensamble el cassette TFF en la conformación de Elución y enjuague con 100 mL de agua estéril de grado molecular (Figura 3C).
      2. Una vez que solo queden 5 ml de agua en el tanque del depósito, detenga la bomba y cambie la configuración del sistema TFF a una conformación cerrada (Figura 3D).
      3. Agregue 100 ml de NaOH de 0,5 M de NaOH, 400 PPM de lejía precalentada a 42 °C al depósito y recorra el sistema durante 30-60 min.
      4. Pausar el flujo y devolver el sistema TFF a la configuración de elución, reanudando el flujo para eluir la solución de limpieza.
      5. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y agregue 100 ml de agua estéril de grado molecular para enjuagar el sistema.
      6. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y coloque el sistema TFF en la conformación abierta (Figura 3B). Continúe con el paso 2.2.3.
   3. Esterilizar el cassette y el tubo pasando 100 mL de 0,5 M de NaOH a través del sistema utilizando la bomba peristáltica. Asegúrese de que la presión no exceda los 30 psi para mantener la integridad del cassette.
   4. Pausar la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de 0,5 M de NaOH en el depósito.
   5. Agregue 100 ml de agua estéril de grado molecular al depósito y reanude el paso del fluido a través del cassette. Gire el reservorio para lavar todo el NaOH de los lados del reservorio para evitar la inactivación del virus. Repita el paso de lavado del depósito.
   6. Cuando queden aproximadamente 5 ml de agua estéril de grado molecular en el depósito, detenga la bomba.
   7. Agregue 100 ml de PBS al depósito, girando para garantizar que el agua estéril de grado molecular se lave desde los lados. Reanude el flujo de líquido a través del cassette.
   8. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba, agregue líquido alantoico filtrado en profundidad al depósito y reanude el flujo de la bomba.
   9. Monitoree el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no exceda los 10 psi para evitar el cizallamiento del virus. Utilice una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y el uso de abrazaderas C para aumentar la elución a los residuos.
      NOTA: La combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y las abrazaderas C dará como resultado un aumento de la presión.
   10. Cuando queden 50-100 ml de líquido alantoico en el depósito, detenga la bomba para realizar un intercambio de búfer agregando 150-200 ml de búfer de 1x ML.
   11. Reanude el flujo de la bomba, nuevamente monitoreando el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no exceda los 10 psi.
   12. Cuando queden 5-10 ml en el depósito, detenga la bomba.
   13. Usando dos abrazaderas C, cierre las dos líneas de desecho como se muestra en la Figura 3C.
   14. Desacople la línea de retención que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 ml (Figura 3C).
   15. Reanude el flujo de la bomba, haciendo una pausa cuando queden unas gotas de líquido en el tanque del depósito.
   16. Retire las abrazaderas C de las líneas de residuos y vuelva a conectar la línea de alimentación de retención al tanque del depósito (Figura 3B).
   17. Agregue 20-25 ml de amortiguación de 1 ml y reanude el flujo de la bomba hasta que queden aproximadamente 5 ml en el tanque del depósito.
   18. Repita los pasos 2.2.13 a 2.2.16.
       NOTA: Se puede hacer una^3ª elución repitiendo los pasos 2.2.17 y 2.2.13 a 2.2.16 para aumentar el rendimiento del virus. Sin embargo, la mayor parte del virus está presente en las dos primeras eluciones.
   19. Después de terminar las eluciones, coloque el virus sobre hielo o a 4 °C.
   20. Para limpiar las líneas, configure el sistema de tal manera que sea un formato de bucle cerrado (Figura 3D) con las líneas de desecho que se retroalimentan en el depósito como se muestra en la Figura 3D.
   21. Proceda a limpiar el sistema agregando 250 ml de NaOH de 0.5 M, 400 PPM de lejía precalentada a 42 ° C.
   22. Haga fluir la solución de limpieza a través del sistema durante la noche.
       NOTA: Al recircular la solución de limpieza, si la bomba funciona a una velocidad de 50 ml / min, se debe observar una presión de aproximadamente 5 psi. Si la presión excede esto, el cassette está sucio y la solución de limpieza debe reemplazarse y el proceso debe repetirse.
   23. Eluya la solución de limpieza dirigiendo tanto las líneas de residuos como la línea de retención a un contenedor de residuos.
   24. Agregue 400-500 ml de agua estéril al depósito y háblela fluir a través del sistema y hacia los recipientes de desechos.
   25. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y agregue 100-200 ml de 0,5 M de NaOH al tanque del depósito, girando la solución para lavar el contenedor del depósito.
   26. Una vez que el depósito esté casi vacío, repita el paso 2.2.23 dos veces más.
   27. Desmonte la configuración de TFF, almacenando el cassette y las juntas de TFF en un pequeño volumen de 0,5 M de NaOH en una bolsa de plástico resellable a 4 °C.
       NOTA: Los tubos se pueden almacenar a temperatura ambiente sumergidos en 0,5 M de NaOH.
3. Ultracentrifugación por gradiente de densidad de iodixanol
   1. Encienda la ultracentrífuga y configúrela para que se enfríe previamente a 4 °C. Preenfríe el rotor deseado a 4 °C también (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Los rotores deben almacenarse a 4 °C.
   2. Utilice la solución de iodixanol al 60% (concentración en el momento de la compra) para generar soluciones de iodixanol al 40%, 20% y 10% diluyéndolas con PBS y 3x ML Buffer a una concentración final de 1x de tampón de ML.
   3. En un tubo de ultracentrífuga de pared delgada de 13,2 ml, superponga 0,5 ml, 2,5 ml y 2,5 ml de las soluciones de iodixanol al 40%, 20% y 10 %, respectivamente (Figura 4A).
      NOTA: Inclinar el tubo de la ultracentrífuga de lado y expulsar lentamente la solución reducirá significativamente el riesgo de mezclar las dos capas de gradiente. La separación de cada capa debe ser evidente, con un "halo" visible entre cada capa del gradiente.
   4. Utilice un rotulador para marcar las interfaces de las distintas capas de degradado.
   5. Capa 6-6.5 mL del virus eluido del procedimiento TFF sobre el gradiente de densidad. Agregue el virus con cuidado como se describe en el paso 2.3.3 para evitar perturbar el gradiente de densidad.
   6. Cargue los tubos de la ultracentrífuga en los insertos para el rotor del cucharón oscilante (consulte la Tabla de materiales) utilizando una báscula abierta para equilibrar los insertos dentro de 0,01 g entre sí. Use PBS o eluyente de virus adicional para tener en cuenta las diferencias de peso.
   7. Una vez que los tubos estén equilibrados, tapa los tubos y cárgalos en el rotor.
   8. Centrifugadora durante 1,5 h a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: Esto se puede realizar durante la noche si hay disponible una ultracentrífuga con capacidad de arranque retardado.
   9. Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. Busque la banda objetivo, una banda grande, entre los gradientes del 10% y el 20% (Figura 4B).
   10. Suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados con un soporte de retorta.
   11. Conecte una aguja de 18 G x 1,5 pulgadas a una jeringa de 5 ml y perfore el lado del tubo de la ultracentrífuga.
       NOTA: El tubo debe perforarse ligeramente por debajo de la banda objetivo, con la aguja en un ángulo hacia arriba y bisel hacia arriba de tal manera que viaje hacia la banda objetivo.
   12. Extienda lentamente el émbolo para quitar la banda objetivo.
       NOTA: Mueva la aguja dentro de la banda objetivo para maximizar el virus extraído. Tenga cuidado de que otras bandas o desechos no se mezclen con la banda objetivo, y evite tomar un exceso de solución, ya que esto conducirá al uso de más casetes de diálisis.
   13. Una vez que se haya extraído la banda objetivo, retire la aguja y permita que la solución restante drene en el vaso de precipitados de desecho. Dispensar la banda objetivo en un tubo cónico de 50 ml hasta que se hayan extraído todas las bandas de todos los demás tubos de ultracentrífuga.
   14. Repita los pasos 2.3.10-2.3.13 hasta que se hayan extraído todas las bandas objetivo de todos los tubos de la ultracentrífuga.
   15. Enfoque alternativo para extraer las bandas objetivo como se describe en los pasos 2.3.10 a 2.3.13
       1. Retire lentamente el líquido que se superpone a la banda objetivo con una pipeta. Una vez en la banda objetivo, extraer con una pipeta y almacenar el virus en un tubo cónico de 50 ml.
          NOTA: Esto permite reutilizar los tubos de la ultracentrífuga.
4. Eliminación de iodixanol de la solución de virus
   NOTA: La banda que contiene el VEN aparece en una densidad de iodixanol entre el 15% y el 16%. La concentración de iodixanol en la solución se puede determinar midiendo la absorbancia a 340 nm en referencia a una curva estándar (Figura suplementaria S1). Este paso puede omitirse ya que no se observaron efectos adversos ni toxicidad aguda cuando se administraron soluciones de iodixanol de esta concentración a ratones C57BL/6.
   1. Prewet un cassette de diálisis de corte de peso molecular de 0.5-3 mL 10 kDa sumergiéndolo en PBS durante 1 min.
      NOTA: La membrana de diálisis debe cambiar de lisa a tener una apariencia con volantes o baches. Si el volumen del virus extraído excede los 10 ml, se deben usar dos casetes de diálisis de 0,5-3 ml o un casete de diálisis de 5-12 ml.
   2. Según corresponda, use una jeringa de 5 o 10 ml y una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas para recoger el virus del tubo cónico de 50 ml.
   3. Use la jeringa para ingresar al cassette de diálisis, teniendo cuidado de no perforar la membrana, e inyecte el virus.
      NOTA: El cassette de diálisis se puede girar para manipular el posicionamiento de la bolsa de aire en el cassette. La bolsa de aire debe retirarse antes de retirar la aguja del cassette.
   4. Llene un vaso de precipitados de 1 L con 1x PBS estéril, coloque una barra de agitación y el cassette de diálisis en el interior, y cubra. Incubar a 4 °C con agitación suave.
      NOTA: Use espuma de poliestireno extruido y una banda elástica para conectar el cassette de diálisis para que flote en el PBS. El cassette puede hincharse ligeramente debido al búfer ml.
   5. Después de 1-2 h, reemplace con 1x PBS fresco y continúe incubando a 4 ° C durante otras 8-10 h con una ligera agitación.
      NOTA: Esto también se puede hacer durante la noche.
   6. Reemplace con 1x PBS fresco una vez más, incubando a temperatura ambiente durante 1-2 h.
5. Concentración de la solución de virus
   1. Retire el cassette de diálisis del tampón de diálisis (Figura 4C) y colóquelo en una bolsa de plástico pequeña y sellable. Agregue 15-25 ml de polietilenglicol al 40% de 20,000 MW para que el cassette de diálisis quede completamente sumergido.
   2. Incubar a temperatura ambiente con balanceo. Verifique el volumen de virus en el cassette periódicamente usando una jeringa de 5 o 10 ml y una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas.
      NOTA: La cantidad de tiempo necesario para concentrar el virus variará según el volumen inicial y el volumen final deseado. Por lo general, el volumen final deseado está entre 1 y 1,5 ml, independientemente del volumen inicial del líquido alantoico. Al verificar el volumen, tenga cuidado de no usar el mismo puerto, ya que esto comprometerá la integridad del puerto y puede resultar en la mezcla de la solución de polietilenglicol y el virus.
   3. Antes de retirar el virus concentrado del cassette de diálisis, enjuague brevemente el cassette en 1x PBS y llene una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas con aire.
   4. Inserte la jeringa llena de aire en el cassette de diálisis y presione el émbolo. Gire el aparato para que el virus concentrado pueda eliminarse sin eliminar el aire introducido.
   5. Dispensar el virus concentrado en un tubo cónico de 50 ml, anotando el volumen dispensado.
   6. Usando la misma jeringa y aguja, inyecte una cantidad adecuada de sacarosa al 60% en el cassette de diálisis para que, cuando se combine con el virus previamente eliminado, esté en una concentración final de sacarosa al 5%.
   7. Use dedos enguantados para masajear la membrana para desalojar el virus residual que puede haberse adherido a la membrana, teniendo cuidado de no dañarla. Retire parte del exceso de aire en el cassette de diálisis para facilitar el proceso de desalojo.
   8. Combine este lavado con el virus que ya está en el tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: El virus ahora está en sacarosa al 5% y listo para ser dispensado en alícuotas de 20 μL, 50 μL, 100 μL o 200 μL y almacenado a -80 ° C. Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, el VEN puede ser liofilizado y almacenado a 4 °C como se describe en la sección 2.6.
6. Liofilización del VEN
   1. Liofilizar el virus alicitado en tubos centrífugos de 1,5 ml o tubos cónicos de 15 ml a 44 × ^10-3 MBAR y -52 °C durante 16 h.
   2. Almacene las muestras liofilizadas a 4 °C sin una reducción significativa del título viral.

3. Ensayos de control de calidad

1. Aislamiento de ARN viral y PCR de transcripción inversa para la confirmación del genoma
   1. Descongelar una alícuota de virus de 20 μL. Siga el protocolo de aislamiento de ARN viral proporcionado con el kit.
   2. Utilice inmediatamente el ARN aislado como plantilla para la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) o guárdelo a -80 °C.
   3. Prepare las reacciones de transcripción inversa como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante.
   4. Utilice el ADNc resultante como plantilla para varias reacciones de PCR de control de calidad para confirmar el patotipo del VEN (Tabla 1, conjunto de cebadores de proteínas F) y la presencia de elementos de control de genes requeridos (Tabla 1, Conjunto de cebadores de transgenes).
      NOTA: Los cebadores deben diseñarse en función de la cepa del VEN que se propaga.
      1. Para secuenciar el sitio de escisión de la proteína F, el principal determinante del patotipo, utilice el conjunto de cebadores de proteínas F (Tabla 1). Busque un producto de PCR de 435 pares de bases de longitud.
         NOTA: Aquí, los cebadores se diseñaron en base a la cepa LaSota del VEN (genbank af077761.1). Está bien establecido que la expresión óptima de transgenes ocurre cuando se inserta un transgén extraño entre los genes P y M²⁴.
      2. Utilice el conjunto de cebadores de transgenes para confirmar la integridad de los elementos de inicio y fin del gen del transgén. Secuenciar el producto de PCR para confirmar el inicio del gen y la integridad de la secuencia final del gen.
   5. Envíe los productos de PCR para la secuenciación del ADN y compárelos con la plantilla para homología.
2. Tinción SDS PAGE y Coomassie para detectar proteínas contaminantes
   1. Funda un gel SDS PAGE de gradiente de densidad preparando primero soluciones de poliacrilamida al 6% y al 15% (Tabla suplementaria S1). Utilice una pipeta de 10 ml para extraer 5 ml de la solución al 15%, seguido de 5 ml de la solución al 6%.
   2. Retire la pipeta de la solución y genere una burbuja de aire extrayendo brevemente el aire.
      NOTA: A medida que la burbuja de aire viaja hacia arriba, esto mezcla la solución para crear el gradiente SDS PAGE.
   3. Dispense la solución en el aparato de fundición y deje que se solidifique durante 30 minutos.
   4. En un volumen final de 20 μL, combine una alícuota de virus con un tampón reductor 4x (Tabla suplementaria S1) para que la concentración final sea 1x, y hierva durante 10 min a 95 °C en un termociclador. Cargue al menos 1 × 10⁷ PFU del virus.
   5. Sumerja SDS PAGE en el búfer en ejecución (Tabla suplementaria S1) y cargue los ejemplos.
   6. Haga funcionar el gel a 120 V durante 1-1,5 h.
   7. Retire el gel del tampón de funcionamiento y transfiéralo a un recipiente más pequeño.
   8. Agregue la solución de tinción de Coomassie (Tabla suplementaria S1) para cubrir el gel. Incubar a temperatura ambiente durante 4-5 h.
   9. Retire la solución de tinción y agregue la solución de destinción (Tabla suplementaria S1), incubando durante 4-8 h a temperatura ambiente con agitación. Cambie la solución de detención de tres a cuatro veces.
      NOTA: El gel debe ser transparente y su color debe ser como era antes de la tinción.
   10. Imagine el gel en un ajuste colorimétrico. Consulte la Figura 5 para obtener una imagen representativa de un gel SDS PAGE teñido con Coomassie que contiene muestras de líquido alantoico y virus purificado.
3. Cuantificación del título viral infeccioso mediante la mediana de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID₅₀) y el ensayo de inmunofluorescencia
   NOTA: Las celdas Vero se pueden usar como una alternativa a las celdas DF1; sin embargo, el efecto citopático (CPE) es menos pronunciado en las células Vero. El VEN que alberga la mutación L289A, que mejora la fusogenicidad, y expresa GFP entre los genes P y M se está utilizando en este ensayo.
   1. Sembrar una placa de 96 pocillos de células DF1 a 20,000 células / pozo en un volumen de 80 μL el día anterior usando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) y 125 μg / ml de tripsina. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Al día siguiente, descongele una alícuota de 20 μL de virus en hielo.
   3. Utilice tubos de 1,5 ml para preparar diluciones en serie. Comience diluyendo 10 μL del virus con 990 μL de PBS para preparar una dilución de ^10-2 . Preparar todas las demás diluciones, hasta ^10-10 como mínimo, hechas con 900 μL de PBS y la adición de 100 μL de la dilución anterior.
      NOTA: Use una nueva punta de pipeta cuando se mueva entre diluciones.
   4. Use 20 μL de cada dilución para infectar cada pocillo de la placa de 96 pocillos como se muestra en la Figura 6.
      NOTA: El volumen final en cada pozo será de 100 μL.
   5. Incubar la placa durante al menos 48 h a 37 °C y 5% de CO₂, antes de examinar la presencia de CPE/GFP o realizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA).
      NOTA: En estas condiciones de cultivo, el CPE es evidente después de 10 h (Figura 7A-D), aumentando durante las próximas 24 h (Figura 7E-H). La placa se puede incubar más tiempo para mejorar la intensidad de CPE si se puntúa por GFP o CPE.
      1. Si puntúa por CPE o GFP y NO realiza IFA, vaya al paso 3.3.18.1.
   6. Si realiza IFA, enjuague las células dos veces con 100 μL de 1x PBS.
   7. Agregue 100 μL de paraformaldehído al 4% diluido en PBS a cada pozo e incube durante 15 min a temperatura ambiente.
   8. Lave las células 3x 5 min cada una con 100 μL de 1x PBS, 0.1% Tween 20 (0.1% PBS-T).
   9. Permeabilizar las células mediante la adición de 100 μL de NP-40 al 0,1% en PBS e incubarlas a temperatura ambiente durante 10 min.
   10. Lavar las células 3x 5 min con 100 μL de PBS-T al 0,1%.
   11. Añadir 100 μL de tampón de bloqueo compuesto por suero de cabra normal al 5% (V/V) diluido en PBS-T al 0,1% durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
   12. Añadir 100 μL por pocillo de anticuerpo primario anti-RIBonucleoproteína anti-VEN de ratón diluido en PBS-T al 0,1% a 1 μg/ml, incubando durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
   13. Lavar las células 3x durante 5 min en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
   14. Añadir 100 μL de un anticuerpo secundario anti-ratón AlexaFluor 488 Goat diluido en PBS-T al 0,1% a 2 μg/mL. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
   15. Lavar las células 3x durante 5 min en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
   16. Después del lavado final, deje las células en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
   17. Tome imágenes de los pozos con un microscopio fluorescente invertido.
   18. Al realizar IFA, busque una fluorescencia mayor que la observada en los pozos de control negativos, lo que indica que el pozo es positivo para el VEN como se muestra en la Figura 8.
       1. Busque la presencia de sincitia y células grandes y redondeadas que caracterizan el CPE del VEN. Si puntúa los pozos infectados con un virus que expresa GFP, busque la presencia de GFP.
   19. Introduzca la información adecuada en la calculadora de títulos spearman-Karber²⁶ para determinar la PFU/ml del virus (Tabla 2). Consulte la Figura 6 para ver un ejemplo de placa de título TCID₅₀ .
4. Cuantificación del título viral por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
   NOTA: Se recomienda un kit de qRT-PCR de un solo paso para ahorrar tiempo y reducir la manipulación de las muestras. Se utiliza un ensayo basado en sonda para aumentar la especificidad de la detección de secuencias de virus.
   1. Cree una curva estándar de una cantidad conocida de las secuencias de virus (Figura suplementaria S2A, B).
      NOTA: Esto se puede hacer comprando un fragmento sintético de ADN de doble cadena de 500 pb del gen L del VEN. La secuencia de un fragmento de 500 pb del gen L del VEN se puede ver en la Figura Suplementaria S2C.
   2. Convierta la cantidad del fragmento de ADN del virus (generalmente proporcionado como nanogramos o femtomoles por los fabricantes) al número de moléculas o copias del fragmento de ADN utilizando el número de Avogadro y la fórmula de lunares a moléculas (Eq (1)).
      (1)
   3. Prepare las muestras de la curva estándar preparando una serie de dilución de diez veces de copias de fragmentos de ADN de virus conocidos, a partir de 1.00 ×^{10 10} copias hasta 1.00 × 10⁰ copias.
   4. Para determinar la cantidad de ARN del VEN en muestras desconocidas, extraiga el ARN del VEN utilizando un kit de extracción de ARN. Siga el protocolo proporcionado con el kit. Una vez extraído el ARN, continúe con el protocolo recomendado proporcionado en el kit de qRT-PCR de un solo paso.
   5. Ejecute las reacciones en un instrumento de PCR en tiempo real con las siguientes condiciones de temperatura y ciclo: 1) un ciclo de transcripción inversa a 55 °C durante 10 min; 2) un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; y 3) 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s), extensión (60 °C durante 30 s) y adquisición de señal fluorescente.
   6. Una vez completado el ensayo qRT-PCR, genere la curva estándar basada en las muestras de la curva estándar utilizando el software del instrumento pcr en tiempo real (Figura suplementaria S2A, B).
      NOTA: El software también calculará la cantidad de ARN del VEN en muestras desconocidas en función de la curva estándar.
5. Ensayos de seguridad para toxicidad aguda en ratones
   1. Inyecte 1 × 10⁸ PFU del virus por vía intravenosa a través de la vena de la cola en tres ratones BALB/C de 8 semanas de edad para evaluar la toxicidad aguda.
   2. Monitoree a los ratones para detectar eventos adversos como pérdida de peso (>20%), postura encorvada, pelajes con volantes, letargo y cambios en la respiración. Evaluar de tres a cuatro veces al día durante las primeras 48 h. Como los ratones deben comenzar a recuperarse después de 48 h, monitoréelos una o dos veces al día hasta que se recuperen por completo.
      1. Administrar solución salina por vía subcutánea y cuidados de apoyo según sea necesario. Por ejemplo, complemente con gel de dieta de recuperación, mantequilla de maní o use discos de calor. Sacrificar ratones que han alcanzado los criterios de punto final, según lo descrito por las pautas institucionales de cuidado animal, por sobredosis de isoflurano seguida de dislocación cervical.

Resultados

Recolección de líquido alantoico
Como el líquido alantoico se cosecha de huevos de gallina embrionados, debe parecer claro y transparente. Si el fluido aparece opaco y amarillo, esto indica la presencia de contaminantes. La inclusión de este fluido alantoico durante la purificación impedirá el proceso de purificación, ya que la presión aumentará rápidamente y superará los 10 psi, lo que resultará en el cizallamiento del virus y la pérdida del virus infeccioso. El líquido alantoico que pa...

Discusión

Los virus utilizados como agentes terapéuticos en estudios preclínicos deben ser altamente purificados para evitar toxicidad cuando se administran in vivo¹⁵. Si no se eliminan los agentes adventicios o contaminantes, esto puede conducir a reacciones adversas graves que nieguen el efecto terapéutico del agente viral²⁸. Como el VEN se produce en huevos de gallina embrionados, existen varias proteínas contaminantes del huevo, como la ovoalbúmina, que deben elimin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	HyClone	SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe	BD	309659
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	302995
10% Povidone Iodine Solution	LORIS	109-08
15 mL Conical Tubes	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle	BD	305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle	BD	305196
25 G x 5/8 in Needle	BD	305122
2-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher	03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1	BioRad	1610158
4% Paraformaldehyde-PBS	Thermo-Fisher	J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe	BD	309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom	Greiner Bio One	655180
Acetic Acid, Glacial	Thermo-Fisher	A38-212
Agarose	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 Centrifuge	Beckman Coulter	B08861
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Bleach (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate Cassette Holder	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
CO2 Incubator	Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259	Thermo-Fisher	BP101-50
DF1 Cells	ATCC	CRL-12203
Diet Gel Recovery	ClearH2O, INC	72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Egg Candler	Berry Hill	A46
Ethanol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O	Thermo-Fisher	BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Fetal Bovine Serum	Gibco	12483-020
Fine Point High Precision Forceps	Thermo-Fisher	22-327379
Fluorescent Microscope	ZEISS AXIO		Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5	LABCONCO
GiBOX Gel Imager	Syngene		Imaging of Agarose Gels
Glycerol	Thermo-Fisher	G33-1
Glycine	Thermo-Fisher	BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit	Thermo-Fisher	4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium	Cytiva	SH30022.01
Humidity Kit	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	RK-07522-20	Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler	Eppendorf	EP950040025
Methanol	Thermo-Fisher	A412-4
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU	SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV	Novus Biologicals	NBP2-11633	Clone 6H12
Normal Goat Serum	Abcam	AB7481
NP-40	Thermo-Fisher	85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K	PALL	OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System	Thermo-Fisher	B1A
PBS 10X Solution	Thermo-Fisher	BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
PowePac 300	BioRad		Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
RedSafe	Thermo-Fisher	50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Sodium Dodecyl Sulfate	Thermo-Fisher	BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets)	Thermo-Fisher	S318-10
Specific pathogen free eggs	CFIA	NA	Supplier will vary depending on location
Sucrose	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 Depth Filter	PALL	SC050V100P
Surgical Scissors	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti Rotor	Beckman Coulter	331362	Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor	Beckman Coulter	369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes	Beckman Coulter	359472
TEMED	Invitrogen	15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
Tris Base	Thermo-Fisher	BP152-5
Tubing Screw Clamp	PALL	88216
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-1L
Utility Pressure Gauges	Cole-Parmer	68355-06