JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

초록

복잡한 세포 환경은 단일 분자 운동성 분석에 어려움을 야기합니다. 그러나 이미징 기술의 발전으로 단일 분자 연구가 개선되었으며 형광 태그 분자의 동적 거동을 감지하고 이해하는 데 엄청난 인기를 얻었습니다. 여기에서는 TIRF(전반사 형광) 현미경을 사용하여 kinesin-3 계열 모터의 체외 단일 분자 연구에 대한 자세한 방법을 설명합니다. Kinesin-3는 세포 내 화물 수송에서 세포 분열, 발달에 이르기까지 세포 및 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 대가족입니다. 우리는 이전에 구성 활성 이량 체 키네신 -3 모터가 포유류 세포에서 모터를 발현하여 제조 된 세포 용해물을 사용하여 단일 분자 수준에서 높은 미세 소관 친화력으로 빠르고 초 프로세스 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리 실험실은 세포, 생화학 및 생물 물리학 적 접근법을 사용하여 kinesin-3 모터와 조절 메커니즘을 연구하며, 이러한 연구는 대규모로 정제 된 단백질을 요구합니다. 포유류 세포를 사용하여 이러한 모터의 발현 및 정제는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 반면, 원핵생물 발현 시스템에서의 발현은 상당히 응집되고 비활성 단백질을 초래했습니다. 박테리아 정제 시스템과 포유류 세포 용해물의 한계를 극복하기 위해 당사는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 구축했습니다. kinesin-3 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 감소시키는 3-탠덤 형광 단백질(3xmCitirine 또는 3xmCit)로 C-말단 태그가 지정되어 있습니다. Sf9 정제 단백질의 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 글라이딩 분석은 키네신-3 모터가 포유류 세포 용해물을 사용한 이전 연구와 유사하게 빠르고 초공정적임을 보여줍니다. 이러한 분석을 사용하는 다른 응용 분야에는 모터의 올리고머 조건, 생화학 연구를 병행하는 특정 결합 파트너 및 운동 상태에 대한 자세한 지식이 포함됩니다.

서문

엄청나게 붐비는 세포 환경은 예정된 단백질과 분자를 분류하는 데 많은 문제를 제기합니다. 세포질 내 분자의 조직과 시공간 분포의 이러한 강렬한 작업량은 분자 모터와 세포 골격 트랙에 의해 촉진됩니다. 분자 모터는 ATP와 같은 에너지 통화를 가수분해하고 운동 및 힘 생성중에 해당 에너지를 활용하는 효소입니다1. 아미노산 서열 유사성에 따라 키네신은 14 개의 패밀리로 그룹화되며 이러한 유사성에도 불구하고 각 모터는 세포의 기능에 고유하게 기여합니다. Kinesin-3 제품군 모터는 소포 수송, 신호 전달, 유사분열, 핵 이동 및 발달 3,4,5를 포함한 다양한 세포 및 생리적 기능과 관련된 5개의 하위 패밀리(KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 및 KIF28)2로 구성된 가장 큰 모터 중 하나입니다. 키네신-3 수송 기능의 손상은 많은 신경퇴행성 장애, 발달 결함 및암 질환과 관련이 있습니다6,7,8,9.

최근 연구에 따르면 키네신-3 모터는 단량체이지만 화물 유도 이량체화를 거쳐 기존 키네신10,11,12,13에 비해 빠르고 초공정 운동성을 초래합니다. 그들의 생화학 적 및 생물 물리학 적 특성화에는 많은 양의 정제 된 활성 단백질이 필요합니다. 그러나, 원핵 생물 발현 시스템에서의 이들의 생산은 아마도 호환되지 않는 단백질 합성, 접힘 및 변형 기계 14,15,16,17,18로 인해 비활성 또는 응집 된 모터를 초래했다. 이러한 한계를 우회하고 수율을 높이기 위해 여기에서 우리는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-baculovirus 발현 시스템을 구축했습니다.

바쿨로바이러스 발현 시스템은 Sf9 곤충 세포주를 고처리량 진핵생물 재조합 단백질 발현19,20을 위한 숙주 시스템으로 사용합니다. Baculovirus는 이종 유전자 발현 및 가용성 재조합 단백질17의 생산을 돕는 강력한 다면체 프로모터를 보유한다. 비용 효율성, 취급 안전성 및 다량의 활성 단백질 발현으로 인해 강력한 도구21이되었습니다. 관심있는 단백질을 발현하기 위해, 핵심 단계는 재조합 bacmid를 생성하는 것이다. 상업적으로 이용 가능한 bacmid 생성 키트는 비싸고 더 많은 샘플로 작업 할 것이기 때문에 우리는 bacmids에 kinesin-3 모터의 크고 작은 삽입물 모두를위한 사내 프로토콜을 개발했습니다. Sf9-정제된 키네신-3 모터는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 미세소관 글라이딩 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 줄이기 위해 3-직렬 형광 분자(3xmCit)로 C 단자 태그가 지정됩니다. TIRF 이미징은 증가 된 신호 대 잡음비, 적은 광독성 및 커버 슬립에 가까운 매우 작은 영역의 선택적 이미징으로 인해 생체 내 및 시험관 내에서 단일 분자 수준에서 단백질 역학을 시각화하는 데 널리 사용되었습니다.

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템과 TIRF 현미경을 사용한 모터의 체외 단일 분자 이미징 및 다중 모터 글라이딩 분석을 사용하여 키네신-3 모터의 정제에 대해 논의합니다. 전체적으로, 이 연구는 Sf9 정제된 모터의 운동성 특성이 포유류 세포 용해물로부터 제조된 모터의 그것과 동일하다는 것을 보여준다. 따라서 우리는 Sf9-baculovirus 시스템이 관심있는 모든 운동 단백질을 발현하고 정제하도록 적응할 수 있다고 믿습니다.

프로토콜

1. Sf9 배양, 형질감염 및 바이러스 생성

참고: 9°C에서 항생제/항진균제 없이 100mL 멸균 일회용 원추형 플라스크에 Sf-900/SFM 배지 30mL에 Sf28 세포를 유지합니다. 현탁액 배양물을 오비탈 쉐이커에서 90 rpm으로 유지한다. CO2 공급 및 습도 유지가 필요하지 않습니다. 세포는 일반적으로 4일째에 2.0 x 106 cells/mL 밀도에 도달하기 위해 0.5 x 106 cells/mL를 접종하여 4일마다 계대 배양됩니다.

  1. P0 바이러스 스톡 생성
    1. 형질감염을 위해, 시드 세포를 4.5 x 105 cells/mL 컨플루언시를 갖는 35 mm 접시에 넣고 흔들지 않고 28°C에서 유지한다.
    2. 24시간 후, 일단 세포가 부착되고 건강해 보이면 아래에 설명된 대로 형질감염을 진행합니다.
      1. 튜브 A: 구성 활성 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG 특이적 키네신-3 모터에 대해 코딩하는 1μg의 bacmid DNA를 보충되지 않은 Grace's 배지 100μL와 혼합합니다.
      2. 튜브 B: 6μL의 형질주입 시약과 100μL의 보충되지 않은 Grace's 배지를 혼합합니다.
      3. 튜브 A 의 내용물을 튜브 B 로 조심스럽게 옮기고 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다(약 20회).
      4. 혼합물을 실온에서 ~45분 동안 배양합니다.
    3. 배양을 완료한 후 보충되지 않은 Grace's 배지 0.8mL를 위의 혼합물에 추가하고 피펫팅으로 천천히 혼합합니다.
    4. 세포에서 Sf-900/SFM 배지를 부드럽게 흡인합니다(형질주입 효율에 영향을 줄 수 있는 혈청 흔적을 제거하기 위해).
    5. 단계 1.1.3으로부터의 형질주입 혼합물을 세포의 상부에 적가하고, 플레이트를 28°C에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
    6. 배양 후, 형질주입 혼합물을 조심스럽게 제거하고, 2 mL의 Sf-900/SFM 배지를 추가하고, 28°C에서 48 h 동안 추가로 배양한다.
    7. 도립 형광 현미경으로 운동 단백질 발현을 확인하십시오. 운동 단백질에는 노란색 형광 단백질의 변종인 형광 단백질인 mCitrine이 태그되어 있습니다.
      참고: 형질주입된 세포는 미분 간섭 대비(DIC) 및 20배 대물렌즈(200배 배율)의 에피형광 조명, 수은 램프 및 EM-CCD 카메라가 장착된 도립 현미경으로 시각화되었습니다. mCitrine 여기 및 방출 필터 큐브를 통해 세포에서 mCitrine 태그 모터의 발현을 모니터링하여 바이러스 생성 및 감염의 효율성을 확인합니다. 또한 확대 된 세포 / 핵과 같은 감염된 세포의 형태 학적 변화를 확인하십시오 (그림 1A-C).
    8. 다시, 감염 후 72 시간 후에 세포를 확인하십시오. 일반적으로 세포는 표면에서 분리되기 시작합니다(그림 2).
    9. 세포의 >5%가 표면에서 분리된 경우 1.5mL 멸균 미세 원심분리 튜브에서 감염된 세포가 있는 배지를 수확하고 500 x g에서 5분 동안 회전합니다.
    10. 상청액을 수집하고 액체 질소에서 1mL의 스냅 동결 분취액을 -80°C에서 P0 스톡으로 저장하거나 이를 사용하여 P1 바이러스 스톡을 생성합니다.
  2. P1 바이러스 스톡 생성
    1. P0 바쿨로바이러스 스톡을 추가로 증폭하고 단백질 발현을 확인하려면 액체 현탁 배양에서 Sf9 세포를 성장시킵니다.
    2. 멸균 100mL 원뿔형 플라스크에 세포 밀도가 2 x 106 세포/mL인 Sf-900/SFM 배지 10mL와 P0 바이러스 스톡 1mL를 추가합니다. 90 rpm에서 일정하게 흔들면서 28°C에서 배양한다.
    3. 감염 72시간 후, 앞에서 설명한 대로 단백질 발현을 확인합니다(단계 1.1.7). 단백질 발현이 양호하고(세포의 >90%가 밝은 mCitrine 형광 신호를 나타냄) 상당한 세포 사멸(약 10%-15%)을 보이는 경우 500 x g 의 15mL 멸균 원뿔형 튜브에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.
    4. 상층액을 수집하고 액체 질소에 1mL(P1 스톡)의 분취량을 스냅 동결하고 -80°C에서 보관하거나 대규모 감염 및 단백질 정제를 진행합니다.
  3. 대규모 감염
    1. 대규모 단백질 발현의 경우 2 x 106 cells/mL 밀도의 현탁 배양액 30mL를 P1 바이러스 스톡 1mL로 감염시키고 90rpm에서 지속적으로 흔들면서 28°C에서 배양합니다.
    2. 감염 후 ~ 72 시간 후에 단백질 발현을 확인하십시오 (일반적으로 최대 단백질 발현은 감염 후 65-75 시간 사이에 달성됩니다).
    3. 세포의 >90%가 세포 사멸을 최소화하면서 밝은 형광 신호를 보이면 (<5 %), 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고 4 ° C에서 15 분 동안 500 x g 으로 스핀 다운합니다.
      참고: 죽은 세포가 세포 내용물을 배지로 방출하여 발현된 단백질의 손실을 초래하기 때문에 최소한의 세포 사멸(<5%)이 있어야 합니다.
    4. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 수집하고 단백질 정제를 진행합니다.

2. 키네신-3 모터의 Sf9 정화

  1. 위의 세포 펠릿에 5mM DTT, 5μg/mL의 아프로티닌, 5μg/mL의 류펩틴 및 5μg/mL의 PMSF가 새로 보충된 3mL의 얼음 냉장 용해 완충액(보충 표 1)을 추가하고 기포를 생성하지 않고 20-25회 피펫팅하여 세포를 용해합니다. 모든 완충액 조성 및 시약에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.
  2. 세포 용해물을 4°C에서 30분 동안 150,000 x g 로 회전시킵니다.
  3. 상청액을 신선한 멸균 튜브에 모으고 ~40μL의 50% 항-FLAG M2 친화성 수지와 혼합합니다. 혼합물을 종단 간 텀블링과 함께 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.
  4. 인큐베이션 후, 4°C에서 1분 동안 500 x g 에서 방사하여 FLAG 수지를 펠렛화한다. 26G 바늘로 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 부드럽게 흡입하고 버립니다.
  5. FLAG 수지 펠릿을 2mM DTT, 5μg/mL의 아프로티닌, 5μg/mL의 류펩틴 및 5μg/mL의 PMSF가 새로 보충된 얼음처럼 차가운 세척 완충액(보충 표 1)으로 세 번 세척합니다. 비드를 펠렛화하여 각 세척에서 4°C에서 1분 동안 500 x g 에서 방사한다.
  6. 세 번째 세척 후 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 세척 버퍼를 조심스럽게 배출하십시오. 단백질 용리를 위해 100μg/mL FLAG 펩타이드가 포함된 세척 완충액 ~70μL를 수지 펠릿에 추가하고 종단 간 텀블링으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
  7. 다음날에, 수지를 4°C에서 1분 동안 500 x g 으로 스핀다운한다. 정제 된 단백질을 함유 한 상청액을 신선한 튜브에 모으고 10 % 글리세롤을 보충하십시오. 5 μL의 분취량을 액체 질소에 스냅 동결하고 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  8. SDS-PAGE 겔을 실행하여 단백질 농도와 수율을 결정합니다. 표준 단백질 대조군인 관심 정제된 단백질과 함께 0.2μg, 0.4μg, 0.6μg, 0.8μg 및 1μg 범위의 알려진 농도의 BSA를 로딩하여 표준 곡선을 생성합니다. Coomassie Brilliant blue로 젤을 염색합니다 (그림 3).
  9. ImageJ 소프트웨어에 내장된 겔 정량화 도구를 사용하여 겔을 분석합니다. 먼저 알려진 BSA 농도의 밴드 강도를 측정하고 표준 곡선을 생성합니다. 그 후, 정제된 단백질 밴드의 강도를 측정하고 단백질 농도를 결정한다. 이렇게 하려면 Image J 소프트웨어를 열고 메뉴 표시줄에서 분석 옵션을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 젤을 선택합니다.

3. Sf9 정제 키네신-3 모터를 사용한 시험관 내 단일 분자 운동성 분석

알림: Sf9 정제 kinesin-3 모터는 ATP 회전율, 미세 소관 친화도, 속도, 실행 길이, 스텝 크기 및 힘 생성과 같은 생화학 적 및 생물 물리학 적 특성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 이용한 KIF1A(1-393LZ)의 시험관 내 단분자 운동성 분석을 위한 상세한 프로토콜에 대해 설명한다. 모든 완충액 조성 및 시약에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.

  1. 미세소관 중합
    1. 사전 냉각된 0.5mL 미세원심분리 튜브에서, 다음 순서로 피펫팅하여 중합 혼합물을 제조한다: 12.0 μL의 BRB80 완충액, pH 6.9; 0.45 μL의 100 mMMgCl2, 1 μL의 25 mM GTP.
    2. 액체 질소에 저장된 10mg/mL 튜불린 10μL 분취량을 꺼내 즉시 해동하고 상기 중합 혼합물에 첨가합니다. 기포를 만들지 않고 2-3회 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
      알림: 얼음 위에서 위의 단계를 빠르고 엄격하게 수행하십시오.
    3. 위의 혼합물을 5분 동안 얼음 위에 두십시오.
      알림: 이것은 튜불린의 변성을 방지하거나 짧은 미세소관 씨앗의 형성을 피하기 위한 중요한 단계입니다.
    4. 튜브를 예열된 37°C 열 블록/수조로 옮기고 미세소관의 중합을 위해 30분 동안 배양합니다.
    5. 미세소관이 중합되는 동안 P12 완충액의 분취량을 해동하고 실온으로 가져옵니다.
    6. 30분의 배양을 완료하기 전에 100μL의 P12 완충액을 새로운 미세 원심분리 튜브에 피펫팅하여 MT 안정화 완충액 준비를 시작합니다. 여기에 1 mM 탁솔 1 μL를 첨가하고 혼합물을 즉시 와동시킨다.
      참고: 5단계에서 배양을 완료하기 약 3.1.4분 전에 MT 안정화 버퍼 준비를 시작합니다. Taxol은 β-튜불린에 결합하여 중합된 미세소관을 안정화시킵니다.
    7. 미세소관 안정화 완충액을 37°C에서 2-3분 동안 데우고 바닥의 중합 혼합물을 방해하지 않고 중합된 미세소관에 부드럽게 첨가합니다.
      알림: 안정화 버퍼를 데우면 중합 혼합물과 동일한 온도가됩니다.
    8. 혼합물을 두드리거나 피펫팅하지 말고 37°C에서 5분 동안 더 배양합니다.
    9. 혼합물을 부드럽게 두드리고 피펫을 사용하여 비스듬한 절단 팁(200μL 용량)과 천천히 혼합합니다.
      알림: 이 시점부터는 미세소관 전단을 방지하기 위해 항상 경사진 절단 팁으로 미세소관을 다루십시오.
    10. 플로우 셀에서 중합된 미세소관 10-15μL를 취하여 적절한 미세소관 중합을 확인합니다.
      알림: DIC 현미경 설정을 사용하여 라벨링되지 않은 미세소관을 시각화할 수 있습니다.
    11. 미세소관이 농축되면 10μM 탁솔이 보충된 P12 완충액에 희석합니다.
  2. 운동성 유동 세포 챔버의 제조
    1. 유리 슬라이드, 양면 테이프 및 유리 커버 슬립 (22mm x 30mm)을 사용하여 운동성 챔버를 준비하십시오.
    2. 유리 슬라이드를 가져다가 중간에 탈이온화된 증류수 한 방울(~70μL)을 놓고 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼로 닦습니다.
    3. 양면 테이프 (~ 35 x 3mm)의 두 스트립을 자르고 유리 슬라이드에 평행하게 단단히 붙이고 두 스트립 사이에 ~ 4-5mm 간격을 두어 좁은 통로를 만듭니다.
    4. 다음으로, 커버 슬립을 가져 와서 중간에 탈 이온화 된 증류수 한 방울 (~ 20 μL)을 추가합니다. 보푸라기가없는 렌즈 세척 티슈 페이퍼가 물을 흡수 할 때까지 물방울에 놓습니다. 그런 다음 커버슬립의 한쪽 끝을 향해 천천히 밉니다.
      알림: 커버슬립은 완전히 건조되어야 합니다. 커버 슬립에 물이 보이지 않아야합니다.
    5. 슬라이드에 붙인 양면 스트립에 커버슬립을 놓고 스트립을 따라 커버슬립을 고르게 눌러 단단히 붙입니다.
      알림: 커버슬립의 청소된 면이 유리 슬라이드를 향하도록 하십시오.
    6. 이것이 함께 운동성 분석을 수행하기 위한 10-15 μL 용량의 좁은 챔버를 생성하는지 확인합니다(그림 4A).
  3. 시험관내 단일 분자 운동성 분석
    알림: 모터의 미세소관 기반 단일 분자 운동 특성을 연구하려면 미세소관을 운동성 챔버의 커버슬립 표면에 흡착해야 합니다.
    1. 중합된 탁솔 안정화 미세소관을 10μM 탁솔이 보충된 P12 완충액에 1:5 비율로 희석하고 비스듬한 팁으로 천천히 피펫팅하여 혼합합니다.
    2. 흐름 챔버를 경사 위치(~15-20°)에 유지하십시오. 30μL의 희석된 미세소관 용액을 상단에서 유동 챔버를 통해 흐르게 하고 하단에는 보풀이 없는 티슈 페이퍼를 유지하여 액체를 흡수합니다. 이것은 미세소관을 흐름 방향으로 정렬하는 전단력을 생성하고 미세소관을 똑바로 흡착하고 평행하게 정렬하는 데 도움이 됩니다.
    3. 챔버의 양쪽 끝에 작은 액체 방울을 남겨두고 운동성 챔버의 건조를 방지하기 위해 폐쇄되고 습한 챔버에서 플로우 셀을 거꾸로 된 위치(바닥을 향한 커버슬립)에 유지합니다.
    4. 미세 소관이 운동성 챔버 내부의 커버 슬립 표면에 흡착되도록 ~ 30 분 동안 그대로 두십시오.
    5. 그 동안 500μL P12-BSA 완충액과 5μL의 1mM 탁솔을 혼합하여 차단 완충액을 준비합니다.
    6. 40-50 μL의 블로킹 완충액을 흐르게 하고, 슬라이드를 습한 챔버에서 10분 동안 거꾸로 된 위치에서 인큐베이션한다.
    7. 다음 성분을 다음 순서로 500 μL 용량의 멸균 미세원심분리 튜브에 피펫팅하여 운동성 혼합물을 준비합니다: 탁솔이 포함된 P12 완충액 25μL, 100mMMgCl2 0.5μL, 100mM DTT 0.5μL, 20mg/mL 포도당 산화효소 0.5μL, 8mg/mL 카탈라아제 0.5μL, 0.5 μL의 2.25 M 글루코스, 및 1.0 μL의 100 mM ATP.
      참고: 형광 이미징은 생물학적 응용 분야 22,23,24,25,26에 널리 사용되었습니다. 형광 단백질의 광여기는 활성 산소 종 (ROS)을 생성하며, 이는 형광 단백질의 광퇴색 및 생물학적 샘플(27, 28)에 손상을 일으킬 수 있다. 포도당, 포도당 산화 효소 및 카탈라아제와 같은 산소 제거제는 광 손상을 제한하고 형광 단백질의 표백 시간을 연장하기 위해 운동성 분석에 일상적으로 사용됩니다.
    8. 마지막으로, 상기 운동성 혼합에 정제된 모터 1μL를 첨가하고 운동성 챔버로 유입되기 전에 잘 혼합한다.
    9. 운동성 챔버의 양쪽 끝을 액체 파라핀 왁스로 밀봉하고 1.5x 배율로 1.49NA의 100X TIRF 대물렌즈를 사용하여 TIRF 조명 하에서 즉시 이미지화합니다.
    10. 커버슬립 표면에 초점을 맞추기 위해, 먼저, 미분 간섭 대비(DIC) 조명 하에서 운동성 챔버에서 양면 테이프의 내부 가장자리 중 하나에 초점을 맞춘다.
      알림: 밝고 고르지 않은 표면이 보입니다.
    11. 그런 다음 초점을 운동성 챔버로 이동합니다. 미세 조정을 사용하여 커버슬립 표면의 초점을 맞추고 커버슬립 표면에 흡착된 미세소관을 찾습니다.
    12. 미세소관에 초점이 맞춰지면 488nm 여기 레이저를 사용하여 TIRF 조명으로 전환하고 여기 빔 각도를 변경하여 조명 깊이를 조정하여 최상의 균일한 TIRF 조명을 얻습니다(그림 4B).
    13. 100ms 노출로 미세소관 표면을 따라 공정하게 움직이는 개별 mCitrine 태그가 달린 모터의 초점을 맞추고 EM-CCD 카메라를 사용하여 움직임을 기록합니다.
      참고: 운동성 분석은 라벨이 부착되지 않은 미세소관에서 수행되었지만 최대 강도 z-투영 기능을 사용하여 미세소관 트랙의 윤곽을 밝힐 수 있습니다. 우선적으로, 긴 미세소관 트랙의 이벤트는 추적 분석을 위해 고려되었습니다.
    14. 긴 미세소관 트랙 위를 걷는 형광 태그가 부착된 개별 모터의 위치를 프레임별로 수동으로 추적하는 것은 앞서 설명한 바와 같이 ImageJ(nih.gov) 소프트웨어에서 사용자 정의 플러그인을 사용하여 프레임별로 추적한다(29).
    15. 각 Bin의 사건 수를 플로팅하여 모터 모집단에 대한 속도 및 런 길이의 히스토그램을 생성합니다. 이러한 히스토그램을 단일 가우스 피크 함수에 피팅하여 평균 속도와 런 길이12를 얻습니다(그림 4C-E).

4. 체외 미세소관 글라이딩 분석

참고: kinesin-3 모터의 집단 거동을 이해하기 위해 시험관 내 미세소관 글라이딩 분석을 18,30,31 수행했습니다. 모터가 거꾸로 된 위치에서 커버슬립에 고정되고 챔버에 미세소관을 추가하면 미세소관이 모터에 착지하고 모터가 그 위를 걸으려고 할 때 미끄러집니다(그림 5A,B).

  1. 형광 미세소관 중합: 로다민 표지된 튜불린(3mg/mL)과 표지되지 않은 튜불린(10mg/mL)을 1:10의 비율로 혼합하는 것을 제외하고 이전에 설명한 프로토콜에 따라 미세소관을 중합합니다.
  2. 30분의 중합 후, 30μL의 미리 데워진 미세소관 안정화 완충액을 부드럽게 첨가하고 37°C에서 5분 동안 추가로 배양한다.
  3. 다음으로, 모세관 로딩 팁으로 피펫팅하여 미세소관을 전단합니다(~25-30회).
  4. 앞서 기술한 바와 같이 운동성 유동 챔버를 준비하고, 50 μL의 Sf9-정제된 GFP 나노바디(50 μL의 P12 완충액에 희석된 100 nM의 2.5 μL)를 흐르게 하고, 습한 챔버에서 커버슬립이 아래쪽을 향하도록 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    알림: 모터에는 C 단자에 mCitrine이 태그되어 있습니다. GFP 나노바디는 낮은 해리 상수32로 인해 모터를 고정화하는 데 사용됩니다.
  5. 비특이적 단백질 흡착을 방지하기 위해 50μL의 블록 버퍼를 유동 챔버로 흘려 커버슬립 표면을 차단하고 5분 동안 추가로 배양합니다.
  6. 50μL의 블록 버퍼, 1μL의 100mM ATP 및 5μL의 100nM Sf9-정제된 키네신-3 모터를 피펫팅하여 모터 혼합물을 준비합니다. 챔버로 흘러 들어가기 전에 부드럽게 혼합하고 축축한 챔버에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
  7. 50 μL의 P12 카제인으로 챔버를 두 번 세척하십시오.
  8. 멸균 미세 원심분리 튜브에서 10μM 탁솔이 포함된 P12-카제인 45μL, 100mM ATP 1μL, 8mg/mL 카탈라아제 0.5μL, 20mg/mL 포도당 산화효소 0.5μL, 2.25M 포도당 0.5μL 및 전단된 형광 미세소관 1μL의 순서로 글라이딩 분석 혼합물을 준비합니다. 운동성 챔버로 흘러 들어가기 전에 내용물을 부드럽게 혼합하고 챔버의 끝을 액체 파라핀 왁스로 밀봉하십시오.
  9. 100ms 노출에서 TIRF 조명 아래에서 미끄러지는 이미지 미세 소관과 부착 된 EM-CCD 카메라로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 평균 미세소관 활공 속도는 ImageJ29에서 사용자 지정 플러그인을 사용하여 프레임별로 약 100개의 개별 미세소관을 수동으로 추적하여 결정되었습니다. 히스토그램을 생성하고 가우스 함수에 피팅하여 평균 미세소관 활공 속도를 결정합니다(그림 5C,D).

결과

Sf9-바쿨로바이러스 발현을 사용하여 활성 및 기능성 재조합 모터 단백질을 대규모로 발현하고 정제하려면 시스템이 Sf9 세포를 감염시키기 위해 코딩 서열을 안정적으로 운반하는 바이러스 입자를 생성해야 합니다. 이를 달성하기 위해, Sf9 세포를 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG를 코딩하는 재조합 바크미드로 형질감염시켰다. 72시간 후, 상당한 세포 집단이 확대된 세포와 핵(그림 1 및...

토론

Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템은 고처리량 단백질 생산을 위한 가장 다재다능하고 성공적인 방법 중 하나입니다 19,36,37. Sf9 세포의 번역후 변형 능력은 포유동물 시스템(15)과 매우 유사하다. 이 시스템을 사용할 때의 상당한 단점은 느리고 오염에 민감하다는 것입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 Sf9 세포?...

공개

저자는 선언 할 경쟁 재정적 이익이 없습니다.

감사의 말

V.S.와 P.S. Kristen J. Verhey 교수 (미시간 대학교, 앤아버, 미시건, 미국)와 Roop Mallik 교수 (인도 뭄바이의 인도 봄베이 공과 대학 (IITB))에게 연구 전반에 걸친 무조건적인 지원에 감사드립니다. 추신 : 프로젝트 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Sivapriya Kirubakaran 박사에게 감사드립니다. VS는 DBT(보조금 번호: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 및 BT/RLF/재진입/45/2015) 및 DST-SERB(보조금 번호: ECR/2016/000913)를 통한 자금 지원을 인정합니다. PKN은 자금 조달을 위해 ICMR을 인정합니다 (보조금 번호 5 / 13 / 13 / 2019 / NCD-III). 추신 : DST (보조금 번호 : SR / WOS-A / LS-73 / 2017)의 자금 지원을 인정합니다. DJS는 IIT Gandhinagar의 친목을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

참고문헌

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유