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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.

Résumé

Un environnement cellulaire complexe pose des défis pour l’analyse de la motilité d’une seule molécule. Cependant, les progrès des techniques d’imagerie ont amélioré les études sur une seule molécule et ont acquis une immense popularité dans la détection et la compréhension du comportement dynamique des molécules marquées par fluorescence. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour les études in vitro à molécule unique des moteurs de la famille kinesine-3 à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). La kinésine-3 est une grande famille qui joue un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires et physiologiques allant du transport intracellulaire de la cargaison à la division cellulaire en passant par le développement. Nous avons montré précédemment que les moteurs de kinésine-3 dimérique constitutivement actifs présentent une motilité rapide et superprocessive avec une affinité microtubule élevée au niveau de la molécule unique en utilisant des lysats cellulaires préparés par moteur exprimant dans des cellules de mammifères. Notre laboratoire étudie les moteurs kinésine-3 et leurs mécanismes de régulation à l’aide d’approches cellulaires, biochimiques et biophysiques, et de telles études nécessitent des protéines purifiées à grande échelle. L’expression et la purification de ces moteurs à l’aide de cellules de mammifères seraient coûteuses et prendraient beaucoup de temps, tandis que l’expression dans un système d’expression procaryote entraînerait une protéine significativement agrégée et inactive. Pour surmonter les limites posées par les systèmes de purification bactérienne et le lysat de cellules de mammifères, nous avons mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs. Les moteurs kinesin-3 sont marqués en C terminale avec des protéines fluorescentes 3-tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) qui fournissent des signaux améliorés et une diminution du photoblanchiment. L’analyse in vitro de la molécule unique et du glissement multimoteur des protéines purifiées Sf9 démontre que les moteurs kinésine-3 sont rapides et superprocessifs, comme nos études précédentes utilisant des lysats de cellules de mammifères. D’autres applications utilisant ces tests comprennent une connaissance détaillée des conditions oligomères des moteurs, des partenaires de liaison spécifiques parallèles aux études biochimiques et leur état cinétique.

Introduction

Un environnement cellulaire immensément encombré pose de nombreux défis dans le tri des protéines et des molécules destinées. Cette charge de travail intense d’organisation et de distribution spatio-temporelle des molécules dans le cytoplasme est facilitée par les moteurs moléculaires et les pistes cytosquelettiques. Les moteurs moléculaires sont les enzymes qui hydrolysent les monnaies énergétiques telles que l’ATP et utilisent cette énergie pendant la génération de mouvement et de force1. Sur la base de la similitude de la séquence d’acides aminés, les kinésines sont regroupées en 14 familles et malgré cette similitude, chaque moteur contribue de manière unique au fonctionnement d’une cellule. Les moteurs de la famille Kinesin-3 constituent l’un des plus importants, comprenant cinq sous-familles (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 et KIF28)2, associées à diverses fonctions cellulaires et physiologiques, y compris le transport des vésicules, la signalisation, la mitose, la migration nucléaire et le développement 3,4,5. L’altération de la fonction de transport de la kinésine-3 implique de nombreux troubles neurodégénératifs, anomalies du développement et maladies cancéreuses 6,7,8,9.

Des travaux récents ont démontré que les moteurs kinésine-3 sont des monomères mais subissent une dimérisation induite par la cargaison et entraînent une motilité rapide et superprocessive par rapport à la kinésineconventionnelle 10,11,12,13. Leur caractérisation biochimique et biophysique nécessite une grande quantité de protéines actives purifiées. Cependant, leur production dans le système d’expression procaryote a entraîné des moteurs inactifs ou agrégés, probablement en raison de machines de synthèse de protéines, de repliement et de modificationincompatibles 14,15,16,17,18. Pour contourner ces limitations et augmenter le rendement, nous avons ici mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs.

Le système d’expression du baculovirus utilise des lignées cellulaires d’insectes Sf9 comme système hôte pour l’expression de protéines recombinantes eucaryotes à haut débit19,20. Le baculovirus possède un puissant promoteur de polyèdrine qui aide à l’expression hétérologue des gènes et à la production de protéines recombinantes solubles17. En raison de son rapport coût-efficacité, de sa sécurité à manipuler et de sa grande quantité d’expression de protéines actives, il est devenu un outil puissant21. Pour exprimer une protéine d’intérêt, une étape clé consiste à générer un bacmide recombinant. Étant donné que les kits de génération de bacmide disponibles dans le commerce sont chers et que nous travaillerons avec plus d’échantillons, nous avons développé un protocole interne pour les inserts grands et petits de moteurs kinésine-3 dans les bacmides. Des moteurs kinésine-3 purifiés au Sf9 ont été utilisés pour caractériser in vitro les propriétés de glissement des microtubules monomoléculaires et multimoteurs à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Les moteurs sont marqués en C avec des molécules fluorescentes en tandem 3 (3xmCit) pour fournir un signal amélioré et une diminution du photoblanchiment. En raison de son rapport signal/bruit accru, de sa phototoxicité moindre et de l’imagerie sélective d’une très petite zone proche de la lamelle de couverture, l’imagerie TIRF a été largement utilisée pour visualiser la dynamique des protéines au niveau d’une seule molécule in vivo et in vitro.

Cette étude traite de la purification des moteurs de kinésine-3 en utilisant le système d’expression du baculovirus Sf9 et l’imagerie in vitro d’une seule molécule et l’analyse de glissement multimoteur des moteurs à l’aide de la microscopie TIRF. Dans l’ensemble, cette étude montre que les propriétés de motilité des moteurs purifiés Sf9 sont identiques à celles des moteurs préparés à partir de lysats de cellules de mammifères. Par conséquent, nous pensons que le système Sf9-baculovirus peut être adapté pour exprimer et purifier toute protéine motrice d’intérêt.

Protocole

1. Culture Sf9, transfection et génération de virus

REMARQUE : Maintenir les cellules Sf9 dans 30 mL de milieu Sf-900/SFM dans 100 mL de fiole conique jetable stérile sans antibiotique/antimycotique à 28 °C. Conserver la culture de suspension dans un agitateur orbital à 90 tr/min. L’alimentation en CO2 et le maintien de l’humidité ne sont pas nécessaires. Les cellules sont habituellement sous-cultivées tous les quatre jours en inoculant 0,5 x 10 6 cellules/mL pour atteindre une densité de 2,0 x 106 cellules/mL le quatrième jour.

  1. Génération de stock de virus P0
    1. Pour la transfection, introduire les cellules de graines dans une boîte de 35 mm avec une confluence de 4,5 x 105 cellules/ml et maintenir à 28 °C sans agiter.
    2. Après 24 heures, une fois que les cellules sont attachées et semblent saines, procédez à la transfection comme décrit ci-dessous.
      1. Tube A : Mélanger 1 μg d’ADN bacmidique codant pour le moteur kinésine-3 spécifique KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG constitutifment actif avec 100 μL de milieux de Grace non supplémentés.
      2. Tube B : Mélanger 6 μL de réactif de transfection avec 100 μL de milieu de Grace non supplémenté.
      3. Transférer soigneusement le contenu du tube A dans le tube B et bien mélanger en tuytant de haut en bas (environ 20 fois).
      4. Incuber le mélange pendant ~45 min à température ambiante.
    3. Une fois l’incubation terminée, ajouter 0,8 mL de milieu de Grace non supplémenté au mélange ci-dessus et mélanger lentement par pipetage.
    4. Aspirer doucement le milieu Sf-900/SFM des cellules (pour éliminer toute trace de sérum susceptible d’affecter l’efficacité de la transfection).
    5. Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection de l’étape 1.1.3 sur le dessus des cellules et incuber la plaque pendant 6 h à 28 °C.
    6. Après l’incubation, retirer délicatement le mélange de transfection, ajouter 2 mL de milieu Sf-900/SFM et incuber pendant 48 h à 28 °C.
    7. Vérifiez l’expression de la protéine motrice au microscope à fluorescence inversée. La protéine motrice est marquée avec une protéine fluorescente, la mCitrine, une variante de la protéine fluorescente jaune.
      REMARQUE: Les cellules transfectées ont été visualisées sous un microscope inversé équipé d’un contraste interférentiel différentiel (DIC) et d’un éclairage par épifluorescence avec un objectif 20x (grossissement 200 fois), une lampe au mercure et une caméra EM-CCD. Vérifier l’efficacité de la génération de virus et de l’infection en surveillant l’expression des moteurs marqués à la mCitrine dans les cellules grâce à l’excitation mCitrine et au cube de filtre d’émission. De plus, vérifier les changements morphologiques des cellules infectées, telles que les cellules / noyaux élargis (Figure 1A-C).
    8. Encore une fois, vérifiez les cellules 72 h après l’infection. Habituellement, les cellules commencent à se détacher de la surface (Figure 2).
    9. Si >5 % des cellules se détachent de la surface, récoltez le milieu contenant des cellules infectées dans des tubes à microcentrifugeuses stériles de 1,5 mL et faites tourner pendant 5 min à 500 x g.
    10. Prélever les aliquotes surnageantes et congeler rapidement 1 mL dans de l’azote liquide et les conserver sous forme de P0 à -80 °C ou les utiliser pour générer du stock de virus P1.
  2. Génération de stock de virus P1
    1. Pour amplifier davantage le stock de baculovirus P0 et confirmer l’expression des protéines, cultivez des cellules Sf9 en culture de suspension liquide.
    2. Dans une fiole conique stérile de 100 mL, ajouter 10 mL de milieu Sf-900/SFM avec une densité cellulaire de 2 x 106 cellules/mL et 1 mL de souche de virus P0. Incuber à 28 °C en agitant constamment à 90 tr/min.
    3. Après 72 h d’infection, vérifier l’expression protéique décrite précédemment (étape 1.1.7). Si l’expression de la protéine est bonne (>90% des cellules montrent un signal de fluorescence mCitrine brillant) et montre une mort cellulaire significative (environ 10%-15%), faites tourner les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml à 500 x g pendant 5 min.
    4. Prélever le surnageant, congeler les aliquotes de 1 mL (stock P1) dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C ou procéder à une infection à grande échelle et à la purification des protéines.
  3. Infection à grande échelle
    1. Pour l’expression protéique à grande échelle, infecter 30 mL de la culture en suspension à une densité de 2 x 106 cellules/mL avec 1 mL de souche du virus P1 et incuber à 28 °C en agitant constamment à 90 tr/min.
    2. Après ~72 h post-infection, vérifiez l’expression protéique (en général, l’expression protéique maximale est atteinte entre 65 et 75h après l’infection).
    3. Si >90 % des cellules présentent un signal fluorescent brillant avec une mort cellulaire minimale (<5 %), recueillir les cellules dans un tube conique stérile de 50 ml et tourner vers le bas à 500 x g à 4 °C pendant 15 minutes.
      REMARQUE: Il devrait y avoir une mort cellulaire minimale (<5%), car les cellules mortes libèrent le contenu cellulaire dans le milieu, ce qui entraîne une perte de protéines exprimées.
    4. Jetez le surnageant, recueillez la pastille cellulaire et procédez à la purification des protéines.

2. Purification Sf9 des moteurs kinésine-3

  1. À la pastille cellulaire ci-dessus, ajouter 3 mL de tampon de lyse glacée (tableau supplémentaire 1) fraîchement complété avec 5 mM de DTT, 5 μg/mL d’aprotinine, 5 μg/mL de leupeptine et 5 μg/mL de PMSF et lyser les cellules en pipetant 20 à 25 fois sans générer de bulles d’air. Pour toutes les compositions tampons et les réactifs, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 1.
  2. Faites tourner le lysat cellulaire à 150 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
  3. Recueillir le surnageant dans un tube frais et stérile et mélanger avec ~40 μL de résine d’affinité M2 anti-FLAG à 50%. Incuber le mélange pendant 3 h à 4 °C avec un culbutage de bout en bout.
  4. Après incubation, pelleter la résine FLAG en la faisant tourner à 500 x g pendant 1 min à 4 °C. Aspirer doucement le surnageant sans déranger la pastille avec une aiguille de 26 G et jeter.
  5. Lavez la pastille de résine FLAG trois fois avec un tampon de lavage à froid glacé (tableau supplémentaire 1) fraîchement complété avec 2 mM de DTT, 5 μg/mL d’aprotinine, 5 μg/mL de leupeptine et 5 μg/mL de PMSF. Enduire les billes en les faisant tourner à 500 x g pendant 1 min à 4 °C à chaque lavage.
  6. Après le troisième lavage, égoutter soigneusement le tampon de lavage autant que possible sans déranger la pastille. Pour l’élution des protéines, ajouter ~70 μL de tampon de lavage contenant 100 μg/mL de peptide FLAG à la pastille de résine et incuber pendant une nuit à 4 °C avec un culbutage de bout en bout.
  7. Le lendemain, faire tourner la résine à 500 x g pendant 1 min à 4 °C. Recueillir le surnageant contenant des protéines purifiées dans un tube frais et compléter avec 10% de glycérol. Congeler des aliquotes de 5 μL dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
  8. Exécutez le gel SDS-PAGE pour déterminer la concentration et le rendement en protéines. En plus de la protéine purifiée d’intérêt, un témoin protéique standard, BSA de concentrations connues allant de 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg et 1 μg sont chargés pour générer une courbe standard. Teindre le gel avec Coomassie Brilliant blue (Figure 3).
  9. Analysez le gel à l’aide d’un outil de quantification de gel intégré dans le logiciel ImageJ. Tout d’abord, mesurer l’intensité de la bande des concentrations connues de BSA et générer la courbe standard. Ensuite, mesurez l’intensité de la bande de protéines purifiées et déterminez la concentration en protéines. Pour ce faire, ouvrez le logiciel Image J, cliquez sur l’option Analyser dans la barre de menu et sélectionnez Gels dans le menu déroulant.

3. Essai de motilité in vitro d’une seule molécule à l’aide de moteurs kinésine-3 purifiés au Sf9

REMARQUE: Les moteurs kinésine-3 purifiés Sf9 peuvent être utilisés pour étudier les propriétés biochimiques et biophysiques telles que le taux de renouvellement de l’ATP, l’affinité des microtubules, la vitesse, la longueur de l’exécution, la taille du pas et la génération de force. Ici, un protocole détaillé pour l’analyse in vitro de la motilité à molécule unique de KIF1A (1-393LZ) à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est décrit. Pour toute la composition des tampons et les réactifs, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 1.

  1. Polymérisation des microtubules
    1. Dans un tube microcentrifuge prérefroidi de 0,5 mL, préparer un mélange de polymérisation par pipetage dans l’ordre suivant : 12,0 μL de tampon BRB80, pH 6,9; 0,45 μL de 100 mM MgCl2, 1 μL de 25 mM GTP.
    2. Prélever une partie aliquote de 10 μL de tubuline à 10 mg/mL stockée dans de l’azote liquide, décongeler immédiatement et l’ajouter au mélange de polymérisation ci-dessus. Mélanger doucement en pipetant 2-3 fois sans créer de bulles d’air.
      REMARQUE: Effectuez les étapes ci-dessus rapidement et strictement sur la glace.
    3. Laissez le mélange ci-dessus reposer sur la glace pendant 5 minutes.
      NOTE: Il s’agit d’une étape critique pour empêcher la dénaturation de la tubuline ou pour éviter la formation de graines de microtubules courtes.
    4. Transférer le tube dans un bloc de chaleur / bain-marie préchauffé à 37 °C et incuber pendant 30 minutes pour la polymérisation des microtubules.
    5. Pendant que les microtubules polymérisent, décongelez une partie aliquote du tampon P12 et amenez-la à température ambiante.
    6. Avant d’avoir terminé 30 minutes d’incubation, commencez à préparer le tampon de stabilisation MT en pipetant 100 μL de tampon P12 dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. À cela, ajoutez 1 μL de taxol 1 mM et faites immédiatement tourbillonner le mélange.
      REMARQUE : Commencez à préparer le tampon de stabilisation MT environ 5 minutes avant de terminer l’incubation à l’étape 3.1.4. Le taxol stabilise les microtubules polymérisés en se liant à la β-tubuline.
    7. Réchauffer le tampon de stabilisation des microtubules pendant 2-3 min à 37 °C et l’ajouter doucement aux microtubules polymérisés sans perturber le mélange de polymérisation au fond.
      REMARQUE: Le réchauffement du tampon de stabilisation l’amènera à la même température que le mélange de polymérisation.
    8. Ne pas tapoter ou pipeter le mélange et incuber à 37 °C pendant 5 min.
    9. Tapotez doucement le mélange et mélangez-le avec une pointe de coupe biseautée (capacité de 200 μL) lentement à l’aide de la pipette.
      REMARQUE: À partir de ce moment, manipulez toujours les microtubules avec une pointe de coupe biseautée pour éviter le cisaillement des microtubules.
    10. Prendre 10-15 μL de microtubules polymérisés dans une cellule d’écoulement pour vérifier la polymérisation correcte des microtubules.
      REMARQUE: On peut visualiser les microtubules non marqués à l’aide d’une configuration de microscopie DIC.
    11. Si les microtubules sont concentrés, diluez-les dans un tampon P12 additionné de taxol 10 μM.
  2. Préparation de la chambre cellulaire d’écoulement de motilité
    1. Préparez une chambre motilité à l’aide d’une lame de verre, d’un ruban adhésif double face et d’une glissière de verre (22 mm x 30 mm).
    2. Prenez une lame de verre, placez une goutte (~70 μL) d’eau distillée désionisée au milieu et essuyez-la avec un papier de soie non pelucheux.
    3. Coupez deux bandes de ruban adhésif double face (~35 x 3 mm) et collez-les fermement à la lame de verre parallèlement, en laissant un espace de ~4-5 mm entre deux bandes pour créer un passage étroit.
    4. Ensuite, prenez un couvercle et ajoutez une goutte (~ 20 μL) d’eau distillée désionisée au milieu. Placez une bande de papier de soie de nettoyage de lentilles non pelucheux sur la goutte d’eau jusqu’à ce qu’elle absorbe l’eau. Ensuite, faites-le glisser lentement vers une extrémité du couvercle.
      REMARQUE: Le couvercle doit être complètement sec. Aucune eau ne doit être visible sur la lamelle de couverture.
    5. Placez le bordereau sur les bandes recto-verso collées sur la glissière et appuyez uniformément sur le bordereau de couverture le long des bandes pour coller fermement.
      REMARQUE: Assurez-vous que le côté nettoyé de la lamelle de couverture fait face à la lame de verre.
    6. Assurez-vous qu’ensemble, cela crée une chambre étroite d’une capacité de 10 à 15 μL pour effectuer un essai de motilité (figure 4A).
  3. Essai de motilité monomoléculaire in vitro
    REMARQUE: Pour étudier les propriétés de motilité à molécule unique à base de microtubules des moteurs, les microtubules doivent être adsorbés sur la surface de la lamelle de couverture dans la chambre de motilité.
    1. Diluer les microtubules polymérisés stabilisés au taxol dans un tampon P12 complété par du taxol 10 μM dans des rapports de 1:5 et mélanger en pipetant lentement avec une pointe biseautée.
    2. Maintenez la chambre d’écoulement en position oblique (~15-20°). Écoulez 30 μL de solution de microtubules dilués à travers la chambre d’écoulement à partir de l’extrémité supérieure tout en conservant un papier de soie non pelucheux à l’extrémité inférieure pour absorber le liquide. Cela crée une force de cisaillement pour aligner le microtubule dans la direction de l’écoulement et aide à adsorber les microtubules droits et à s’aligner parallèlement.
    3. Laissez une petite goutte de liquide aux deux extrémités de la chambre et maintenez la cellule d’écoulement en position inversée (glissement de couverture face au fond) dans une chambre fermée et humide pour éviter le dessèchement de la chambre de motilité.
    4. Laisser reposer pendant ~30 min pour que les microtubules s’adsorbent à la surface de la lamelle de couverture à l’intérieur de la chambre de motilité.
    5. En attendant, préparez le tampon de blocage en mélangeant 500 μL de tampon P12-BSA avec 5 μL de taxol 1 mM.
    6. Écoulez 40-50 μL de tampon de blocage et incuber la lame en position inversée pendant 10 min dans une chambre humide.
    7. Préparer le mélange de motilité en pipetant les composants suivants dans un tube de microcentrifugation stérile d’une capacité de 500 μL dans l’ordre suivant : 25 μL de tampon P12 avec taxol, 0,5 μL de 100 mM MgCl2, 0,5 μL de DTT 100 mM, 0,5 μL de 20 mg/mL de glucose oxydase, 0,5 μL de 8 mg/mL de Catalase, 0,5 μL de 2,25 M de glucose et 1,0 μL de 100 mM d’ATP.
      NOTE: L’imagerie par fluorescence a été largement utilisée pour des applications biologiques 22,23,24,25,26. La photoexcitation des protéines fluorescentes génère des espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui peuvent provoquer un photoblanchiment des protéines fluorescentes et endommager les échantillons biologiques27,28. Les piégeurs d’oxygène tels que le glucose, la glucose oxydase et la catalase sont couramment utilisés dans les tests de motilité pour limiter les photodommages et prolonger le temps de blanchiment des protéines fluorescentes.
    8. Enfin, ajoutez 1 μL du moteur purifié au mélange de motilité ci-dessus et mélangez bien avant de l’écouler dans la chambre de motilité.
    9. Scellez les deux extrémités de la chambre de motilité avec de la cire de paraffine liquide et imagez immédiatement sous éclairage TIRF en utilisant un objectif TIRF 100X de 1,49 NA avec un grossissement de 1,5x.
    10. Pour faire la mise au point de la surface de la lamelle de couverture, concentrez-vous d’abord sur l’un des bords intérieurs du ruban adhésif double face dans la chambre de motilité sous éclairage DIC (differential interference contrast).
      REMARQUE: La surface brillante et inégale sera visible.
    11. Ensuite, déplacez le foyer dans la chambre de motilité. À l’aide d’un réglage fin, concentrez la surface de la lamelle de couverture et recherchez les microtubules adsorbés sur la surface de la lamelle de couverture.
    12. Une fois les microtubules focalisés, passez à l’éclairage TIRF avec un laser d’excitation de 488 nm et ajustez la profondeur d’éclairage en modifiant l’angle du faisceau d’excitation pour obtenir le meilleur éclairage TIRF uniforme (figure 4B).
    13. Concentrez les moteurs individuels marqués mCitrine se déplaçant processivement le long de la surface du microtubule avec une exposition de 100 ms et enregistrez le mouvement à l’aide d’une caméra EM-CCD.
      REMARQUE: Bien que les essais de motilité aient été effectués sur des microtubules non marqués, la fonction de projection z d’intensité maximale peut être utilisée pour révéler le contour de la piste des microtubules. De préférence, les événements sur de longues traces de microtubules ont été pris en compte pour l’analyse de suivi.
    14. Suivez manuellement la position des moteurs individuels marqués par fluorescence marchant sur de longues pistes de microtubules image par image à l’aide d’un plug-in personnalisé écrit dans le logiciel ImageJ (nih.gov) comme décrit précédemment29.
    15. Générez les histogrammes de vitesse et de longueur d’exécution pour la population motrice en traçant le nombre d’événements dans chaque bac. Ajustez ces histogrammes à une seule fonction de pic gaussien pour obtenir la vitesse moyenne et la longueur d’exécution12 (Figure 4C-E).

4. Essai de vol plané in vitro sur microtubules

REMARQUE: Pour comprendre le comportement collectif des moteurs kinésine-3, un essai de vol plané in vitro sur microtubules a été effectué 18,30,31. Lorsque les moteurs sont immobilisés sur la lamelle de couverture en position inversée et lors de l’ajout de microtubules dans la chambre, les microtubules atterrissent sur les moteurs et glissent pendant que les moteurs tentent de marcher dessus (Figure 5A,B).

  1. Polymérisation des microtubules fluorescents : Polymériser les microtubules en suivant le protocole décrit précédemment, sauf pour mélanger la tubuline marquée à la rhodamine (3 mg/mL) avec la tubuline non marquée (10 mg/mL) dans un rapport de 1:10.
  2. Après 30 min de polymérisation, ajouter doucement 30 μL de tampon de stabilisation des microtubules préchauffé et incuber davantage pendant 5 min à 37 °C.
  3. Ensuite, cisaillez les microtubules en pipetant avec l’extrémité de charge capillaire (~25-30 fois).
  4. Préparer la chambre d’écoulement de motilité comme décrit précédemment, écouler 50 μL de nanocorps GFP purifiés Sf9 (2,5 μL de 100 nM dilués dans 50 μL de tampon P12) et incuber pendant 30 min à température ambiante avec la lamelle de couverture orientée vers le bas dans une chambre humide.
    REMARQUE: Les moteurs sont marqués C-terminally avec mCitrine. Les nanocorps GFP sont utilisés pour immobiliser les moteurs en raison de leur faible constante de dissociation32.
  5. Bloquer la surface de la glissière de recouvrement en faisant couler 50 μL de tampon bloc dans la chambre d’écoulement pour empêcher l’adsorption de protéines non spécifiques et incuber davantage pendant 5 minutes.
  6. Préparer le mélange de moteurs en pipetant 50 μL de tampon de bloc, 1 μL d’ATP 100 mM et 5 μL de moteurs kinésine-3 purifiés Sf9 de 100 nM. Mélanger doucement avant de couler dans la chambre et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humide.
  7. Lavez la chambre deux fois avec 50 μL de caséine P12.
  8. Dans un tube microcentrifuge stérile, préparer le mélange de dosage glissant dans l’ordre suivant, 45 μL de caséine P12 avec 10 μM de taxol, 1 μL d’ATP 100 mM, 0,5 μL de catalase 8 mg/mL, 0,5 μL de glucose oxydase 20 mg/mL, 0,5 μL de glucose 2,25 M glucose et 1 μL de microtubules fluorescents cisaillés. Mélanger délicatement le contenu avant de l’écouler dans la chambre de motilité et sceller les extrémités de la chambre avec de la cire de paraffine liquide.
  9. Microtubule d’image glissant sous l’éclairage TIRF à une exposition de 100 ms et capturez les images avec la caméra EM-CCD attachée.
    REMARQUE: La vitesse moyenne de glissement des microtubules a été déterminée en suivant manuellement environ 100 microtubules individuels image par image à l’aide d’un plug-in personnalisé dans ImageJ29. Déterminer la vitesse moyenne de glissement des microtubules en générant un histogramme et en l’ajustant à une fonction gaussienne (Figure 5C,D).

Résultats

Pour exprimer et purifier les protéines motrices recombinantes actives et fonctionnelles à grande échelle en utilisant l’expression du baculovirus Sf9, le système a besoin de générer des particules virales portant de manière stable une séquence codante pour infecter les cellules Sf9. Pour ce faire, les cellules Sf9 ont été transfectées avec du bacmide recombinant codant KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Après 72 h, une population importante de cellules a montré l’expression de la protéine fluorescente verte (...

Discussion

Le système d’expression du baculovirus Sf9 est l’une des méthodes les plus polyvalentes et les plus efficaces pour la production de protéines à haut débit 19,36,37. La capacité de modification post-traductionnelle des cellules Sf9 est très comparable à celle du système mammifère15. Un inconvénient considérable de l’utilisation de ce système est qu’il est lent et sensible à la contami...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer.

Remerciements

V.S. et P.S. remercient le Prof. Kristen J. Verhey (Université du Michigan, Ann Arbor, MI, USA) et le Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Inde) pour leur soutien inconditionnel tout au long de l’étude. P.S. remercie le Dr Sivapriya Kirubakaran pour son soutien tout au long du projet. V.S. reconnaît le financement par le biais de DBT (subvention n° : BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 et BT/RLF/Re-entry/45/2015) et DST-SERB (subvention n° : ECR/2016/000913). P.K.N remercie l’ICMR pour son financement (subvention n° 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconnaît le financement de DST (Numéro de subvention: SR / WOS-A / LS-73/2017). D.J.S reconnaît la bourse de l’IIT Gandhinagar.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

Références

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