Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Özet

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak > 6 × 10⁹ plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Özet

Kuş ortoavulavirüs serotip-1 olarak da bilinen Newcastle hastalığı virüsü (NDV), hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı olarak geliştirilmiş negatif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür. NDV, iyi kurulmuş ters genetik sistemi, güçlü immünostimülatör özellikleri ve mükemmel güvenlik profili nedeniyle çekici bir terapötik ve profilaktik ajandır. Onkolitik bir virüs veya viral vektörlü bir aşı olarak uygulandığında, NDV, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kollarını aktive eden sağlam bir antitümör veya antijene özgü bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır.

Bu arzu edilen özellikler göz önüne alındığında, NDV çok sayıda klinik çalışmada değerlendirilmiştir ve en iyi çalışılmış onkolitik virüslerden biridir. Şu anda, NDV'yi içeren iki kayıtlı klinik çalışma vardır: biri SARS-CoV-2 (NCT04871737) için rekombinant NDV vektörlü bir aşıyı değerlendirirken, ikincisi bir antiPD-L1 antikoru (NCT04613492) olan Durvalumab ile kombinasyon halinde Interlökin-12'yi kodlayan bir rekombinant NDV'yi değerlendirmektedir. Bu son derece umut verici viral vektörün daha da ilerlemesini kolaylaştırmak için, yüksek titreli, in vivo dereceli, rekombinant NDV (rNDV) üretmek için basitleştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.

Bu yazıda, belirtilen patojensiz (SPF) embriyonlanmış tavuk yumurtalarında rNDV'nin güçlendirilmesi ve rNDV'nin allantoik sıvıdan arındırılması için ayrıntılı bir prosedür açıklanmakta ve saflaştırma sırasında kaybı azaltmak için iyileştirmeler yapılmaktadır. Ayrıca, kirletici madde eksikliğini ve virüs bütünlüğünü doğrulamak için yapılması gereken önerilen kalite kontrol tahlillerinin açıklamaları da dahildir. Genel olarak, bu ayrıntılı prosedür, klinik öncesi çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek titreli, in vivo-grade, rekombinant, lentojenik ve mezojenik NDV'nin sentezini, saflaştırılmasını ve depolanmasını sağlar.

Giriş

Avian Orthoavulavirus-1 olarak da bilinen Newcastle Hastalığı Virüsü, hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı 1,2,3,4,5,6,7 olarak kullanılma potansiyeline sahip zarflı bir kuş paramiksovirüsüdür. Son zamanlarda, SARS-CoV-2'nin başak proteinini ifade etmek için tasarlanan NDV, fare ve hamster meydan okuma modelleri 7,8,9'da etkili bir burun içi aşı olarak karakterize edilmiştir. Bir kanser immünoterapisi olarak kullanıldığında, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle doğal öldürücü hücrelerin, tip I interferon üretiminin ve antitümöre özgü T hücrelerinin^10,11,12,13 üretilmesinin işe alınmasıyla sonuçlanır. Bu güçlü immünostimülatör özelliklere ek olarak, NDV güçlü bir güvenlik profiline ve iyi kurulmuş bir ters genetik sisteme sahiptir^14,15. Bu arzu edilen özellikler, çok sayıda klinik öncesi ve insan klinik çalışmasında NDV'nin değerlendirilmesini sağlamıştır (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Bu son derece umut verici, bağışıklık uyarıcı viral vektörü daha da ilerletmek için, in vivo olarak güvenle uygulanabilen yüksek titreli, ultra saf NDV'nin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı yöntemlere ihtiyaç vardır.

NDV bir kuş paramiksovirüsü olduğundan, embriyonlanmış tavuk yumurtasında en sık çoğaltılır. NDV'yi yaymak için hücre bazlı sistemler mevcut olsa da, çoğu embriyonlanmış tavuk yumurtasında elde edilene benzer titreler üretememiştir¹⁸. Bununla birlikte, yumurta bazlı üretimin uzun olması ve kolayca ölçeklendirilememesi, büyük miktarlarda SPF tavuk yumurtası tedarik edilmesinin sorunlu olabileceği ve yumurta alerjenleri ile kontaminasyon potansiyelinin bulunması da dahil olmak üzere yumurtalarda NDV üretmenin bazı dezavantajları vardır^13,18,19,20 . Son zamanlarda, bir grup, serumsuz ortamda süspansiyonda yetiştirilen Vero hücrelerinin, NDV'nin saflaştırma^21'den önce yumurtalarda elde edilenlerle karşılaştırılabilir titrelere replikasyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu, virüsü Vero hücrelerine adapte etmek için virüsün seri geçişini gerektiriyordu ve NDV'yi süspansiyon Vero hücrelerinden arındırmak için bir yöntemin optimizasyonu hala gereklidir²¹.

Daha önce de vurgulandığı gibi, yüksek titreli, in vivo dereceli virüsü arındırmak için kullanılan yöntemler, soru^22'deki virüse bağlı olarak değişir. Rekombinant NDV'nin üretimi için iyi kurulmuş bir ters genetik sistemi mevcuttur. Bir cDNA klonu, yardımcı plazmidler ve T7 RNA polimerazı eksprese eden bir yardımcı virüsün kullanımını içeren bu süreç, daha önce^{ayrıntılı olarak 15,23} olarak tanımlanmıştır. Bu protokol lentojenik veya mezojenik NDV'ye uygulanabilir. Bu protokolde tanımlanan virüs, viral P ve M genleri arasına yerleştirilen denizanası Aequorea victoria'dan gelen yeşil floresan proteinini (GFP) bireysel bir transkripsiyon birimi olarak kodlayan rekombinant bir mezojenik NDV'dir, çünkü bu daha önce yabancı transgen yerleştirme²⁴ için en uygun yer olarak tanımlanmıştır.

Kapalı yöntemler, NDV'nin saflaştırılmasını, 100 ila 500 nm arasında değişen boyutuna ve yoğunluğuna¹⁵ göre özetlemektedir. Bu, yumurtaların alındığı andan itibaren son bir titreye sahip olmaya kadar yaklaşık 3 hafta içinde in vivo dereceli, yüksek titreli NDV stoklarının üretilmesine izin vermiştir. Teğetsel akış filtrasyonu, derinlik filtrasyonu ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gibi yumurta bazlı virüslerin büyük ölçekli üretiminde sıklıkla kullanılan teknikler tanımlanmıştır ve bu yöntemlerin daha büyük ölçekli üretime çevrilmesini sağlar. NDV'nin saflaştırılması için daha önce tarif edilen teknikler, virüs stabilize edici bir tamponun dahil edilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme sırasında iyodiksantal kullanımı ve in vivo-grade kalite^15'i sağlamak için çeşitli kalite kontrol önlemlerinin tanımlanması ile geliştirilmiştir. Bu, 0,8 ila 1,0 L allantoik sıvıdan 3 × 10¹⁰ PFU / mL'ye kadar ulaşan titrelere ulaşan in vivo dereceli NDV'nin saflaştırılmasına izin vermiştir.

Protokol

Hayvanların kullanımını içeren tüm çalışmalar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'ne uygun olarak Guelph Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm çalışmalar, mezojenik NDV'nin Risk Grubu 2 Patojeni olduğu Kanada'daki bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. NDV'nin amplifikasyonu ve saflaştırılmasında yer alan tüm adımlar, güvenlik ve sterilite amacıyla bir Tip IIA biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

1. Belirtilen patojensiz embriyonlanmış tavuk yumurtası kullanılarak NDV'nin amplifikasyonu

1. SPF embriyonlanmış tavuk yumurtasının aşılanması
   NOT: Tipik olarak, sekiz düzine SPF embriyonlanmış tavuk yumurtası, bir in vivo dereceli NDV partisi oluşturmak için kullanılır. Nakliye sırasındaki hasarı ve canlılıktaki değişkenliği hesaba katmak için bir veya iki düzine ekstra yumurta sipariş edin. Embriyonlanmış tavuk yumurtası biyolojik materyaldir ve kurumsal kılavuzlara göre ele alınmalıdır. Ancak embriyolar yumurtadan çıkmadığı için kurumsal Hayvan Bakım Komitesi onayı gerekli değildir.
   1. SPF embriyone tavuk yumurtası aldıktan sonra, 37 ° C'de bir yumurta inkübatöründe inkübe edin, 9 gün boyunca% 60 nem. Kuluçka makinesinin yumurtaları her saat otomatik olarak sallayacak/döndürecek şekilde ayarlandığından emin olun.
      NOT: Yumurtalar oda sıcaklığında 24 saate kadar veya 4 °C'de 72 saate kadar saklanabilir; Bununla birlikte, bu embriyo canlılığını azaltabilir.
   2. 8-11 günlük inkübasyondan sonra (ideal olarak 9. günde), embriyo canlılığını belirlemek için yumurtaları mumlayın. Uygulanabilir embriyoların göstergeleri olarak ağ benzeri vaskülatür (Şekil 1A) ve embriyo hareketini arayın. Bu özelliklere sahip olmayan yumurtaları atın (Şekil 1B).
   3. Canlı yumurtalarda, hava kesesi ile embriyo arasındaki arayüzü kurşun kalemle 'X' ile işaretleyin (Şekil 1A). Bu enjeksiyon bölgesinin vaskülatürün delinmesine neden olmayacağından emin olun. İnokulum hazırlanırken işaretli yumurtaları inkübatöre geri koyun.
   4. Tüm SPF embriyonlanmış tavuk yumurtalarını enjekte etmek için gereken virüs miktarını hesaplayın. Her yumurtanın 100 μL'lik bir hacimde 100 PFU virüs aldığından emin olun; Virüsü fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 × 10³ PFU / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin. Virüs uygulamasındaki yanlışlıkları hesaba katmak için inokulumun ekstra% 20'sini hazırlayın.
   5. Antistatik bir mendil kullanarak, işaretli yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol içinde seyreltilmiş% 10'luk bir iyot çözeltisi ile temizleyin. Çözeltinin kuruması için yaklaşık 1-2 dakika bekleyin.
   6. Bir çift steril keskin cımbız kullanarak kabuğu dikkatlice delin. Cımbızları yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde sterilize edin.
   7. 1 mL'lik bir şırınga ve 25 G'lik bir iğne kullanarak, 1.1.4 adımında hazırlanan inokulumun 100 μL'sini koryoallantoik boşluğa enjekte edin (Şekil 1C). İğne ile yumurtaya yaklaşık 90° açıyla yaklaşın. İğneyi koryoallantoik membranın hemen üstüne yerleştirin.
   8. Aşılamayı takiben, delinme bölgesini örtmek ve yumurtaları inkübatöre geri döndürmek için oje kullanın. Sallanma ayarının aşılamadan 24 saat sonrasına kadar AÇIK olduğundan emin olun.
   9. Aşılamadan 24 saat sonra yumurta canlılığını kontrol edin. Vaskülatürü olmayan ölü yumurtaları koryoallantoik membranda ve embriyo hareketinde atın (Şekil 1B).
      NOT: Bu yumurtalar NDV'den değil, aşılama işlemi nedeniyle ölmüştür.
   10. Yumurtaları inkübatöre geri döndürün, allantoik sıvının yumurta proteinleri ile kirlenmesini önlemek için rocker KAPALI konuma gelir.
   11. Ölü yumurtaları tanımlamak için yumurtaları her 12-24 saatte bir 1.1.9 adımında açıklandığı gibi kontrol edin. Otolizi en aza indirmek için aşılamadan 24 saat sonra ölen yumurtaları 4 ° C'ye taşıyın. Allantoik sıvıyı soğuduktan 2-12 saat sonra hasat edin.
   12. Yumurtaları en az 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
       NOT: NDV'nin mezojenik bir suşunu yayıyorsanız, optimum inkübasyon süresi 60-72 saattir, çünkü uzun inkübasyon süreleri allantoik sıvının netliğinin azalması nedeniyle saflaştırma işlemini bozabilir. Bu konu, lentojenik NDV suşlarını çoğaltırken, embriyoyu öldürmek için çok daha uzun sürdükleri için önemli değildir.
   13. Uygun kuluçka döneminden sonra, allantoik sıvıyı toplamadan önce kalan yumurtaları 2-12 saat boyunca 4 ° C'ye taşıyın.
2. NDV içeren allantoik sıvının toplanması
   1. Soğutulmuş yumurtaları biyogüvenlik kabinine taşıyın. Yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol ile temizleyin.
   2. Hava kesesinin bulunduğu yumurtanın apikal tarafını kırmak için steril cımbız ve cerrahi makas kullanın.
   3. Korioallantoik membranı ortaya çıkarmak için kabuğu çıkarın (Şekil 1D).
   4. Membranı dikkatlice delin ve allantoik boşluğu açığa çıkarmak için tekrar soyun (Şekil 1E). Yumurta sarısı kesesinin yanlışlıkla delinmediğinden ve bunun yumurtayı bozacağından emin olun.
   5. Embriyoyu yakalamak ve embriyonik kesesi açmak için künt forseps kullanın.
      NOT: Embriyonik kese içindeki sıvı da NDV içerir.
   6. Embriyoyu forseps ile bastırın ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak allantoik sıvıyı toplayın.
   7. Allantoik sıvıyı buz üzerinde berraklaşana kadar 15 mL konik tüplerde saklayın.
      NOT: Allantoik sıvı sarı ise, yumurta sarısı kesesi tehlikeye girmiştir ve allantoik sıvı atılmalıdır.
   8. Allantoik sıvıyı içeren konik tüpleri 1.500 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   9. Duraklama noktası: Aliquot arıtılmış allantoik sıvıyı 50 mL konik tüplere koyun ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın (örneğin, haftalar ila aylar), virüsü dondurarak çözülmenin sert etkilerinden korumak için sıvıyı% 5'lik bir nihai konsantrasyona kadar sakkaroz ile takviye edin. Alternatif olarak, kısa süreli depolama için (örneğin, 1-3 gün), allantoik sıvıyı sakkaroz (son% 5) veya 3x Mannitol-Lizin (ML) tamponu (% 15 Mannitol,% 3 Lizin; tampon tarifleri için Ek Tablo S1'e bakınız) ile destekleyerek, 4 ° C'de depolamadan önce 1x (% 5 Mannitol,% 1 Lizin) nihai konsantrasyonunu elde edin.

2. NDV'nin allantoik sıvıdan saflaştırılması

1. Allantoik sıvının derinlik filtrasyonu
   1. Arıtılmış allantoik sıvıyı -80 ° C'de saklayın ve saflaştırmadan önceki gece 4 ° C'de çözülür.
   2. Biyolojik bir güvenlik kabininde, boru ve peristaltik pompayı Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
   3. Henüz yapılmadıysa, allantoik sıvıyı 3x ML tampon ile 1x'lik bir son konsantrasyona birleştirin.
   4. Derinlik filtresini takmadan önce, sistemden 50 mL'lik 0,5 M NaOH'yi bir atık kabına geçirerek boruyu sterilize edin.
   5. 100 mL steril, moleküler sınıf suyu sistemden ve atık kabına geçirerek boruyu durulayın.
      NOT: NaOH NDV'yi devre dışı bırakacağından, virüs içeren allantoik sıvıyı vermeden önce hatların yeterince yıkanması önemlidir.
   6. Sistem, içinden 50 mL PBS çalıştırarak, tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurarak sistemi astarlayın.
   7. Boruya 1-3 μM tutma derecesine sahip derinlik filtresi takın ve filtreyi havalandırmak için derinlik filtresinin apikal tarafındaki ikinci kapağı çıkarın. Sistem üzerinden ek 50 mL PBS çalıştırmaya başlayın.
   8. PBS, filtrenin üst kısmındaki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, bağlantı noktasını kapatın ve PBS'yi hatlar boyunca akmaya devam edin.
      NOT: Küçük hava kabarcıkları kabul edilebilir, ancak büyük miktarlarda havanın varlığı, filtrenin adım 2.1.7 ve 2.1.8'de açıklandığı gibi tekrar havalandırılmasını gerektirecektir.
   9. Tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurun.
   10. Atık kabını yeni bir steril toplama kabı ile değiştirin ve derinlik filtresinden allantoik sıvı çalıştırmaya başlayın.
       NOT: Basınç 10 psi'yi geçmemelidir, çünkü bu virüsün kesilmesine neden olur. Basınç, pompanın akış hızını azaltarak veya artırarak manipüle edilebilir. Basınç 10 psi'yi aşmaya başlarsa ve akış hızı daha fazla azaltılamazsa, yeni bir derinlik filtresi kullanılmalıdır. Bu durumda, allantoik sıvı akışına devam etmeden önce 2.1.6-2.1.8 adımları uygulanmalıdır.
   11. Tüm allantoik sıvı filtreden geçtikten sonra, virüs iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için hatlar boyunca 50 mL 1x ML tampon çalıştırın.
   12. Hatlar kuruyana kadar sıvıyı toplayın. Virüsü gece boyunca veya 4 °C'de 36 saate kadar saklayın.
       NOT: Virüs derinlik filtrelendikten sonra, derinlik filtrasyonunu tamamladıktan sonraki 36 saat içinde saflaştırma işlemine devam edin.
   13. Derinlik filtresinin bağlantısını kesin ve 0,5 M NaOH'de depolamadan önce sistemden 100 mL 0,5 M NaOH, 400 PPM ağartıcı 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış olarak çalıştırarak boruyu sterilize edin.
2. NDV konsantrasyonu için teğetsel akış filtrasyonu
   1. Kasetin bileşenlerini Şekil 3A'da gösterildiği gibi (ve daha önce^{gösterildiği gibi 25}) biyolojik bir güvenlik kabininde monte edin.
      NOT: Manifold ve uç plaka deterjanla yıkanmalı ve kullanımdan önce kurutulmalıdır. Silikon contalar yeniden kullanılabilir ve kasetle birlikte 0,5 M NaOH'de saklanmalıdır.
   2. Teğetsel Akışlı Filtrasyon (TFF) (çapraz akışlı filtreleme olarak da bilinir) sistemini 'açık' bir konformasyonda kurmak (Şekil 3B).
      1. İlk kez bir kaset kullanıyorsanız, TFF kasetini Elüsyon konformasyonuna monte edin ve 100 mL steril, moleküler sınıf su ile yıkayın (Şekil 3C).
      2. Rezervuar tankında sadece 5 mL su kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistem kurulumunu kapalı bir konformasyona değiştirin (Şekil 3D).
      3. Rezervuara 100 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyin ve 30-60 dakika boyunca sistemde döngü yapın.
      4. Akışı duraklatın ve TFF sistemini elüsyon kurulumuna geri döndürerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirmek için akışı sürdürün.
      5. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve sistemi durulamak için 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin.
      6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistemini açık konformasyona yerleştirin (Şekil 3B). Adım 2.2.3 ile devam edin.
   3. Peristaltik pompayı kullanarak sistemden 100 mL 0,5 M NaOH geçirerek kaseti ve boruyu sterilize edin. Kaset bütünlüğünü korumak için basıncın 30 psi'yi geçmediğinden emin olun.
   4. Rezervuarda yaklaşık 5 mL 0,5 M NaOH kaldığında pompayı duraklatın.
   5. Rezervuara 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin ve sıvıyı kasetten geçirmeye devam edin. Virüsün inaktivasyonunu önlemek için tüm NaOH'yi rezervuarın yanlarından yıkamak için rezervuarı döndürün. Rezervuar yıkama adımını tekrarlayın.
   6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL steril, moleküler sınıf su kaldığında, pompayı duraklatın.
   7. Rezervuara 100 mL PBS ekleyin, steril, moleküler sınıf suyun yanlardan yıkanmasını sağlamak için döner. Kasetten sıvı akışını sürdürün.
   8. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın, rezervuara derinlik filtreli allantoik sıvı ekleyin ve pompa akışına devam edin.
   9. Virüsün kesilmesini önlemek için 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) izleyin. Peristaltik pompanın hızının bir kombinasyonunu kullanın ve atıklara elüsyonu artırmak için C-kelepçelerinin kullanın.
      NOT: Peristaltik pompanın ve C-kelepçelerinin hızının birleştirilmesi, basıncın artmasına neden olacaktır.
   10. Rezervuarda 50-100 mL allantoik sıvı kaldığında, 150-200mL 1x ML tampon ekleyerek tampon değişimi gerçekleştirmek için pompayı duraklatın.
   11. Pompa akışını sürdürün, 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) tekrar izleyin.
   12. Rezervuarda 5-10 mL kaldığında, pompayı duraklatın.
   13. İki C-kelepçesi kullanarak, Şekil 3C'de gösterildiği gibi iki atık çizgisini kapatın.
   14. Rezervuarı besleyen retentat hattını ayırın ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin (Şekil 3C).
   15. Pompanın akışını sürdürün, rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında duraklayın.
   16. C-kelepçelerini atık hatlarından çıkarın ve retentat besleme hattını rezervuar tankına yeniden takın (Şekil 3B).
   17. 20-25 mL 1x ML tampon ekleyin ve rezervuar tankında yaklaşık 5 mL kalana kadar pompa akışını sürdürün.
   18. 2.2.13 ile 2.2.16 arasındaki adımları yineleyin.
       NOT: Virüs verimini artırmak için 2.2.17 ve 2.2.13 ila 2.2.16 arasındaki adımlar tekrarlanarak 3^. bir elüsyon yapılabilir. Bununla birlikte, virüsün çoğu ilk iki salınımda bulunur.
   19. Salınımları bitirdikten sonra, virüsü buzun üzerine veya 4 ° C'ye yerleştirin.
   20. Hatları temizlemek için, sistemi, Şekil 3B'de gösterildiği gibi atık çizgileri rezervuara geri beslenen kapalı döngü formatı ( Şekil 3D) olacak şekilde ayarlayın.
   21. 250 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyerek sistemi temizlemeye devam edin.
   22. Temizleme solüsyonunu gece boyunca sistemden geçirin.
       NOT: Temizleme solüsyonu yeniden sirküle edilirken, pompa 50 mL/dak hızda çalıştırılırsa, yaklaşık 5 psi'lik bir basınç gözlenmelidir. Basınç bunu aşarsa, kaset kirlidir ve temizleme çözeltisi değiştirilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.
   23. Hem atık hatlarını hem de retentate hattını bir atık konteynerine yönlendirerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirin.
   24. Rezervuara 400-500 mL steril su ekleyin ve sistemden ve atık kaplarına akıtın.
   25. Rezervuarda yaklaşık 5 mL bırakıldığında, pompayı duraklatın ve rezervuar kabına 100-200 mL 0,5 M NaOH ekleyin ve rezervuar kabını yıkamak için çözeltiyi döndürün.
   26. Rezervuar neredeyse boşaldığında, adım 2.2.23'ü iki kez daha tekrarlayın.
   27. TFF kurulumunu sökün, TFF kasetini ve contalarını 0,5 M NaOH'luk küçük bir hacimde 4 °C'de yeniden kapatılabilir bir plastik torbada saklayın.
       NOT: Borular 0,5 M NaOH'ye batırılmış oda sıcaklığında saklanabilir.
3. İyodiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme
   1. Ultra santrifüjü açın ve 4 ° C'ye kadar ön soğumaya ayarlayın. İstenilen rotoru da 4 °C'de önceden soğutun ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Rotorlar 4 °C'de saklanmalıdır.
   2. PBS ve 3x ML Tamponu ile 1x nihai ML tampon konsantrasyonuna seyrelterek% 40,% 20 ve% 10 iyodiksanol çözeltisi üretmek için% 60 iyodiksanol çözeltisini (satın alma sırasındaki konsantrasyon) kullanın.
   3. 13,2 mL'lik bir üstte, üstü açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünde, sırasıyla %40, %20 ve %10 iyodiksananol çözeltilerinin 0,5 mL, 2,5 mL ve 2,5 mL'sini kaplayın (Şekil 4A).
      NOT: Ultra santrifüj tüpünün yan tarafına yatırılması ve çözeltinin yavaşça dışarı atılması, iki gradyan katmanının karıştırılması riskini önemli ölçüde azaltacaktır. Her katmanın ayrılması, gradyanın her katmanı arasında görülebilen bir "hale" ile belirgin olmalıdır.
   4. Çeşitli degrade katmanlarının arabirimlerini işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
   5. TFF prosedüründen salınan virüsün 6-6.5 mL tabakası yoğunluk gradyanı üzerinden. Yoğunluk gradyanını bozmamak için virüsü adım 2.3.3'te açıklandığı gibi dikkatlice ekleyin.
   6. Ultra santrifüj tüplerini, uçları birbirlerinden 0,01 g uzakta dengelemek için üstü açık bir kantar kullanarak sallanan kova rotorunun kesici uçlarına yükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ağırlık farklılıklarını hesaba katmak için PBS veya ekstra virüs temizleyici kullanın.
   7. Borular dengelendikten sonra, tüpleri kapatın ve rotora yükleyin.
   8. 4 °C'de 125.000 × g'de 1,5 saat santrifüj.
      NOT: Bu, gecikmeli başlatma özelliğine sahip bir ultrasantrifüj mevcutsa gece boyunca gerçekleştirilebilir.
   9. Ultra santrifüjlemeyi takiben, bir çift steril forseps kullanarak tüpleri çıkarın. %10 ile %20 gradyanları arasındaki hedef bandı (büyük bir bant) arayın (Şekil 4B).
   10. Bir imbikli stand kullanarak tüpü bir beherin üstüne asın.
   11. 5 mL'lik bir şırıngaya 18 G x 1,5 inçlik bir iğne takın ve ultrasantrifüj tüpünün yan tarafını delin.
       NOT: Tüp, hedef bandın biraz altında, iğne yukarı doğru açılı olacak şekilde delinmeli ve hedef banda girecek şekilde yukarı doğru eğimlendirilmelidir.
   12. Hedef bandı çıkarmak için pistonu yavaşça uzatın.
       NOT: Çıkarılan virüsü en üst düzeye çıkarmak için iğneyi hedef bant içinde hareket ettirin. Diğer bantların veya kalıntıların hedef bantla karışmamasına dikkat edin ve fazla diyaliz kasetinin kullanılmasına yol açacağından fazla çözelti almaktan kaçının.
   13. Hedef bant çıkarıldıktan sonra, iğneyi çıkarın ve kalan çözeltinin atık kabına akmasına izin verin. Hedef bandı, diğer tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm bantlar çıkarılana kadar 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
   14. Tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm hedef bantlar çıkarılana kadar 2.3.10-2.3.13 adımlarını tekrarlayın.
   15. 2.3.10 ila 2.3.13 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi hedef bantları ayıklamaya alternatif yaklaşım
       1. Hedef bandı kaplayan sıvıyı pipet kullanarak yavaşça çıkarın. Hedef banda ulaştıktan sonra, bir pipet kullanarak çıkarın ve virüsü 50 mL'lik bir konik tüpte saklayın.
          NOT: Bu, ultrasantrifüj tüplerinin yeniden kullanılmasına izin verir.
4. İyodiksanolün virüs çözeltisinden uzaklaştırılması
   NOT: NDV içeren bant,% 15 ila% 16 arasında bir iyodiksanol yoğunluğunda görünür. Çözeltideki iyotiksanol konsantrasyonu, standart bir eğriye atıfta bulunarak 340 nm'de absorbans ölçülerek belirlenebilir (Ek Şekil S1). Bu konsantrasyondaki iyodiksanol çözeltileri C57BL / 6 farelere uygulandığında herhangi bir yan etki veya akut toksisite gözlenmediği için bu adım atlanabilir.
   1. 0,5-3 mL 10 kDa molekül ağırlıklı kesilmiş diyaliz kasetini PBS'ye 1 dakika batırarak önceden ıslatın.
      NOT: Diyaliz zarı pürüzsüzden fırfırlı veya engebeli bir görünüme sahip olmalıdır. Ekstrakte edilen virüsün hacmi 10 mL'yi aşarsa, iki adet 0.5-3 mL diyaliz kaseti veya 5-12 mL'lik bir diyaliz kaseti kullanılmalıdır.
   2. Uygun olduğunda, virüsü 50 mL konik tüpten toplamak için 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanın.
   3. Diyaliz kasetine girmek için şırıngayı kullanın, zarı delmemeye dikkat edin ve virüsü enjekte edin.
      NOT: Diyaliz kaseti, kasetteki hava cebinin konumunu değiştirmek için döndürülebilir. İğneyi kasetten çıkarmadan önce hava cebi çıkarılmalıdır.
   4. 1 L'lik bir beheri steril 1x PBS ile doldurun, içine bir karıştırma çubuğu ve diyaliz kaseti yerleştirin ve örtün. Hafifçe karıştırarak 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Diyaliz kasetini PBS'de yüzecek şekilde takmak için ekstrüde polistiren köpük ve elastik bir bant kullanın. Kaset, ML arabelleği nedeniyle hafifçe şişebilir.
   5. 1-2 saat sonra, taze 1x PBS ile değiştirin ve hafif karıştırma ile 8-10 saat daha 4 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
      NOT: Bu bir gecede de yapılabilir.
   6. Bir kez daha taze 1x PBS ile değiştirin, oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
5. Virüs çözeltisinin konsantrasyonu
   1. Diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın (Şekil 4C) ve küçük, kapatılabilir plastik bir torbaya koyun. Diyaliz kasetinin tamamen suya batırılması için 15-25 mL% 40 20.000 MW polietilen glikol ekleyin.
   2. Sallanma ile oda sıcaklığında inkübe edin. 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanarak kasetteki virüs hacmini periyodik olarak kontrol edin.
      NOT: Virüsü konsantre etmek için gereken süre, başlangıç hacmine ve istenen bitiş hacmine bağlı olarak değişecektir. Tipik olarak, istenen son hacim, allantoik sıvının başlangıç hacminden bağımsız olarak 1 ila 1,5 mL arasındadır. Hacmi kontrol ederken, aynı portu kullanmamaya dikkat edin, çünkü bu port bütünlüğünü tehlikeye atar ve polietilen glikol çözeltisi ile virüsün karışmasına neden olabilir.
   3. Konsantre virüsü diyaliz kasetinden çıkarmadan önce, kaseti 1x PBS'de kısaca durulayın ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesini hava ile doldurun.
   4. Hava dolu şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu bastırın. Aparatı döndürün, böylece konsantre virüs, verilen havanın hiçbirini çıkarmadan çıkarılabilir.
   5. Konsantre virüsü, dağıtılan hacme dikkat ederek 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
   6. Aynı şırıngayı ve iğneyi kullanarak, diyaliz kasetine uygun miktarda% 60 sakkaroz enjekte edin, böylece daha önce çıkarılan virüsle birleştirildiğinde,% 5'lik bir sakkaroz konsantrasyonunda olur.
   7. Membrana yapışmış olabilecek artık virüsü yerinden çıkarmak için zara masaj yapmak için eldivenli parmaklarınızı kullanın, zarar vermemeye dikkat edin. Yerinden çıkarma işlemini kolaylaştırmak için diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.
   8. Bu yıkamayı zaten 50 mL konik tüpte bulunan virüsle birleştirin.
      NOT: Virüs şu anda% 5 sakkarozdadır ve 20 μL, 50 μL, 100 μL veya 200 μL alikotlara dağıtılmaya ve -80 ° C'de saklanmaya hazırdır. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için, NDV liyofilize edilebilir ve bölüm 2.6'da açıklandığı gibi 4 ° C'de saklanabilir.
6. NDV'nin liyofilizasyonu
   1. 16 saat boyunca 44 × 10-3 MBAR ve ^- 52 °C'de 1.5 mL santrifüj tüplerinde veya 15 mL konik tüplerde aliquoted edilen virüsü liyofilize edin.
   2. Liyofilize numuneleri viral titrede önemli bir azalma olmadan 4 ° C'de saklayın.

3. Kalite kontrol tahlilleri

1. Genom doğrulaması için viral RNA izolasyonu ve ters transkripsiyon PCR
   1. 20 μL virüs aliquot'u çözün. Kit ile birlikte verilen viral RNA izolasyon protokolünü takip edin.
   2. İzole RNA'yı derhal ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) için bir şablon olarak kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
   3. Ters transkripsiyon reaksiyonlarını, üretici tarafından sağlanan protokolde açıklandığı gibi hazırlayın.
   4. NDV patotipini (Tablo 1, F protein primer seti) ve gerekli gen kontrol elemanlarının varlığını (Tablo 1, Transgen primer seti) doğrulamak için elde edilen cDNA'yı çeşitli kalite kontrol PCR reaksiyonları için bir şablon olarak kullanın.
      NOT: Astarlar, yayılan NDV suşuna göre tasarlanmalıdır.
      1. Patotipin ana belirleyicisi olan F proteini bölünme bölgesini sıralamak için F proteini primer setini kullanın (Tablo 1). 435 baz çifti uzunluğunda bir PCR ürünü arayın.
         NOT: Burada, primerler NDV'nin LaSota suşuna göre tasarlanmıştır (Genbank katılımı AF077761.1). Optimal transgen ekspresyonunun, P ve M genleri²⁴ arasına yabancı bir transgen yerleştirildiğinde meydana geldiği iyi bilinmektedir.
      2. Transgenin gen başlangıcının ve gen sonu elemanlarının bütünlüğünü doğrulamak için transgen primer setini kullanın. Gen başlangıcını ve gen sonu dizi bütünlüğünü doğrulamak için PCR ürününü sıralayın.
   5. DNA dizilimi için PCR ürünlerini gönderin ve bunları homoloji şablonuyla karşılaştırın.
2. Kirletici proteinleri tespit etmek için SDS PAGE ve Coomassie boyama
   1. İlk olarak% 6 ve% 15 poliakrilamid çözeltileri hazırlayarak bir yoğunluk gradyanı SDS PAGE jeli dökün (Ek Tablo S1). %15'lik çözeltinin 5 mL'sini ve ardından %6'lık çözeltinin 5 mL'sini çekmek için 10 mL'lik bir pipet kullanın.
   2. Pipetleri çözeltiden çıkarın ve kısa bir süre hava çekerek bir hava kabarcığı oluşturun.
      NOT: Hava kabarcığı yukarı doğru hareket ettikçe, bu, SDS PAGE gradyanını oluşturmak için çözümü karıştırır.
   3. Çözeltiyi döküm aparatına dağıtın ve 30 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin.
   4. 20 μL'lik son bir hacimde, bir virüs alikotunu 4x indirgeyici tamponla (Ek Tablo S1) birleştirin, böylece nihai konsantrasyon 1x olur ve bir termosiklusta 95 ° C'de 10 dakika kaynatın. Virüsün en az 1 × 10⁷ PFU'sunu yükleyin.
   5. SDS PAGE'yi çalışan arabelleğe (Ek Tablo S1) batırın ve örnekleri yükleyin.
   6. Jeli 1-1,5 saat boyunca 120 V'ta çalıştırın.
   7. Jeli çalışan tampondan çıkarın ve daha küçük bir kaba aktarın.
   8. Jeli örtmek için Coomassie boyama çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Oda sıcaklığında 4-5 saat inkübe edin.
   9. Boyama çözeltisini çıkarın ve ajitasyonla oda sıcaklığında 4-8 saat inkübe ederek destain çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Destain çözümünü üç ila dört kez değiştirin.
      NOT: Jel berrak olmalı ve rengi lekelenmeden önceki gibi olmalıdır.
   10. Jeli kolorimetrik bir ayarda görüntüleyin. Allantoik sıvı ve saflaştırılmış virüs örnekleri içeren Coomassie boyalı SDS PAGE jelinin temsili bir görüntüsü için Şekil 5'e bakınız.
3. Enfeksiyöz viral titrenin medyan doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID₅₀) ve immünofloresan testi ile nicelleştirilmesi
   NOT: Vero hücreleri DF1 hücrelerine alternatif olarak kullanılabilir; Bununla birlikte, sitopatik etki (CPE) Vero hücrelerinde daha az belirgindir. Bu tahlilde fusojeniteyi artıran L289A mutasyonunu barındıran ve P ve M genleri arasındaki GFP'yi eksprese eden NDV kullanılmaktadır.
   1. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μg / mL tripsin ile desteklenmiş DMEM'i kullanmadan bir gün önce 80 μL'lik bir hacimde 20.000 hücre / kuyucukta 96 kuyucuklu bir DF1 hücresi plakası tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
   2. Ertesi gün, buz üzerinde 20 μL aliquot virüs çözülür.
   3. Seri seyreltmeler hazırlamak için 1,5 mL tüpler kullanın. ^10-2 seyreltme hazırlamak için virüsün 10 μL'sini 990 μL PBS ile seyrelterek başlayın. En az 10-10'a kadar, ⁹⁰⁰ μL PBS ve önceki seyreltmenin 100 μL'sinin eklenmesiyle yapılan diğer tüm seyreltmeleri hazırlayın.
      NOT: Seyreltmeler arasında hareket ederken yeni bir pipet ucu kullanın.
   4. Şekil 6'da gösterildiği gibi 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyusunu enfekte etmek için her seyreltmenin 20 μL'sini kullanın.
      NOT: Her kuyudaki son hacim 100 μL olacaktır.
   5. CPE / GFP varlığını incelemeden veya dolaylı bir immünofloresan testi (IFA) yapmadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de en az 48 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu kültür koşulları altında, CPE 10 saat sonra belirgindir (Şekil 7A-D), sonraki 24 saat boyunca artar (Şekil 7E-H). GFP veya CPE ile puanlama yapılırsa plaka CPE'nin yoğunluğunu artırmak için daha uzun süre inkübe edilebilir.
      1. CPE veya GFP ile puanlama yapılıyorsa ve IFA gerçekleştirmiyorsa, adım 3.3.18.1'e atlayın.
   6. IFA yapıyorsanız, hücreleri 100 μL 1x PBS ile iki kez durulayın.
   7. Her bir oyuğa PBS'de seyreltilmiş 100 μL% 4'lük paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   8. Hücreleri her biri 3x 5 dakika 100 μL 1x PBS,% 0.1 Ara 20 (% 0.1 PBS-T) ile yıkayın.
   9. PBS'de 100 μL% 0.1 NP-40 ilavesiyle hücreleri geçirgenleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
   10. Hücreleri 100 μL% 0.1 PBS-T ile 3x 5 dakika yıkayın.
   11. Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de gece boyunca% 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş % 5 (V / V) normal keçi serumundan oluşan 100 μL bloke tamponu ekleyin.
   12. % 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş birincil fare anti-NDV ribonükleoprotein antikorunun kuyucuğuna 100 μL ilave edilerek 1 μg / mL'ye kadar oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
   13. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   14. %0,1 PBS-T'de seyreltilmiş AlexaFluor 488 Goat fare karşıtı ikincil antikorun 100 μL'sini 2 μg/mL'ye ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   15. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   16. Son yıkamadan sonra, hücreleri% 0.1 PBS-T'nin 100 μL'sinde bırakın.
   17. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucukları görüntüleyin.
   18. IFA yaparken, negatif kontrol kuyularında görülenden daha büyük floresan arayın, bu da kuyunun Şekil 8'de gösterildiği gibi NDV için pozitif olduğunu gösterir.
       1. NDV CPE'yi karakterize eden sinsiti ve büyük, yuvarlak hücrelerin varlığını arayın. GFP'yi ifade eden bir virüsle enfekte olmuş skorlama kuyuları varsa, GFP'nin varlığını arayın.
   19. Virüsün PFU/mL'sini belirlemek için Spearman-Karber titre hesaplayıcısı^26'ya uygun bilgileri girin (Tablo 2). Örnek TCID₅₀ titre plakası için Şekil 6'ya bakın.
4. Viral titrenin kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile ölçülmesi
   NOT: Zamandan tasarruf etmek ve numunelerin manipülasyonunu azaltmak için tek adımlı bir qRT-PCR kiti önerilir. Prob tabanlı bir tahlil, virüs dizileri için algılamanın özgüllüğünü arttırmak için kullanılır.
   1. Virüs dizilerinin bilinen bir miktarının standart bir eğrisini oluşturun (Ek Şekil S2A,B).
      NOT: Bu, NDV L geninin sentetik 500 bp çift sarmallı DNA fragmanı satın alınarak yapılabilir. NDV L geninin 500 bp fragmanının dizisi Ek Şekil S2C'de görülebilir.
   2. Virüs DNA fragmanının miktarını (genellikle üreticiler tarafından nanogram veya femtomol olarak sağlanır), Avogadro'nun sayısını ve molleri molekül formülüne (Eq (1)) kullanarak DNA fragmanının molekül sayısına veya kopyalarına dönüştürün.
      (1)
   3. 1.00'den başlayarak 10.00 kopyadan başlayarak 10.00 × 10^{0 kopyaya} ×kadar bilinen virüs DNA fragmanı kopyalarının on kat seyreltme serisini hazırlayarak standart eğri örneklerini hazırlayın.
   4. Bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını belirlemek için, bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak NDV RNA'yı ekstrakte edin. Kitle birlikte verilen protokolü izleyin. RNA ekstrakte edildikten sonra, tek adımlı qRT-PCR kitinde sağlanan önerilen protokolle devam edin.
   5. Reaksiyonları aşağıdaki sıcaklık ve döngü koşullarına sahip gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırın: 1) 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir ters transkripsiyon döngüsü; 2) 1 dakika boyunca 95 ° C'de bir başlangıç denatürasyon döngüsü; ve 3) 40 döngü denatürasyon (10 s için 95 ° C), uzatma (30 s için 60 ° C) ve floresan sinyal alımı.
   6. qRT-PCR testi tamamlandıktan sonra, gerçek zamanlı PCR cihazı yazılımını kullanarak standart eğri örneklerine dayalı standart eğriyi oluşturun (Ek Şekil S2A, B).
      NOT: Yazılım ayrıca standart eğriye dayanarak bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını da hesaplayacaktır.
5. Farelerde akut toksisite için güvenlik testi
   1. Akut toksisiteyi değerlendirmek için 1 × 10 8 PFU virüsü kuyruk damarı yoluyla intravenöz olarak üç⁸ haftalık BALB / C faresine enjekte edin.
   2. Fareleri kilo kaybı (% >20), kambur duruş, karıştırılmış paltolar, uyuşukluk ve solunumdaki değişiklikler gibi olumsuz olaylar açısından izleyin. İlk 48 saat boyunca günde üç ila dört kez değerlendirin. Farelerin 48 saat sonra iyileşmeye başlaması gerektiğinden, tamamen iyileşene kadar günde bir ila iki kez izleyin.
      1. Gerektiğinde salini deri altından ve destekleyici bakımdan uygulayın. Örneğin, geri kazanım diyet jeli, fıstık ezmesi ile takviye edin veya ısı pucks kullanın. Hayvan bakımı kurumsal kılavuzlarında belirtildiği gibi, son nokta kriterlerine ulaşmış ötenazi fareleri, izofluran doz aşımı ve ardından servikal çıkık ile takip eder.

Sonuçlar

Allantoik sıvı hasadı
Allantoik sıvı embriyonlanmış tavuk yumurtasından toplandığından, net ve şeffaf görünmelidir. Sıvı opak ve sarı görünüyorsa, bu kirleticilerin varlığını gösterir. Saflaştırma sırasında bu allantoik sıvının dahil edilmesi, basınç, virüsün kesilmesine ve bulaşıcı virüsün kaybına neden olacak şekilde hızla yükselip 10 psi'yi geçeceğinden, saflaştırma işlemini engelleyecektir. Kanlı görünen allantoik sıvı, yumurtaların çok fazl...

Tartışmalar

Preklinik çalışmalarda terapötik ajanlar olarak kullanılan virüsler, in vivo¹⁵ uygulandığında toksisiteyi önlemek için yüksek oranda saflaştırılmalıdır. Maceracı ajanlar veya kirleticiler uzaklaştırılmazsa, bu viral ajanın terapötik etkisini reddeden ciddi advers reaksiyonlara yol açabilir²⁸. NDV embriyonlanmış tavuk yumurtasında üretildiğinden, preklinik veya klinik modellerde in vivo kullanılmadan önce çıkarılması gerek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	HyClone	SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe	BD	309659
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	302995
10% Povidone Iodine Solution	LORIS	109-08
15 mL Conical Tubes	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle	BD	305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle	BD	305196
25 G x 5/8 in Needle	BD	305122
2-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher	03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1	BioRad	1610158
4% Paraformaldehyde-PBS	Thermo-Fisher	J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe	BD	309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom	Greiner Bio One	655180
Acetic Acid, Glacial	Thermo-Fisher	A38-212
Agarose	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 Centrifuge	Beckman Coulter	B08861
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Bleach (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate Cassette Holder	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
CO2 Incubator	Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259	Thermo-Fisher	BP101-50
DF1 Cells	ATCC	CRL-12203
Diet Gel Recovery	ClearH2O, INC	72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Egg Candler	Berry Hill	A46
Ethanol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O	Thermo-Fisher	BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Fetal Bovine Serum	Gibco	12483-020
Fine Point High Precision Forceps	Thermo-Fisher	22-327379
Fluorescent Microscope	ZEISS AXIO		Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5	LABCONCO
GiBOX Gel Imager	Syngene		Imaging of Agarose Gels
Glycerol	Thermo-Fisher	G33-1
Glycine	Thermo-Fisher	BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit	Thermo-Fisher	4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium	Cytiva	SH30022.01
Humidity Kit	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	RK-07522-20	Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler	Eppendorf	EP950040025
Methanol	Thermo-Fisher	A412-4
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU	SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV	Novus Biologicals	NBP2-11633	Clone 6H12
Normal Goat Serum	Abcam	AB7481
NP-40	Thermo-Fisher	85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K	PALL	OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System	Thermo-Fisher	B1A
PBS 10X Solution	Thermo-Fisher	BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
PowePac 300	BioRad		Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
RedSafe	Thermo-Fisher	50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Sodium Dodecyl Sulfate	Thermo-Fisher	BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets)	Thermo-Fisher	S318-10
Specific pathogen free eggs	CFIA	NA	Supplier will vary depending on location
Sucrose	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 Depth Filter	PALL	SC050V100P
Surgical Scissors	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti Rotor	Beckman Coulter	331362	Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor	Beckman Coulter	369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes	Beckman Coulter	359472
TEMED	Invitrogen	15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
Tris Base	Thermo-Fisher	BP152-5
Tubing Screw Clamp	PALL	88216
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-1L
Utility Pressure Gauges	Cole-Parmer	68355-06