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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Resumen

Un entorno celular complejo plantea desafíos para el análisis de la motilidad de una sola molécula. Sin embargo, el avance en las técnicas de imagen ha mejorado los estudios de una sola molécula y ha ganado una inmensa popularidad en la detección y comprensión del comportamiento dinámico de las moléculas marcadas con fluorescencia. Aquí, describimos un método detallado para estudios in vitro de moléculas individuales de motores de la familia kinesina-3 utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). La quinesina-3 es una gran familia que desempeña funciones críticas en las funciones celulares y fisiológicas que van desde el transporte de carga intracelular hasta la división celular y el desarrollo. Hemos demostrado previamente que los motores de quinesina-3 dimérica constitutivamente activos exhiben una motilidad rápida y superprocesiva con alta afinidad de microtúbulos a nivel de molécula única utilizando lisados celulares preparados expresando motor en células de mamíferos. Nuestro laboratorio estudia los motores de quinesina-3 y sus mecanismos reguladores utilizando enfoques celulares, bioquímicos y biofísicos, y tales estudios exigen proteínas purificadas a gran escala. La expresión y purificación de estos motores utilizando células de mamíferos sería costosa y llevaría mucho tiempo, mientras que la expresión en un sistema de expresión procariota daría como resultado proteínas significativamente agregadas e inactivas. Para superar las limitaciones planteadas por los sistemas de purificación bacteriana y el lisado de células de mamíferos, hemos establecido un robusto sistema de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores. Los motores de quinesina-3 están marcados C-terminalmente con proteínas fluorescentes de 3-tándem (3xmCitirine o 3xmCit) que proporcionan señales mejoradas y disminución del fotoblanqueo. El análisis de deslizamiento in vitro de moléculas individuales y múltiples motores de proteínas purificadas con Sf9 demuestra que los motores de quinesina-3 son rápidos y superprocesales similares a nuestros estudios previos utilizando lisados de células de mamíferos. Otras aplicaciones que utilizan estos ensayos incluyen el conocimiento detallado de las condiciones de oligómeros de los motores, socios de unión específicos en paralelo a estudios bioquímicos y su estado cinético.

Introducción

Un entorno celular inmensamente abarrotado plantea muchos desafíos en la clasificación de proteínas y moléculas destinadas. Esta intensa carga de trabajo de organización y distribución espaciotemporal de moléculas dentro del citoplasma se ve facilitada por motores moleculares y pistas citoesqueléticas. Los motores moleculares son las enzimas que hidrolizan las monedas de energía como el ATP y utilizan esa energía durante el movimiento y la generación de fuerza1. Según la similitud de la secuencia de aminoácidos, las quinesinas se agrupan en 14 familias y, a pesar de esta similitud, cada motor contribuye de manera única al funcionamiento de una célula. Los motores de la familia Kinesin-3 constituyen uno de los más grandes, comprendiendo cinco subfamilias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 y KIF28)2, asociadas con diversas funciones celulares y fisiológicas, incluyendo transporte de vesículas, señalización, mitosis, migración nuclear y desarrollo 3,4,5. El deterioro en la función de transporte de quinesina-3 implica en muchos trastornos neurodegenerativos, defectos del desarrollo y enfermedades cancerosas 6,7,8,9.

Trabajos recientes han demostrado que los motores de quinesina-3 son monómeros pero sufren dimerización inducida por la carga y dan como resultado una motilidad rápida y superprocesiva en comparación con la quinesinaconvencional 10,11,12,13. Su caracterización bioquímica y biofísica necesita una gran cantidad de proteínas activas purificadas. Sin embargo, su producción en el sistema de expresión procariota resultó en motores inactivos o agregados, presumiblemente debido a la incompatibilidad de la maquinaria de síntesis, plegamiento y modificación de proteínas 14,15,16,17,18. Para eludir tales limitaciones y aumentar el rendimiento, aquí hemos establecido un sistema robusto de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores.

El sistema de expresión de baculovirus utiliza líneas celulares de insectos Sf9 como sistema huésped para la expresión de proteínas recombinantes eucariotas de alto rendimiento 19,20. El baculovirus posee un fuerte promotor de poliedrina que ayuda en la expresión génica heteróloga y en la producción de proteínas recombinantes solubles17. Debido a su costo-efectividad, seguro de manejar y alta cantidad de expresión de proteínas activas, se ha convertido en una poderosa herramienta21. Para expresar una proteína de interés, un paso clave es generar una bacmid recombinante. Dado que los kits de generación de bacmid disponibles comercialmente son caros y trabajaremos con más muestras, desarrollamos un protocolo interno para insertos grandes y pequeños de motores de kinesina-3 en bacmids. Se utilizaron motores de quinesina-3 purificados con SF9 para caracterizar in vitro las propiedades de deslizamiento de microtúbulos de una sola molécula y multimotor utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Los motores están marcados C-terminalmente con moléculas fluorescentes de 3 tándem (3xmCit) para proporcionar una señal mejorada y una disminución del fotoblanqueo. Debido a su mayor relación señal-ruido, menos fototoxicidad e imágenes selectivas de un área muy pequeña cerca del cubreobjetos, las imágenes TIRF se han utilizado ampliamente para visualizar la dinámica de proteínas a nivel de molécula única in vivo e in vitro.

Este estudio discute la purificación de motores de quinesina-3 mediante el empleo del sistema de expresión de baculovirus Sf9 y el análisis in vitro de imágenes de molécula única y deslizamiento multimotor de motores utilizando microscopía TIRF. En conjunto, este estudio muestra que las propiedades de motilidad de los motores purificados Sf9 son idénticas a las de los motores preparados a partir de lisados celulares de mamíferos. Por lo tanto, creemos que el sistema Sf9-baculovirus se puede adaptar para expresar y purificar cualquier proteína motora de interés.

Protocolo

1. Cultivo, transfección y generación de virus Sf9

NOTA: Mantener las células Sf9 en 30 ml de medio Sf-900/SFM en matraz cónico estéril desechable de 100 ml sin antibióticos/antimicóticos a 28 °C. Mantenga el cultivo de suspensión en un agitador orbital a 90 rpm. No se requiere suministro deCO2 ni mantenimiento de la humedad. Las células generalmente se subcultivan cada cuatro días inoculando 0.5 x 10 6 células / ml para alcanzar una densidad de 2.0 x 106 células / ml en el cuarto día.

  1. Generación de existencias de virus P0
    1. Para la transfección, las células de semilla en una placa de 35 mm con una confluencia de 4,5 x 105 células/ml y mantener a 28 °C sin agitar.
    2. Después de 24 h, una vez que las células estén unidas y se vean saludables, proceda a la transfección como se describe a continuación.
      1. Tubo A: Mezcle 1 μg de ADN bacmid que codifica para un motor de kinesina-3 específico KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG con 100 μL de medios de Grace no suplementados.
      2. Tubo B: Mezcle 6 μL de reactivo de transfección con 100 μL de medios de Grace no suplementados.
      3. Transfiera cuidadosamente el contenido del tubo A al tubo B y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 20 veces).
      4. Incubar la mezcla durante ~45 min a temperatura ambiente.
    3. Después de completar la incubación, agregue 0.8 ml de medios de Grace no suplementados a la mezcla anterior y mezcle lentamente con pipeteo.
    4. Aspirar suavemente el medio Sf-900/SFM de las células (para eliminar cualquier rastro de suero que pueda afectar la eficiencia de la transfección).
    5. Añadir la mezcla de transfección del paso 1.1.3 gota a gota en la parte superior de las células e incubar la placa durante 6 h a 28 °C.
    6. Después de la incubación, retirar con cuidado la mezcla de transfección, añadir 2 ml de medio Sf-900/SFM e incubar durante 48 h a 28 °C.
    7. Compruebe la expresión de la proteína motora bajo un microscopio de fluorescencia invertida. La proteína motora se marca con una proteína fluorescente, mCitrine, una variante de la proteína fluorescente amarilla.
      NOTA: Las células transfectadas se visualizaron bajo un microscopio invertido equipado con contraste de interferencia diferencial (DIC) e iluminación de epifluorescencia con un objetivo de 20x (aumento de 200 veces), lámpara de mercurio y una cámara EM-CCD. Verifique la eficiencia de la generación de virus y la infección mediante el monitoreo de la expresión de motores marcados con mCitrine en las células a través del cubo de filtro de emisión y excitación mCitrine. Además, verifique si hay cambios morfológicos en las células infectadas, como células/núcleos agrandados (Figura 1A-C).
    8. Nuevamente, verifique las células 72 h después de la infección. Por lo general, las células comienzan a desprenderse de la superficie (Figura 2).
    9. Si el >5% de las células se desprenden de la superficie, cosechar los medios con células infectadas en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml y girar durante 5 min a 500 x g.
    10. Recoger el sobrenadante y las alícuotas de congelación rápida de 1 ml en nitrógeno líquido y almacenar como cepa P0 a -80 °C o utilizarlo para generar existencias de virus P1.
  2. Generación de existencias de virus P1
    1. Para amplificar aún más el stock de baculovirus P0 y confirmar la expresión de proteínas, cultive células Sf9 en cultivo de suspensión líquida.
    2. En un matraz cónico estéril de 100 ml, añadir 10 ml de medios Sf-900/SFM con una densidad celular de 2 x 106 células/ml y 1 ml de cepas de virus P0. Incubar a 28 °C con agitación constante a 90 rpm.
    3. Después de 72 h de la infección, comprobar la expresión de proteínas como se describió anteriormente (paso 1.1.7). Si la expresión de la proteína es buena (>90% de las células muestran una señal brillante de fluorescencia mCitrine) y muestra una muerte celular significativa (aproximadamente 10% -15%), gire las células en un tubo cónico estéril de 15 ml a 500 x g durante 5 min.
    4. Recoja el sobrenadante, las alícuotas congeladas de 1 ml (cepa P1) en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C o proceda a la infección a gran escala y a la purificación de proteínas.
  3. Infección a gran escala
    1. Para la expresión de proteínas a gran escala, infectar 30 ml del cultivo en suspensión a 2 x 106 células/ml de densidad con 1 ml de cepas de virus P1 e incubar a 28 °C con agitación constante a 90 rpm.
    2. Después de ~ 72 h después de la infección, verifique la expresión de proteínas (en general, la expresión máxima de proteínas se logra entre 65-75 h después de la infección).
    3. Si el >90% de las células muestran una señal fluorescente brillante con una muerte celular mínima (<5%), recoger las células en un tubo cónico estéril de 50 ml y girar hacia abajo a 500 x g a 4 °C durante 15 min.
      NOTA: Debe haber una muerte celular mínima (<5%), porque las células muertas liberan el contenido celular en los medios, lo que conduce a la pérdida de la proteína expresada.
    4. Deseche el sobrenadante, recoja el pellet celular y proceda con la purificación de proteínas.

2. Purificación Sf9 de motores de kinesina-3

  1. A la cápsula celular anterior, agregue 3 ml de tampón de lisis helada (Tabla suplementaria 1) recién suplementado con 5 mM DTT, 5 μg / ml de aprotinina, 5 μg / ml de leupeptina y 5 μg / ml de PMSF y lisar las células pipeteando 20-25 veces sin generar burbujas de aire. Para todas las composiciones tampón y reactivos, consulte la Tabla suplementaria 1.
  2. Girar el lisado celular a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  3. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco y estéril y mezcle con ~40 μL de resina de afinidad anti-FLAG M2 al 50%. Incubar la mezcla durante 3 h a 4 °C con volteo de extremo a extremo.
  4. Después de la incubación, granular la resina FLAG girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C. Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet con una aguja de 26 G y desechar.
  5. Lave el pellet de resina FLAG tres veces con tampón de lavado helado (Tabla suplementaria 1) recién suplementado con 2 mM de DTT, 5 μg/ml de aprotinina, 5 μg/ml de leupeptina y 5 μg/ml de PMSF. Granular las perlas girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C en cada lavado.
  6. Después del tercer lavado, drene cuidadosamente el tampón de lavado tanto como sea posible sin alterar el pellet. Para la elución de proteínas, añadir ~70 μL de tampón de lavado que contenga 100 μg/ml de péptido FLAG al pellet de resina e incubar durante la noche a 4 °C con volteo de extremo a extremo.
  7. Al día siguiente, girar la resina a 500 x g durante 1 minuto a 4 °C. Recoja el sobrenadante que contiene proteína purificada en un tubo fresco y complemente con 10% de glicerol. Congelar alícuotas de 5 μL en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta su uso posterior.
  8. Ejecute el gel SDS-PAGE para determinar la concentración y el rendimiento de la proteína. Junto con la proteína purificada de interés, se carga un control de proteína estándar, BSA de concentraciones conocidas que van desde 0.2 μg, 0.4 μg, 0.6 μg, 0.8 μg y 1 μg para generar una curva estándar. Mancha el gel con Coomassie Brilliant blue (Figura 3).
  9. Analice el gel utilizando una herramienta de cuantificación de gel incorporada en el software ImageJ. Primero, medir la intensidad de banda de concentraciones conocidas de BSA y generar la curva estándar. Luego, mida la intensidad de la banda de proteína purificada y determine la concentración de proteína. Para hacerlo, abra el software Image J, haga clic en la opción Analizar en la barra de menú y seleccione Geles en el menú desplegable.

3. Ensayo de motilidad in vitro de una sola molécula utilizando motores de quinesina-3 purificados con Sf9

NOTA: Los motores de quinesina-3 purificados con Sf9 se pueden usar para estudiar propiedades bioquímicas y biofísicas, como la tasa de renovación de ATP, la afinidad de los microtúbulos, la velocidad, la longitud de ejecución, el tamaño del paso y la generación de fuerza. Aquí, se describe un protocolo detallado para el análisis de motilidad in vitro de molécula única de KIF1A (1-393LZ) utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Para toda la composición de tampones y reactivos, consulte la Tabla suplementaria 1.

  1. Polimerización de microtúbulos
    1. En un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml preenfriado, preparar una mezcla de polimerización pipeteando en el siguiente orden: 12,0 μL de tampón BRB80, pH 6,9; 0,45 μL de 100 mM MgCl2, 1 μL de 25 mM GTP.
    2. Extraer una alícuota de 10 μL de tubulina de 10 mg/ml almacenada en nitrógeno líquido, descongelar inmediatamente y añadir a la mezcla de polimerización anterior. Mezclar suavemente pipeteando 2-3 veces sin crear burbujas de aire.
      NOTA: Realice los pasos anteriores de forma rápida y estricta sobre hielo.
    3. Deje que la mezcla anterior repose en hielo durante 5 minutos.
      NOTA: Este es un paso crítico para prevenir la desnaturalización de la tubulina o para evitar la formación de semillas de microtúbulos cortos.
    4. Transfiera el tubo a un bloque de calor precalentado a 37 °C / baño de agua e incube durante 30 minutos para la polimerización de microtúbulos.
    5. Mientras los microtúbulos polimerizan, descongele una alícuota de tampón P12 y llévela a temperatura ambiente.
    6. Antes de completar 30 minutos de incubación, comience a preparar el tampón de estabilización MT pipeteando 100 μL de tampón P12 en un tubo de microcentrífuga nuevo. A esto, agregue 1 μL de 1 mM de taxol e inmediatamente vortex la mezcla.
      NOTA: Comience a preparar el tampón de estabilización MT aproximadamente 5 minutos antes de completar la incubación en el paso 3.1.4. Taxol estabiliza los microtúbulos polimerizados mediante la unión a β-tubulina.
    7. Caliente el tampón de estabilización de microtúbulos durante 2-3 min a 37 °C y agréguelo suavemente a los microtúbulos polimerizados sin alterar la mezcla de polimerización en la parte inferior.
      NOTA: El calentamiento del tampón de estabilización lo llevará a la misma temperatura que la mezcla de polimerización.
    8. No golpear ni pipetear la mezcla e incubar más a 37 °C durante 5 min.
    9. Golpee suavemente la mezcla y mézclela con una punta de corte biselada (capacidad de 200 μL) lentamente usando la pipeta.
      NOTA: A partir de este momento, manipule siempre los microtúbulos con una punta de corte biselada para evitar el cizallamiento de microtúbulos.
    10. Tome 10-15 μL de microtúbulos polimerizados en una celda de flujo para verificar la polimerización adecuada de los microtúbulos.
      NOTA: Uno puede visualizar los microtúbulos no marcados usando una configuración de microscopía DIC.
    11. Si los microtúbulos están concentrados, dilúyalos en tampón P12 suplementado con taxol de 10 μM.
  2. Preparación de la cámara celular de flujo de motilidad
    1. Prepare una cámara de motilidad utilizando un portaobjetos de vidrio, cinta de doble cara y un cubreobjetos de vidrio (22 mm x 30 mm).
    2. Tome un portaobjetos de vidrio, coloque una gota (~ 70 μL) de agua destilada desionizada en el medio y límpiela con un pañuelo de papel sin pelusa.
    3. Corte dos tiras de cinta de doble cara (~ 35 x 3 mm) y péguelas firmemente a la diapositiva de vidrio en paralelo, dejando un espacio de ~ 4-5 mm entre dos tiras para crear un pasaje estrecho.
    4. A continuación, tome un cubreobjetos y agregue una gota (~ 20 μL) de agua destilada desionizada en el medio. Coloque una tira de papel de seda de limpieza de lentes sin pelusa sobre la gota de agua hasta que absorba el agua. Luego, deslícelo lentamente hacia un extremo del cubreobjetos.
      NOTA: El cubreobjetos debe estar completamente seco. No debe haber agua visible en el cubreobjetos.
    5. Coloque el cubreobjetos en las tiras de doble cara pegadas en la corredera y presione el cubreobjetos uniformemente a lo largo de las tiras para que se pegue firmemente.
      NOTA: Asegúrese de que el lado limpio del cubreobjetos esté orientado hacia el portaobjetos de vidrio.
    6. Asegúrese de que juntos crean una cámara estrecha de 10-15 μL de capacidad para realizar el ensayo de motilidad (Figura 4A).
  3. Ensayo de motilidad in vitro de molécula única
    NOTA: Para estudiar las propiedades de motilidad de una sola molécula basadas en microtúbulos de los motores, los microtúbulos deben adsorberse en la superficie del cubreobjetos en la cámara de motilidad.
    1. Diluir los microtúbulos polimerizados estabilizados con taxol en tampón P12 suplementado con taxol de 10 μM en proporciones de 1:5 y mezclar pipeteando lentamente con una punta biselada.
    2. Mantenga la cámara de flujo en una posición inclinada (~15-20°). Fluya 30 μL de solución de microtúbulos diluidos a través de la cámara de flujo desde el extremo superior mientras mantiene un papel de seda sin pelusa en el extremo inferior para absorber el líquido. Esto crea una fuerza de cizallamiento para alinear el microtúbulo en la dirección del flujo y ayuda a adsorber los microtúbulos rectos y alineados paralelos.
    3. Deje una pequeña gota de líquido en ambos extremos de la cámara y mantenga la celda de flujo en una posición invertida (cubreobjetos hacia la parte inferior) en una cámara cerrada y húmeda para evitar que se seque la cámara de motilidad.
    4. Déjelo reposar durante ~ 30 minutos para que los microtúbulos se adsorban a la superficie del cubreobjetos dentro de la cámara de motilidad.
    5. Mientras tanto, prepare el tampón de bloqueo mezclando 500 μL de tampón P12-BSA con 5 μL de 1 mM de taxol.
    6. Fluya 40-50 μL de tampón de bloqueo e incube el portaobjetos en posición invertida durante 10 minutos en una cámara húmeda.
    7. Preparar la mezcla de motilidad pipeteando los siguientes componentes en un tubo de microcentrífuga estéril de 500 μL de capacidad en el orden siguiente: 25 μL de tampón P12 con taxol, 0,5 μL de 100 mM MgCl2, 0,5 μL de 100 mM DTT, 0,5 μL de 20 mg/ml glucosa oxidasa, 0,5 μL de 8 mg/ml catalasa, 0,5 μL de 2,25 m de glucosa, y 1,0 μL de 100 mM de ATP.
      NOTA: Las imágenes de fluorescencia han sido ampliamente utilizadas para aplicaciones biológicas 22,23,24,25,26. La fotoexcitación de proteínas fluorescentes genera especies reactivas de oxígeno (ROS), que pueden causar fotoblanqueo de las proteínas fluorescentes y daño a las muestras biológicas27,28. Los eliminadores de oxígeno como la glucosa, la glucosa oxidasa y la catalasa se usan rutinariamente en ensayos de motilidad para limitar el fotodaño y prolongar el tiempo de blanqueo de las proteínas fluorescentes.
    8. Finalmente, agregue 1 μL del motor purificado a la mezcla de motilidad anterior y mezcle bien antes de fluir hacia la cámara de motilidad.
    9. Selle ambos extremos de la cámara de motilidad con cera de parafina líquida e inmediatamente imagine bajo iluminación TIRF utilizando un objetivo TIRF 100X de 1.49 NA con un aumento de 1.5x.
    10. Para enfocar la superficie del cubreobjetos, primero, concéntrese en uno de los bordes internos de la cinta de doble cara en la cámara de motilidad bajo iluminación de contraste de interferencia diferencial (DIC).
      NOTA: La superficie brillante y desigual será visible.
    11. Luego, mueva el foco hacia la cámara de motilidad. Usando un ajuste fino, enfoque la superficie del cubreobjetos y busque los microtúbulos adsorbidos en la superficie del cubreobjetos.
    12. Una vez enfocados los microtúbulos, cambie a la iluminación TIRF con un láser de excitación de 488 nm y ajuste la profundidad de iluminación cambiando el ángulo del haz de excitación para obtener la mejor y uniforme iluminación TIRF (Figura 4B).
    13. Enfoque los motores individuales marcados con mCitrine que se mueven procesalmente a lo largo de la superficie de los microtúbulos con una exposición de 100 ms y grabe el movimiento utilizando una cámara EM-CCD.
      NOTA: Aunque los ensayos de motilidad se realizaron en microtúbulos no marcados, la función de proyección z de intensidad máxima se puede utilizar para revelar el contorno de la pista de microtúbulos. Preferentemente, los eventos en pistas largas de microtúbulos se consideraron para el análisis de seguimiento.
    14. Rastree manualmente la posición de los motores individuales marcados con fluorescencia que caminan sobre pistas de microtúbulos largos cuadro por cuadro utilizando un complemento escrito a medida en el software ImageJ (nih.gov) como se describió anteriormente29.
    15. Genere los histogramas de velocidad y longitud de ejecución para la población motora trazando el número de eventos en cada contenedor. Ajuste estos histogramas a una sola función de pico gaussiano para obtener la velocidad promedio y la longitud de ejecución12 (Figura 4C-E).

4. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos in vitro

NOTA: Para comprender el comportamiento colectivo de los motores de quinesina-3, se realizó un ensayo de deslizamiento de microtúbulos in vitro 18,30,31. Cuando los motores se inmovilizan sobre el cubreobjetos en posición invertida y al agregar microtúbulos a la cámara, los microtúbulos aterrizan en los motores y se deslizan a medida que los motores intentan caminar sobre ellos (Figura 5A, B).

  1. Polimerización de microtúbulos fluorescentes: Polimerizar los microtúbulos siguiendo el protocolo descrito anteriormente, excepto para mezclar tubulina marcada con rodamina (3 mg/ml) con tubulina no marcada (10 mg/ml) en una proporción de 1:10.
  2. Después de 30 minutos de polimerización, añadir suavemente 30 μL de tampón de estabilización de microtúbulos precalentados e incubar durante 5 min a 37 °C.
  3. A continuación, corte los microtúbulos pipeteando con la punta de carga capilar (~25-30 veces).
  4. Preparar la cámara de flujo de motilidad como se describió anteriormente, fluir 50 μL de nanocuerpos GFP purificados con Sf9 (2,5 μL de 100 nM diluidos en 50 μL de tampón P12) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente con el cubreobjetos hacia abajo en una cámara húmeda.
    NOTA: Los motores están marcados con mCitrine. Los nanocuerpos de GFP se utilizan para inmovilizar los motores debido a su baja constante de disociación32.
  5. Bloquear la superficie del cubreobjetos haciendo fluir 50 μL de tampón de bloque en la cámara de flujo para evitar la adsorción de proteínas inespecíficas e incubar aún más durante 5 minutos.
  6. Prepare la mezcla de motores pipeteando 50 μL de tampón de bloque, 1 μL de ATP de 100 mM y 5 μL de motores de quinesina-3 purificados con Sf9 de 100 nM. Mezclar suavemente antes de fluir hacia la cámara e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
  7. Lave la cámara dos veces con 50 μL de caseína P12.
  8. En un tubo de microcentrífuga estéril, preparar la mezcla de ensayo deslizante en el siguiente orden, 45 μL de P12-caseína con 10 μM de taxol, 1 μL de 100 mM de ATP, 0,5 μL de 8 mg/ml de catalasa, 0,5 μL de glucosa oxidasa de 20 mg/ml, 0,5 μL de glucosa 2,25 M y 1 μL de microtúbulos fluorescentes cortados. Mezcle suavemente el contenido antes de fluir hacia la cámara de motilidad y selle los extremos de la cámara con cera de parafina líquida.
  9. Imagen de microtúbulos deslizándose bajo iluminación TIRF a 100 ms de exposición y captura las imágenes con la cámara EM-CCD adjunta.
    NOTA: La velocidad promedio de deslizamiento de microtúbulos se determinó mediante el seguimiento manual de aproximadamente 100 microtúbulos individuales cuadro por cuadro utilizando un complemento escrito a medida en ImageJ29. Determinar la velocidad media de deslizamiento de los microtúbulos generando un histograma y ajustándose a una función gaussiana (Figura 5C,D).

Resultados

Para expresar y purificar proteínas motoras recombinantes activas y funcionales a gran escala utilizando la expresión de Sf9-baculovirus, el sistema necesita la generación de partículas virales que lleven de manera estable una secuencia codificante para infectar las células Sf9. Para lograr esto, las células Sf9 se transfectaron con bacmid recombinante que codifica KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Después de 72 h, una población significativa de células mostró expresión de proteína verde fluorescente (mCitrine) c...

Discusión

El sistema de expresión de baculovirus Sf9 es uno de los métodos más versátiles y exitosos para la producción de proteínas de alto rendimiento 19,36,37. La capacidad de modificación postraduccional de las células Sf9 es altamente comparable al sistema de mamíferos15. Una desventaja considerable de usar este sistema es que es lento y sensible a la contaminación. Uno de los pasos más críticos es...

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

V.S. y P.S. agradecen a la Prof. Kristen J. Verhey (Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EUA) y al Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) por su apoyo incondicional durante todo el estudio. P.S. agradece a la Dra. Sivapriya Kirubakaran por su apoyo durante todo el proyecto. V.S. reconoce la financiación a través de DBT (Subvención No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 y BT/RLF/Reentry/45/2015) y DST-SERB (Subvención No.: ECR/2016/000913). P.K.N reconoce al ICMR por su financiación (Subvención No. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconoce la financiación del horario de verano (Subvención No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S reconoce la beca de IIT Gandhinagar.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

Referencias

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