Caracterización viscoelástica rápida del moco de las vías respiratorias utilizando un reómetro de sobremesa

Resumen

Las propiedades viscoelásticas del moco juegan un papel crítico en el aclaramiento mucociliar. Sin embargo, las técnicas reológicas tradicionales de moco requieren enfoques complejos y lentos. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el uso de un reómetro de sobremesa que puede realizar mediciones viscoelásticas de forma rápida y confiable.

Resumen

En las enfermedades pulmonares mucoobstructivas (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística) y otras afecciones respiratorias (por ejemplo, infecciones virales / bacterianas), las propiedades biofísicas del moco se ven alteradas por la hipersecreción de células caliciformes, la deshidratación de las vías respiratorias, el estrés oxidativo y la presencia de ADN extracelular. Estudios anteriores mostraron que la viscoelasticidad del esputo se correlacionaba con la función pulmonar y que los tratamientos que afectan la reología del esputo (por ejemplo, mucolíticos) pueden dar lugar a notables beneficios clínicos. En general, las mediciones reológicas de fluidos no newtonianos emplean enfoques elaborados y lentos (por ejemplo, reómetros paralelos / de placa cónica y / o seguimiento de partículas de microperlas) que requieren una capacitación extensa para realizar el ensayo e interpretar los datos. Este estudio probó la confiabilidad, reproducibilidad y sensibilidad de Rheomuco, un dispositivo de sobremesa fácil de usar que está diseñado para realizar mediciones rápidas utilizando oscilación dinámica con un barrido de cizallamiento para proporcionar módulos viscoelásticos lineales (G', G", G ^* y δ de bronceado) y características de punto de gel (γ_c y σ_c) para muestras clínicas dentro de los 5 minutos. El rendimiento del dispositivo se validó utilizando diferentes concentraciones de un simulante de moco, óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa, y contra mediciones reológicas a granel tradicionales. Luego se evaluó un aislado clínico extraído de un paciente intubado con estado asmático (SA) en mediciones por triplicado y el coeficiente de variación entre las mediciones es de <10%. El uso ex vivo de un potente agente reductor de moco, TCEP, en el moco SA resultó en una disminución de cinco veces en el módulo elástico y un cambio hacia un comportamiento más "líquido" en general (por ejemplo, un bronceado más alto δ). Juntos, estos resultados demuestran que el reómetro de sobremesa probado puede hacer mediciones confiables de la viscoelasticidad del moco en entornos clínicos y de investigación. En resumen, el protocolo descrito podría utilizarse para explorar los efectos de los fármacos mucoactivos (por ejemplo, rhDNasa, N-acetil cisteína) in situ para adaptar el tratamiento caso por caso, o en estudios preclínicos de nuevos compuestos.

Introducción

Las enfermedades mucoobstructivas de las vías respiratorias, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (FQ) y otras afecciones respiratorias, como la neumonía viral y bacteriana, son problemas de salud prevalentes en todo el mundo. Si bien la fisiopatología varía mucho entre cada afección, una característica clave común es el aclaramiento mucociliar anormal. En los pulmones sanos, el moco recubre el epitelio de las vías respiratorias para atrapar las partículas inhaladas y proporcionar una barrera física contra los patógenos. Una vez secretado, el moco de las vías respiratorias, compuesto de ~ 97.5% de agua, 0.9% de sal, ~ 1.1% de proteínas globulares y ~ 0.5% de mucinas, se transporta gradualmente hacia la glotis mediante el latido coordinado de^los cilios ^1,2. Las mucinas son grandes glicoproteínas ligadas a O que interactúan a través de enlaces no covalentes y covalentes para proporcionar las distintas propiedades viscoelásticas del moco, que se requieren para un transporte eficiente³. Los cambios en la ultraestructura de la red de mucina causados por el transporte de iones alterados, el despliegue de mucina, las interacciones electrostáticas, la reticulación o los cambios en la composición pueden afectar significativamente la viscoelasticidad del moco y afectar el aclaramiento mucociliar ^4,5. Por lo tanto, identificar cambios en las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias es esencial para comprender la patogénesis de la enfermedad y probar nuevos compuestos mucoactivos⁶.

Varios factores pueden conducir a la producción de moco aberrante en los pulmones. En la EPOC, la inhalación crónica de humo de cigarrillo desencadena la hipersecreción de moco como resultado de la metaplasia de células caliciformes, así como la deshidratación de las vías respiratorias a través de la regulación a la baja del canal regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), causando hiperconcentración de moco y pequeña obstrucción de las vías respiratorias ^7,8. Del mismo modo, la FQ, un trastorno genético asociado con mutaciones en el gen CFTR, se caracteriza por la producción de moco viscoso y adherente que es inadecuado para el transporte ^8,9. En resumen, la disfunción de CFTR induce el agotamiento del líquido de la superficie de las vías respiratorias, el entrelazamiento polimérico de la mucina y el aumento de las interacciones bioquímicas, que resultan en inflamación crónica e infecciones bacterianas. Además, las células inflamatorias atrapadas en el moco estático exacerban aún más la viscoelasticidad del moco al agregar otra molécula grande, el ADN, a la matriz del gel, empeorando la obstrucción de las vías respiratorias⁵. Uno de los mejores ejemplos de la importancia de la reología del moco en la salud general de los pulmones lo proporciona el ejemplo de la DNFase humana recombinante (rhDNasa) en el tratamiento de pacientes con fibrosis quística. Los efectos de la rhDNasa se demostraron por primera vez ex vivo sobre el esputo expectorado, que mostró una transición de moco viscoso a un líquido que fluye en cuestión de minutos^10,11. Los ensayos clínicos en pacientes con FQ demostraron que la reducción de la viscoelasticidad del moco de las vías respiratorias con la inhalación de rhDNasa disminuyó la tasa de exacerbaciones pulmonares y mejoró la función pulmonar y el bienestar general del paciente 12,13,14. Como resultado, la inhalación de rhDNasa destinada a facilitar el aclaramiento se convirtió en el estándar de atención para los pacientes con FQ durante más de dos décadas. Se observaron beneficios clínicos similares con el uso de solución salina hipertónica inhalada para la hidratación del moco en la FQ, que se correlacionó con cambios en las propiedades reológicas y dio lugar a la aceleración del aclaramiento mucociliar y a una mejora de la función pulmonar^15,16. Por lo tanto, un protocolo rápido y confiable para medir las propiedades viscoelásticas del moco en entornos clínicos es importante para optimizar los enfoques terapéuticos.

El reómetro de sobremesa probado aquí ofrece una alternativa rápida y conveniente para realizar mediciones viscoelásticas completas de muestras de moco / esputo. Utilizando oscilaciones dinámicas con desplazamiento angular controlado, el instrumento proporciona deformación a través de un par de placas paralelas ajustables (por ejemplo, geometrías rugosas o lisas) para medir el par y el desplazamiento con resoluciones de 15 nN^. m y 150 nm, respectivamente¹⁷. Una calibración estandarizada predeterminada combinada con pautas de usuario adaptadas para especialistas no reológicos permite mediciones sencillas y reduce el riesgo de errores del operador. El dispositivo produce una curva de barrido de deformación que se procesa y analiza en tiempo real (dentro de ~ 5 min) y proporciona automáticamente características viscoelásticas lineales (G', G", G ^* y δ bronceado) y de punto de gel (γ_c y σ_c) (consulte la Tabla 1). El módulo elástico o de almacenamiento (G') describe cómo responde una muestra a la tensión (es decir, la capacidad de volver a su forma original), mientras que el módulo viscoso o de pérdida (G") describe la energía disipada por ciclo de deformación sinusoidal (es decir, la energía perdida debido a la fricción de las moléculas). El módulo complejo o dinámico (G*) es la relación entre tensión y deformación, que describe la cantidad de acumulación de fuerza interna en respuesta a un desplazamiento de cizallamiento (es decir, las propiedades viscoelásticas generales). El factor de amortiguación (δ de bronceado) es la relación entre el módulo viscoso y el módulo elástico, que indica la capacidad de una muestra para disipar energía (es decir, un bronceado bajo δ indica un comportamiento elástico dominante / sólido, mientras que un bronceado alto δ indica un comportamiento viscoso dominante / líquido). Para las características del punto de gel, la deformación cruzada (γ_c) es la medida de la deformación de cizallamiento, calculada por la relación entre la trayectoria de deflexión y la altura del espacio de cizallamiento, en la que la muestra pasa de un comportamiento sólido a uno líquido y ocurre, por definición, en la tensión de oscilación donde G' = G" o bronceado δ = 1. La tensión de rendimiento cruzado (σ_c) es una medida de la cantidad de tensión aplicada por el dispositivo en el que se cruzan los módulos elásticos y viscosos. En sputa sana, la elasticidad domina la respuesta mecánica a la tensión (G' > G"). En las enfermedades mucoobstructivas, tanto G' como G" aumentan como consecuencia de cambios patológicos en el moco 17,18,19. La simplicidad operativa del dispositivo facilita las mediciones in situ y evita la necesidad de almacenamiento / transporte / envío de muestras a una instalación externa para su análisis, evitando así el tiempo y los efectos de congelación-descongelación en las propiedades de estas muestras biológicas.

En este estudio, se utilizaron soluciones de óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa de diferentes concentraciones (1%-3%) para validar el rango de medición de un reómetro de sobremesa comercial (Tabla de Materiales) y la curva dependiente de la concentración obtenida se comparó directamente con las mediciones adquiridas con un reómetro a granel tradicional (Tabla de Materiales). ). Luego se evaluó la repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando moco extraído broncoscópicamente de un paciente intubado que sufría de estado asmático (SA), una forma extrema de exacerbación del asma caracterizada por broncoespasmo, inflamación eosinofílica e hiperproducción de moco en respuesta a un agente ambiental o infeccioso ^8,20 . En este caso, el paciente con SA había sido intubado por insuficiencia respiratoria grave y requirió ECMO (oxigenación por membrana extracorpórea) debido a la incapacidad de apoyar al paciente de manera efectiva y segura con ventilación mecánica sola, a pesar de las agresivas terapias estándar para el asma. Durante una broncoscopia clínicamente indicada para el colapso lobar, se observó que las secreciones gruesas, claras y tenaces obstruían los bronquios lobares y se aspiraron mediante lavados salinos. Inmediatamente después de la recolección, se eliminó el exceso de solución salina del aspirado y se analizaron las propiedades viscoelásticas de la muestra de SA restante utilizando el dispositivo de sobremesa. Se trataron alícuotas de muestra adicionales con un agente reductor, tris (2-carboxiletil) clorhidrato de fosfina (TCEP), para determinar si este protocolo podría usarse para caracterizar la eficacia del compuesto terapéutico ex vivo.

Los resultados mostraron que este protocolo y el dispositivo de sobremesa se pueden utilizar de manera efectiva en un entorno clínico. Las propiedades reológicas determinadas a partir de curvas dependientes de la concentración de PEO (Figura 1A) fueron indistinguibles entre el dispositivo de sobremesa probado y un reómetro de placa paralelo tradicional (Figura 1B). Las mediciones triplicadas del moco SA fueron repetibles, con un coeficiente de variación del 10% para los criterios de valoración G*, G' y G" y reflejaron las anomalías sustanciales en la viscoelasticidad del moco que fueron clínicamente evidentes en el caso de este paciente (Figura 1D). Finalmente, el tratamiento ex vivo con TCEP resultó en una reducción significativa de G' y G", y un aumento en el bronceado δ, demostrando la capacidad de respuesta al tratamiento por alteraciones en la red de mucina (Figura 2). En conclusión, este protocolo que utiliza un reómetro de sobremesa proporciona un enfoque simple y efectivo para evaluar las propiedades viscoelásticas de las muestras de moco obtenidas de la clínica. Esta capacidad se puede utilizar para facilitar los enfoques de atención de la medicina de precisión, ya que los médicos pueden probar la eficacia de los medicamentos mucoactivos aprobados en el sitio, lo que puede ayudar a identificar opciones de tratamiento alternativas. Además, este enfoque se puede utilizar en ensayos clínicos para examinar los efectos de los fármacos en investigación.

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Protocolo

En el presente estudio, las muestras se recolectaron durante una broncoscopia clínicamente indicada después de obtener el consentimiento informado bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la UNC.

1. Recolección y almacenamiento de esputo /moco

1. Recolecte moco de las vías respiratorias a través de la recolección de esputo o la aspiración por broncoscopia.
   1. Recolectar esputo ya sea a través de expectoración espontánea o inducir esputo por inhalación salina hipertónica al 3%. Alternativamente, aspire directamente el moco de las vías respiratorias durante un procedimiento de broncoscopia.
   2. Guarde el esputo/moco de las vías respiratorias recolectado en tazas de muestra estériles. En el caso del esputo, retire el exceso de saliva de la muestra inmediatamente después de la recolección.
   3. Coloque las muestras en hielo para su transporte. Limite el tiempo de transporte a menos de 4 h.
2. Analizar las muestras en el momento de la recogida o almacenarlas a -80 °C hasta su procesado.
   1. Antes del almacenamiento, homogeneice el moco canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta de desplazamiento positivo o pipeta directamente en los tubos de la microcentrífuga.
   2. Alícuota las muestras para su almacenamiento en volúmenes ≥500 μL para garantizar un volumen suficiente para los experimentos.
      NOTA: La congelación y descongelación pueden afectar las propiedades viscoelásticas de la muestra. Solo compare muestras que se hayan sometido a ciclos de congelación/descongelación similares.

2. Preparación de la muestra

1. Pipetear sputa/moco fresco y congelado directamente u homogeneizar las muestras utilizando una pipeta de desplazamiento positivo canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces antes de la alícuota.
   NOTA: La homogeneización es importante para las muestras que contienen tapones gruesos que pueden afectar la reproducibilidad.
2. Alícuota 400-500 μL de la muestra en tubos de microcentrífuga separados. Preparar tantas alícuotas como sea necesario para repetir las mediciones y/o el tratamiento con reactivos farmacológicos (por ejemplo, rhDNasa, N-acetil cisteína). Incubar las alícuotas que se van a ensayar a 37 °C durante un mínimo de 5 min antes de la medición.
3. Para probar agentes farmacológicos (opcional), utilice altas concentraciones de soluciones madre para evitar la dilución de la muestra.
   1. Agregue entre 0.4% y 10% de volumen (para minimizar la dilución de la muestra) del reactivo deseado (por ejemplo, TCEP) directamente sobre la muestra. Asegúrese de que ninguna gota del compuesto permanezca en el lado del tubo.
   2. Incubar las muestras a 37 °C durante el tiempo deseado para permitir una reacción química (<1 h para evitar la degradación proteolítica del moco).
   3. Mezcle la muestra de moco y el reactivo moviendo la parte inferior del tubo de la microcentrífuga cada 2 minutos para permitir la penetración progresiva del reactivo en la muestra de moco sin comprometer la red de mucina (por ejemplo, imitando el latido ciliar y el aclaramiento mucociliar). Al comparar múltiples reactivos farmacológicos, asegúrese de que el tiempo de incubación sea similar.

3. Inicialización y calibración del instrumento

1. Encienda la máquina (Tabla de materiales) e inicialice el software.
2. Seleccione Nueva medición. Introduzca el número de identificación de la muestra en ID de medida y el nombre del operador en Operador para continuar. Introduzca información adicional o comentarios en Comentarios.
3. Seleccione un conjunto de geometría (es decir, placas paralelas de 25 mm rugosas o lisas) e inspeccione cuidadosamente las placas grandes y pequeñas para asegurarse de que las placas estén limpias y en perfectas condiciones).
   NOTA: Las placas rugosas están diseñadas para grandes volúmenes (350-500 μL) y las placas lisas están diseñadas para volúmenes más pequeños (250-350 μL). El uso de un volumen de muestra más bajo o más alto que el recomendado puede causar mediciones inexactas.
4. Inserte la placa grande firmemente en el púlpito inferior.
5. Inserte la placa pequeña suavemente en el púlpito superior y bloquee la placa girando ligeramente hasta escuchar un "clic", lo que indica que la placa está correctamente sujeta. Tenga en cuenta que la oscilación libre de la placa superior es normal.
6. Espere hasta que la temperatura alcance el valor objetivo de 37 °C. Luego, inicie la calibración automática según lo solicite el software.
   NOTA: No moleste la máquina o la superficie de la mesa de trabajo durante este proceso.

4. Carga de muestras

1. Usando una pipeta de desplazamiento positivo, pipetee lentamente entre 250 y 500 μL de la muestra en el centro de la placa inferior grande. Una vez depositadas en la placa, las muestras viscosas adoptarán una forma de cúpula, mientras que las muestras altamente elásticas pueden requerir un corte físico (use tijeras de disección).
   NOTA: Evite introducir burbujas de aire. Si es necesario, elimine las burbujas residuales empujando con una punta de pipeta.
2. Baje el cabezal de medición que transporta la placa pequeña a través del software y observe la muestra. Si se carga correctamente en la placa inferior, la muestra hará contacto y se centrará entre las dos placas.
3. Para asegurarse de que la muestra llena el espacio (es decir, extendiéndose a los bordes de las placas), utilice la función Reducir espacio hasta que la muestra ya no tenga forma bicóncava o esté alineada con el borde de las placas. La función Reducir brecha reduce el cabezal de medición en incrementos de 0,1 mm y se limita a siete incrementos.
   NOTA: Supervise la muestra cuidadosamente y ajuste el espacio progresivamente para evitar el derrame excesivo.
   1. Si queda un hueco después de siete incrementos, haga clic en Rehacer instalación para volver a la posición inicial y ajustar la posición y/o el volumen de la muestra.
   2. Si el espacio es extremadamente reducido (por ejemplo, forma biconvexa), retire el exceso de muestra con una espátula mediante un movimiento circular a lo largo del borde de la placa superior. Asegúrese de recortar el exceso de muestra suavemente para evitar el estrés por cizallamiento.
      NOTA: Al final de este paso, el borde de la muestra debe estar alineado con el borde de la placa superior como se muestra en las directrices del usuario.
4. Baje la cubierta protectora para evitar cualquier proyección accidental de fluidos contaminados durante la oscilación.

5. Iniciar la medición biofísica

1. Para iniciar la medición, haga clic en Iniciar análisis. Un ciclo completo tomará de 4 a 7 minutos.
   1. Evite hablar en voz alta y tocar el dispositivo o el banco durante toda la duración del ciclo. Un ambiente tranquilo es particularmente importante durante los primeros 2 minutos.
      NOTA: Durante el ciclo, el instrumento realiza una prueba estandarizada de barrido de deformación, que consiste en pasos oscilantes sucesivos. Cada paso es una serie de 10 oscilaciones a amplitud y frecuencia constantes (1 Hz), durante las cuales se mide el par correspondiente en tiempo real. Las señales de tensión y par permiten el cálculo de los módulos complejos (G*), elásticos (G') y viscosos (G"), así como la relación de amortiguación (bronceado δ) en cada paso. Las oscilaciones aumentan gradualmente en amplitud, lo que intensifica la deformación impuesta a la muestra.

6. Eliminación de muestras

1. Una vez completado el ciclo, haga clic en Siguiente para levantar el cabezal de medición y generar el informe de análisis de muestra.
   NOTA: Para el informe, el software calcula los datos registrados y grafica automáticamente dos curvas que muestran la evolución de los módulos viscosos y elásticos en relación con la deformación ejercida a la muestra y muestra el régimen viscoelástico lineal (es decir, una meseta a baja deformación) si está presente. Si no se detecta ningún régimen lineal, los valores de G', G", G* y δ bronceados se extraen a 0,05 cepas. Además, la tensión cruzada y la tensión de rendimiento (γ_c y σ_c) se calculan a δ de bronceado = 1. Los datos también se proporcionan en hojas de cálculo para cada paso para su posterior análisis.
2. Una vez que el cabezal de medición esté completamente retraído, levante la cubierta protectora, deseche la muestra y retire cuidadosamente las placas. Limpie y desinfecte los platos con agua tibia y jabón.
   NOTA: Seque bien el conjunto de geometría antes de repetirlo.

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Resultados

La Figura 1 muestra la precisión y repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando curvas dependientes de la concentración de control viscoelástico, es decir, solución de óxido de polietileno (PEO) y moco de estado asmático (SA). Las mediciones de las características viscoelásticas de 8 MDa PEO a cinco concentraciones diferentes (1%, 1,5%, 2%, 2,5% y 3%) se compararon directamente entre el reómetro de sobremesa evaluado y un reómetro a granel tradicional (Tabla de Ma...

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Discusión

Las propiedades viscoelásticas únicas del moco son esenciales para mantener las vías respiratorias sanas. Los factores internos y externos pueden alterar las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias, causando complicaciones clínicas características de las enfermedades mucoobstructivas. Por lo tanto, el monitoreo de los cambios en la viscoelasticidad del moco podría considerarse durante las evaluaciones del estado de la enfermedad y la exploración de terapias que reducen la viscoelasticidad del m...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.