JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Resumo

Um ambiente celular complexo apresenta desafios para a análise da motilidade de molécula única. No entanto, o avanço nas técnicas de imagem melhorou os estudos de molécula única e ganhou imensa popularidade na detecção e compreensão do comportamento dinâmico de moléculas marcadas com fluorescência. Aqui, descrevemos um método detalhado para estudos in vitro de molécula única de motores da família da cinesina-3 usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Kinesin-3 é uma grande família que desempenha papéis críticos em funções celulares e fisiológicas que vão desde o transporte de carga intracelular para a divisão celular para o desenvolvimento. Mostramos anteriormente que os motores de cinesina dimérica-3 constitutivamente ativos exibem motilidade rápida e superprocessiva com alta afinidade de microtúbulos no nível de molécula única usando lisados celulares preparados por expressão motora em células de mamíferos. Nosso laboratório estuda os motores da cinesina-3 e seus mecanismos regulatórios usando abordagens celulares, bioquímicas e biofísicas, e tais estudos exigem proteínas purificadas em larga escala. A expressão e purificação desses motores usando células de mamíferos seria cara e demorada, enquanto a expressão em um sistema de expressão procariótica resultou em proteína significativamente agregada e inativa. Para superar as limitações impostas pelos sistemas de purificação bacteriana e pelo lisado de células de mamíferos, estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores. Os motores de cinesina-3 são C-terminalmente marcados com proteínas fluorescentes de 3 tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) que fornecem sinais aprimorados e fotobranqueamento diminuído. A análise in vitro de gliding de molécula única e multimotor de proteínas purificadas Sf9 demonstra que os motores de cinesina-3 são rápidos e superprocessivos semelhantes aos nossos estudos anteriores usando lisatos de células de mamíferos. Outras aplicações que usam esses ensaios incluem conhecimento detalhado das condições dos oligômeros dos motores, parceiros de ligação específicos em paralelo com estudos bioquímicos e seu estado cinético.

Introdução

Um ambiente celular imensamente lotado apresenta muitos desafios na classificação de proteínas e moléculas destinadas. Essa intensa carga de trabalho de organização e distribuição espaço-temporal de moléculas dentro do citoplasma é facilitada por motores moleculares e trilhas citoesqueléticas. Os motores moleculares são as enzimas que hidrolisam as moedas de energia, como o ATP, e utilizam essa energia durante a geração de movimento e força1. Com base na semelhança da sequência de aminoácidos, as cinesinas são agrupadas em 14 famílias e, apesar dessa semelhança, cada motor contribui exclusivamente para o funcionamento de uma célula. Os motores da família Kinesin-3 constituem um dos maiores, compreendendo cinco subfamílias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)2, associadas a diversas funções celulares e fisiológicas, incluindo transporte de vesículas, sinalização, mitose, migração nuclear e desenvolvimento 3,4,5. O comprometimento da função de transporte da cinesina-3 implica em muitos distúrbios neurodegenerativos, defeitos de desenvolvimento e doenças oncológicas 6,7,8,9.

Trabalhos recentes demonstraram que os motores de cinesina-3 são monômeros, mas sofrem dimerização induzida por carga e resultam em motilidade rápida e superprocessiva em comparação com a cinesina convencional10,11,12,13. Sua caracterização bioquímica e biofísica precisa de uma grande quantidade de proteínas purificadas e ativas. No entanto, sua produção no sistema de expressão procariótica resultou em motores inativos ou agregados, presumivelmente devido a máquinas incompatíveis de síntese, dobramento e modificação de proteínas 14,15,16,17,18. Para contornar tais limitações e aumentar o rendimento, aqui estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores.

O sistema de expressão de baculovírus utiliza linhagens celulares de insetos Sf9 como sistema hospedeiro para expressão de proteínas recombinantes eucarióticas de alto rendimento19,20. O baculovírus possui um forte promotor de poliedrina que auxilia na expressão gênica heteróloga e na produção de proteínas recombinantes solúveis17. Devido à sua relação custo-benefício, segurança de manusear e alta quantidade de expressão de proteína ativa, tornou-se uma ferramenta poderosa21. Para expressar uma proteína de interesse, um passo fundamental é gerar um bacmida recombinante. Como os kits de geração de bacmid disponíveis comercialmente são caros e trabalharemos com mais amostras, desenvolvemos um protocolo interno para inserções grandes e pequenas de motores de cinesina-3 em bacmids. Motores de cinesina-3 purificados com Sf9 foram utilizados para caracterizar as propriedades de deslizamento de microtúbulos monomolécula e multimotor in vitro usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Os motores são marcados terminalmente em C com moléculas fluorescentes de 3 tandem (3xmCit) para fornecer sinal aprimorado e fotobranqueamento diminuído. Devido ao aumento da relação sinal-ruído, menor fototoxicidade e imagem seletiva de uma área muito pequena perto da lâmina de cobertura, a imagem TIRF tem sido amplamente utilizada para visualizar a dinâmica de proteínas no nível de molécula única in vivo e in vitro.

Este estudo discute a purificação de motores de cinesina-3 empregando o sistema de expressão do baculovírus Sf9 e imagens in vitro de molécula única e análise de deslizamento multimotor de motores utilizando microscopia TIRF. No total, este estudo mostra que as propriedades de motilidade dos motores purificados Sf9 são idênticas às dos motores preparados a partir de lisatos de células de mamíferos. Assim, acreditamos que o sistema Sf9-baculovírus pode ser adaptado para expressar e purificar qualquer proteína motora de interesse.

Protocolo

1. Cultura, transfecção e geração de vírus Sf9

NOTA: Manter as células Sf9 em 30 ml de meio Sf-900/SFM em balão cónico estéril e descartável de 100 ml sem qualquer antibiótico/antimicótico a 28 °C. Mantenha a cultura da suspensão num agitador orbital a 90 rpm. O fornecimento de CO2 e a manutenção da umidade não são necessários. As células são geralmente subcultivadas a cada quatro dias, inoculando 0,5 x 10 6 células/mL para atingir 2,0 x 106 células/mL de densidade no quarto dia.

  1. Geração de estoque do vírus P0
    1. Para transfecção, células de sementes em um prato de 35 mm com confluência de4,5 x 10 5 células/mL e manter a 28 °C sem agitação.
    2. Após 24 h, uma vez que as células estejam ligadas e pareçam saudáveis, prossiga para a transfecção conforme descrito abaixo.
      1. Tubo A: Misture 1 μg de DNA bacmid codificando para o motor KIF1A(1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG específico de cinesina-3 com 100 μL de meio de Grace não suplementado.
      2. Tubo B: Misture 6 μL de reagente de transfecção com 100 μL de meio de Grace não suplementado.
      3. Transfira cuidadosamente o conteúdo do tubo A para o tubo B e misture completamente pipetando para cima e para baixo (aproximadamente 20 vezes).
      4. Incubar a mistura por ~45 min à temperatura ambiente.
    3. Depois de completar a incubação, adicione 0,8 mL de meio de Grace não suplementado à mistura acima e misture lentamente por pipetagem.
    4. Aspirar suavemente o meio Sf-900/SFM das células (para remover quaisquer vestígios de soro que possam afetar a eficiência da transfecção).
    5. Adicionar a mistura de transfecção da etapa 1.1.3 gota a gota no topo das células e incubar a placa durante 6 h a 28 °C.
    6. Após a incubação, remover cuidadosamente a mistura de transfecção, adicionar 2 mL de meio Sf-900/SFM e incubar ainda mais por 48 h a 28 °C.
    7. Verifique a expressão da proteína motora sob um microscópio de fluorescência invertida. A proteína motora é marcada com uma proteína fluorescente, mCitrino, uma variante da proteína fluorescente amarela.
      NOTA: As células transfectadas foram visualizadas sob microscópio invertido equipado com contraste diferencial de interferência (DIC) e iluminação de epifluorescência com objetiva de 20x (ampliação de 200 vezes), lâmpada de mercúrio e câmera EM-CCD. Verifique a eficiência da geração e infecção por vírus monitorando a expressão de motores marcados com mCitrino em células através de excitação mCitrino e cubo de filtro de emissão. Além disso, verifique se há alterações morfológicas das células infectadas, como células/núcleos aumentados (Figura 1A-C).
    8. Novamente, verifique as células 72 h após a infecção. Normalmente, as células começam a se desprender da superfície (Figura 2).
    9. Se >5% das células se desprenderem da superfície, colha o meio com células infectadas em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL e gire por 5 min a 500 x g.
    10. Recolher o sobrenadante e as alíquotas de congelamento instantâneo de 1 ml em azoto líquido e armazenar como stock de P0 a -80 °C ou utilizá-lo para gerar o stock de vírus P1.
  2. Geração de estoque do vírus P1
    1. Para amplificar ainda mais o estoque de baculovírus P0 e confirmar a expressão de proteínas, cultive células Sf9 em cultura de suspensão líquida.
    2. Num balão cónico estéril de 100 ml, adicionar 10 ml de meio Sf-900/SFM com uma densidade celular de 2 x 106 células/ml e 1 ml de stock do vírus P0. Incubar a 28 °C com agitação constante a 90 rpm.
    3. Após 72 h de infecção, verificar a expressão proteica conforme descrito anteriormente (etapa 1.1.7). Se a expressão da proteína for boa (>90% das células mostram um sinal de fluorescência mCitrino brilhante) e mostra morte celular significativa (aproximadamente 10%-15%), gire as células para baixo em um tubo cônico estéril de 15 mL a 500 x g por 5 min.
    4. Recolher o sobrenadante, alíquotas de congelamento instantâneo de 1 ml (reservado de P1) em azoto líquido e conservar a -80 °C ou proceder a infecção em larga escala e purificação de proteínas.
  3. Infecção em larga escala
    1. Para a expressão proteica em larga escala, infectar 30 mL da cultura de suspensão a 2 x 106 células/mL de densidade com 1 mL de estoque do vírus P1 e incubar a 28 °C com agitação constante a 90 rpm.
    2. Após ~ 72 h pós-infecção, verifique a expressão da proteína (em geral, a expressão máxima de proteína é alcançada entre 65-75h pós-infecção).
    3. Se >90% das células apresentarem um sinal fluorescente brilhante com morte celular mínima (<5%), recolher as células num tubo cónico estéril de 50 ml e girar para baixo a 500 x g a 4 °C durante 15 minutos.
      NOTA: Deve haver morte celular mínima (<5%), porque as células mortas liberam o conteúdo celular no meio, o que leva à perda de proteína expressa.
    4. Descarte o sobrenadante, colete o pellet celular e prossiga com a purificação da proteína.

2. Sf9 purificação de motores de cinesina-3

  1. Ao pellet celular acima, adicione 3 mL de tampão de lise gelada (Tabela Suplementar 1) recém-suplementado com DTT de 5 mM, 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina e 5 μg/mL de PMSF e lise as células pipetando 20-25 vezes sem gerar bolhas de ar. Para todas as composições de tampão e reagentes, consultar o Quadro Suplementar 1.
  2. Gire o lisado celular a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  3. Recolha o sobrenadante num tubo fresco e estéril e misture com ~40 μL de resina de afinidade 50% anti-FLAG M2. Incubar a mistura durante 3 h a 4 °C com tombo de ponta a ponta.
  4. Após incubação, pellet a resina FLAG girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C. Aspirar suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet com uma agulha de 26 G e descartar.
  5. Lave o pellet de resina FLAG três vezes com tampão de lavagem gelada (Tabela Suplementar 1) recém-suplementado com 2 mM de TDT, 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina e 5 μg/mL de PMSF. Pellet as contas girando a 500 x g durante 1 min a 4 °C em cada lavagem.
  6. Após a terceira lavagem, escorra cuidadosamente o tampão de lavagem o máximo possível sem perturbar o pellet. Para a eluição da proteína, adicionar ~70 μL de tampão de lavagem contendo 100 μg/mL de peptídeo FLAG ao pellet de resina e incubar durante a noite a 4 °C com tombo de ponta a ponta.
  7. No dia seguinte, girar a resina a 500 x g durante 1 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante contendo proteína purificada num tubo fresco e suplemente com 10% de glicerol. Fixar alíquotas de congelação de 5 μL em azoto líquido e conservar a -80 °C até nova utilização.
  8. Execute o gel SDS-PAGE para determinar a concentração e o rendimento da proteína. Juntamente com a proteína purificada de interesse, um controle proteico padrão, BSA de concentrações conhecidas variando de 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg e 1 μg são carregadas para gerar uma curva padrão. Coloração do gel com Coomassie Brilliant blue (Figura 3).
  9. Analise o gel usando uma ferramenta de quantificação de gel integrada no software ImageJ. Primeiro, meça a intensidade da banda das concentrações conhecidas de BSA e gere a curva padrão. Em seguida, meça a intensidade da banda de proteína purificada e determine a concentração de proteína. Para fazer isso, abra o software Image J, clique na opção Analisar na barra de menus e selecione Géis no menu suspenso.

3. Ensaio de motilidade de molécula única in vitro usando motores de cinesina-3 purificados por Sf9

NOTA: Os motores de cinesina-3 purificados com Sf9 podem ser usados para estudar propriedades bioquímicas e biofísicas, como taxa de rotatividade de ATP, afinidade de microtúbulos, velocidade, comprimento de execução, tamanho do passo e geração de força. Aqui, um protocolo detalhado para análise de motilidade de molécula única in vitro de KIF1A(1-393LZ) usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é descrito. Para toda a composição e reagentes de tampões, consulte o Quadro Suplementar 1.

  1. Polimerização de microtúbulos
    1. Em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 0,5 mL, preparar uma mistura de polimerização por pipetagem na seguinte ordem: 12,0 μL de tampão BRB80, pH 6,9; 0,45 μL de 100 mM MgCl2, 1 μL de 25 mM GTP.
    2. Retirar uma alíquota de 10 μL de 10 mg/mL de tubulina armazenada em nitrogênio líquido, descongelar imediatamente e adicionar à mistura de polimerização acima. Misture suavemente pipetando 2-3 vezes sem criar bolhas de ar.
      NOTA: Execute as etapas acima de forma rápida e rigorosa no gelo.
    3. Deixe a mistura acima descansar no gelo por 5 min.
      NOTA: Este é um passo crítico para evitar a desnaturação da tubulina ou para evitar a formação de sementes de microtúbulos curtos.
    4. Transferir o tubo para um bloco de calor/banho-maria pré-aquecido a 37 °C e incubar durante 30 min para polimerização dos microtúbulos.
    5. Enquanto os microtúbulos estão polimerizando, descongele uma alíquota do tampão P12 e leve-a à temperatura ambiente.
    6. Antes de completar 30 minutos de incubação, comece a preparar o tampão de estabilização MT pipetando 100 μL de tampão P12 em um tubo de microcentrífuga fresco. Para isso, adicione 1 μL de taxol de 1 mM e imediatamente vórtice a mistura.
      NOTA: Comece a preparar o tampão de estabilização MT aproximadamente 5 min antes de concluir a incubação na etapa 3.1.4. O taxol estabiliza os microtúbulos polimerizados ligando-se à β-tubulina.
    7. Aqueça o tampão de estabilização de microtúbulos por 2-3 min a 37 °C e adicione-o suavemente aos microtúbulos polimerizados sem perturbar a mistura de polimerização no fundo.
      NOTA: O aquecimento do tampão de estabilização o levará à mesma temperatura que a mistura de polimerização.
    8. Não bata nem pipete a mistura e incube ainda mais a 37 °C durante 5 minutos.
    9. Bata suavemente na mistura e misture-a com uma ponta de corte chanfrada (capacidade de 200 μL) lentamente usando a pipeta.
      NOTA: A partir deste ponto, manuseie sempre os microtúbulos com uma ponta de corte chanfrada para evitar o cisalhamento dos microtúbulos.
    10. Tome 10-15 μL de microtúbulos polimerizados em uma célula de fluxo para verificar a polimerização adequada dos microtúbulos.
      NOTA: Pode-se visualizar os microtúbulos não rotulados usando uma configuração de microscopia DIC.
    11. Se os microtúbulos estiverem concentrados, dilua-os em tampão P12 suplementado com taxol de 10 μM.
  2. Preparação da câmara celular de fluxo de motilidade
    1. Prepare uma câmara de motilidade usando uma lâmina de vidro, fita dupla face e tampa de vidro (22 mm x 30 mm).
    2. Pegue uma lâmina de vidro, coloque uma gota (~ 70 μL) de água destilada deionizada no meio e limpe-a com um papel de seda sem fiapos.
    3. Corte duas tiras de fita dupla face (~35 x 3 mm) e cole-as firmemente à lâmina de vidro paralelamente, deixando uma lacuna de ~4-5 mm entre duas tiras para criar uma passagem estreita.
    4. Em seguida, pegue uma tampa e adicione uma gota (~ 20 μL) de água destilada deionizada no meio. Coloque uma tira de papel de seda de limpeza de lentes sem fiapos na gota de água até que ela absorva a água. Em seguida, deslize-o lentamente em direção a uma extremidade da tampa.
      NOTA: A tampa deve estar completamente seca. Nenhuma água deve ser visível na tampa.
    5. Coloque a tampa nas tiras de dupla face presas no slide e pressione a tampa uniformemente ao longo das tiras para grudar firmemente.
      NOTA: Certifique-se de que o lado limpo da tampa está virado para a lâmina de vidro.
    6. Certifique-se de que, juntos, isso crie uma câmara estreita de capacidade de 10-15 μL para realizar o ensaio de motilidade (Figura 4A).
  3. Ensaio de motilidade de molécula única in vitro
    NOTA: Para estudar as propriedades de motilidade de molécula única baseadas em microtúbulos de motores, os microtúbulos precisam ser adsorvidos na superfície de deslizamento da cobertura na câmara de motilidade.
    1. Diluir os microtúbulos estabilizados com taxol polimerizados em tampão P12 suplementado com taxol de 10 μM nas proporções de 1:5 e misturar pipetando lentamente com uma ponta chanfrada.
    2. Mantenha a câmara de fluxo em uma posição inclinada (~ 15-20 °). Fluir 30 μL de solução de microtúbulos diluída através da câmara de fluxo da extremidade superior, mantendo um papel de seda sem fiapos na extremidade inferior para absorver o líquido. Isso cria uma força de cisalhamento para alinhar o microtúbulo na direção do fluxo e ajuda a adsorver os microtúbulos retos e alinhar paralelamente.
    3. Deixe uma pequena gota de líquido em ambas as extremidades da câmara e mantenha a célula de fluxo em uma posição invertida (tampa voltada para o fundo) em uma câmara fechada e úmida para evitar a secagem da câmara de motilidade.
    4. Deixe descansar por ~ 30 minutos para que os microtúbulos adsorvam a superfície da tampa dentro da câmara de motilidade.
    5. Enquanto isso, prepare o buffer de bloqueio misturando o buffer P12-BSA de 500 μL com 5 μL de taxol de 1 mM.
    6. Vazar 40-50 μL de tampão de bloqueio e incubar a lâmina em posição invertida por 10 min em câmara úmida.
    7. Preparar a mistura de motilidade pipetando os seguintes componentes num tubo de microcentrífuga estéril com capacidade de 500 μL pela seguinte ordem: 25 μL de tampão P12 com taxol, 0,5 μL de 100 mM de MgCl2, 0,5 μL de 100 mM de TDT, 0,5 μL de 20 mg/ml de glicose oxidase, 0,5 μL de 8 mg/ml de catalase, 0,5 μL de 2,25 M de Glicose e 1,0 μL de 100 mM de ATP.
      NOTA: A imagem por fluorescência tem sido amplamente utilizada para aplicações biológicas 22,23,24,25,26. A fotoexcitação de proteínas fluorescentes gera espécies reativas de oxigênio (EROs), que podem causar fotobranqueamento das proteínas fluorescentes e danos às amostras biológicas27,28. Sequestradores de oxigênio, como glicose, glicose oxidase e catalase, são rotineiramente usados em ensaios de motilidade para limitar o fotodano e prolongar o tempo de branqueamento de proteínas fluorescentes.
    8. Finalmente, adicione 1 μL do motor purificado à mistura de motilidade acima e misture bem antes de fluir para a câmara de motilidade.
    9. Sele ambas as extremidades da câmara de motilidade com cera de parafina líquida e imediatamente a imagem sob iluminação TIRF usando a objetiva TIRF 100X de 1,49 NA com ampliação de 1,5x.
    10. Para focar a superfície da tampa, primeiro, concentre-se em uma das bordas internas da fita dupla face na câmara de motilidade sob iluminação de contraste de interferência diferencial (DIC).
      NOTA: A superfície brilhante e irregular será visível.
    11. Em seguida, mova o foco para a câmara de motilidade. Usando um ajuste fino, foque a superfície da tampa e procure os microtúbulos adsorvidos na superfície da tampa.
    12. Uma vez que os microtúbulos estejam focados, mude para a iluminação TIRF com um laser de excitação de 488 nm e ajuste a profundidade de iluminação alterando o ângulo do feixe de excitação para obter a melhor e mais uniforme iluminação TIRF (Figura 4B).
    13. Foque os motores individuais marcados com mCitrino movendo-se processivamente ao longo da superfície dos microtúbulos com exposição de 100 ms e registre o movimento usando uma câmera EM-CCD.
      NOTA: Embora os ensaios de motilidade tenham sido realizados em microtúbulos não marcados, a função de projeção z de intensidade máxima pode ser usada para revelar o contorno da trilha de microtúbulos. Preferencialmente, eventos em longas trilhas de microtúbulos foram considerados para análise de rastreamento.
    14. Rastreie manualmente a posição dos motores individuais marcados fluorescentemente andando em longas trilhas de microtúbulos quadro a quadro usando um plug-in personalizado no software ImageJ (nih.gov), conforme descrito anteriormente29.
    15. Gere os histogramas de velocidade e comprimento de execução para a população motora plotando o número de eventos em cada bin. Ajuste esses histogramas a uma única função de pico gaussiana para obter velocidade média e comprimento de execução12 (Figura 4C-E).

4. Ensaio de deslizamento de microtúbulos in vitro

NOTA: Para compreender o comportamento coletivo dos motores de cinesina-3, foi realizado ensaio in vitro de deslizamento de microtúbulos 18,30,31. Quando os motores são imobilizados na tampa em uma posição invertida e após a adição de microtúbulos na câmara, os microtúbulos pousam nos motores e deslizam enquanto os motores tentam andar sobre eles (Figura 5A,B).

  1. Polimerização de microtúbulos fluorescentes: Polimerizar os microtúbulos seguindo o protocolo descrito anteriormente, exceto para a mistura de tubulina marcada com rodamina (3 mg/mL) com tubulina não marcada (10 mg/mL) na proporção de 1:10.
  2. Após 30 min de polimerização, adicionar suavemente 30 μL de tampão de estabilização de microtúbulos pré-aquecido e incubar ainda mais por 5 min a 37 °C.
  3. Em seguida, cisalhamento dos microtúbulos pipetando com a ponta de carga capilar (~ 25-30 vezes).
  4. Preparar a câmara de fluxo de motilidade conforme descrito anteriormente, vazar 50 μL de nanocorpos de GFP purificados com Sf9 (2,5 μL de 100 nM diluídos em 50 μL de tampão P12) e incubar por 30 min à temperatura ambiente com a cobertura voltada para baixo em uma câmara úmida.
    NOTA: Os motores são C-terminally marcados com mCitrino. Os nanocorpos de GFP são utilizados para imobilizar os motores devido à sua baixa constante de dissociação32.
  5. Bloqueie a superfície da tampa fluindo 50 μL de tampão de bloco para a câmara de fluxo para evitar a adsorção de proteínas inespecíficas e incube ainda mais por 5 min.
  6. Prepare a mistura do motor pipetando 50 μL de buffer de bloco, 1 μL de ATP de 100mM e 5 μL de motores de cinesina 3 purificados por Sf9 de 100 nM. Misture suavemente antes de fluir para a câmara e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida.
  7. Lavar a câmara duas vezes com 50 μL de caseína P12.
  8. Em um tubo de microcentrífuga estéril, preparar a mistura de ensaio de deslizamento na seguinte ordem, 45 μL de P12-caseína com taxol de 10 μM, 1 μL de ATP de 100 mM, 0,5 μL de 8 mg/mL de catalase, 0,5 μL de 20 mg/mL de glicose oxidase, 0,5 μL de glicose 2,25 M e 1 μL de microtúbulos fluorescentes cisalhados. Misture suavemente o conteúdo antes de fluir para a câmara de motilidade e sele as extremidades da câmara com cera de parafina líquida.
  9. Imagem microtúbulo deslizando sob iluminação TIRF a 100 ms de exposição e capturar as imagens com câmera EM-CCD conectada.
    NOTA: A velocidade média de deslizamento dos microtúbulos foi determinada pelo rastreamento manual de aproximadamente 100 microtúbulos individuais quadro a quadro usando um plug-in personalizado no ImageJ29. Determinar a velocidade média de deslizamento dos microtúbulos gerando um histograma e ajustando-se a uma função gaussiana (Figura 5C,D).

Resultados

Para expressar e purificar proteínas motoras recombinantes ativas e funcionais em larga escala usando a expressão do baculovírus Sf9, o sistema precisa da geração de partículas virais carregando de forma estável uma sequência de codificação para infectar as células Sf9. Para isso, células Sf9 foram transfectadas com bacmida recombinante codificando KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Após 72 h, uma população significativa de células apresentou expressão de proteína verde fluorescente (mCitrino) com células e n...

Discussão

O sistema de expressão do baculovírus Sf9 é um dos métodos mais versáteis e bem-sucedidos para a produção de proteínas de alto rendimento 19,36,37. A capacidade de modificação pós-translacional das células Sf9 é altamente comparável ao sistema de mamíferos15. Uma desvantagem considerável do uso deste sistema é que ele é lento e sensível à contaminação. Uma das etapas mais críticas ?...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.

Agradecimentos

V.S. e P.S. agradecem à Prof. Kristen J. Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor, MI, EUA) e ao Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Índia) por seu apoio incondicional durante todo o estudo. P.S. agradece à Dra. Sivapriya Kirubakaran por seu apoio durante todo o projeto. V.S. reconhece o financiamento através do DBT (Subvenção n.º: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 e BT/RLF/Reentrada/45/2015) e do DST-SERB (Subvenção n.º: ECR/2016/000913). P.K.N reconhece o ICMR para financiamento (Subvenção nº 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconhece o financiamento do horário de verão (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S reconhece a irmandade do IIT Gandhinagar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

Referências

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Bioqu micaEdi o 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados