Быстрая вязкоупругая характеристика слизи дыхательных путей с помощью настольного реометра

Резюме

Вязкоупругие свойства слизи играют решающую роль в мукоцилиарном клиренсе. Однако традиционные реологические методы слизи требуют сложных и трудоемких подходов. Это исследование предоставляет подробный протокол для использования настольного реометра, который может быстро и надежно выполнять вязкоупругие измерения.

Аннотация

При слизисто-обструктивных заболеваниях легких (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, муковисцидоз) и других респираторных заболеваниях (например, вирусные/бактериальные инфекции) биофизические свойства слизи изменяются гиперсекрецией бокаловидных клеток, обезвоживанием дыхательных путей, окислительным стрессом и присутствием внеклеточной ДНК. Предыдущие исследования показали, что вязкоупругость мокроты коррелирует с функцией легких и что лечение, влияющее на реологию мокроты (например, муколитики), может привести к замечательным клиническим преимуществам. В целом, реологические измерения неньютоновских жидкостей используют сложные, трудоемкие подходы (например, параллельные / конусно-пластинчатые реометры и / или отслеживание частиц микрогранул), которые требуют обширной подготовки для выполнения анализа и интерпретации данных. Это исследование проверило надежность, воспроизводимость и чувствительность Rheomuco, удобного для пользователя настольного устройства, которое предназначено для выполнения быстрых измерений с использованием динамических колебаний с сдвиговой деформацией для обеспечения линейных вязкоупругих модулей (G', G", G^* и δ загара) и характеристик точки геля (γ_c и σ_c) для клинических образцов в течение 5 минут. Производительность устройства была проверена с использованием различных концентраций имитатора слизи, полиэтиленоксида 8 МДа (PEO) и по сравнению с традиционными объемными реологическими измерениями. Клинический изолят, собранный у интубированного пациента с астматическим статусом (SA), затем оценивали в трех измерениях, и коэффициент вариации между измерениями составляет <10%. Использование ex vivo мощного агента, уменьшающего слизь, TCEP, на слизи SA привело к пятикратному снижению модуля упругости и изменению в сторону более «жидкого» поведения в целом (например, более высокий δ загара). Вместе эти результаты демонстрируют, что испытанный настольный реометр может надежно измерять вязкоупругость слизи в клинических и исследовательских условиях. Таким образом, описанный протокол может быть использован для изучения эффектов мукоактивных препаратов (например, rhDNase, N-ацетилцистеина) на месте для адаптации лечения в каждом конкретном случае или в доклинических исследованиях новых соединений.

Введение

Мукобструктивные заболевания дыхательных путей, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), муковисцидоз (МВ) и другие респираторные заболевания, такие как вирусная и бактериальная пневмония, являются распространенными проблемами со здоровьем во всем мире. В то время как патофизиология сильно варьируется между каждым состоянием, общей ключевой особенностью является аномальный мукоцилиарный клиренс. В здоровых легких слизь выстилает эпителий дыхательных путей, чтобы улавливать вдыхаемые частицы и обеспечивать физический барьер против патогенов. После секретирования слизь дыхательных путей, состоящая из ~ 97,5% воды, 0,9% соли, ~ 1,1% глобулярных белков и ~ 0,5% муцинов, постепенно транспортируется к голосовой щели путем скоординированного биения ресничек ^1,2. Муцины представляют собой большие O-связанные гликопротеины, которые взаимодействуют через нековалентные и ковалентные связи для обеспечения отчетливых вязкоупругих свойств слизи, которые необходимы для эффективного транспорта³. Изменения в ультраструктуре муциновой сети, вызванные измененным транспортом ионов, развертыванием муцина, электростатическими взаимодействиями, сшиванием или изменениями в составе, могут значительно влиять на вязкоупругость слизи и ухудшать мукоцилиарный клиренс ^4,5. Следовательно, выявление изменений в биофизических свойствах слизи дыхательных путей имеет важное значение для понимания патогенеза заболевания и тестирования новых мукоактивных соединений⁶.

Различные факторы могут привести к выработке аберрантной слизи в легких. При ХОБЛ хроническое вдыхание сигаретного дыма вызывает гиперсекрецию слизи в результате метаплазии бокаловидных клеток, а также обезвоживание дыхательных путей через понижающую регуляцию канала трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), вызывая гиперконцентрацию слизи и небольшую обструкцию дыхательных путей ^7,8. Аналогичным образом, CF, генетическое расстройство, связанное с мутациями в гене CFTR, характеризуется производством вязкой, адгезивной слизи, которая недостаточна для транспорта ^8,9. Короче говоря, дисфункция CFTR вызывает истощение жидкости на поверхности дыхательных путей, запутывание полимерного муцина и увеличение биохимических взаимодействий, что приводит к хроническому воспалению и бактериальным инфекциям. Кроме того, воспалительные клетки, захваченные в статическую слизь, еще больше усугубляют вязкоупругость слизи, добавляя еще одну большую молекулу, ДНК, в гель-матрицу, ухудшая обструкцию дыхательных путей⁵. Одним из лучших примеров важности реологии слизи для общего здоровья легких является пример рекомбинантной человеческой DNFase (rhDNase) при лечении пациентов с муковисцидозом. Эффекты rhDNase были впервые продемонстрированы ex vivo на отхаркивающуюся мокроту, которая показала переход от вязкой слизи к текучей жидкости в течение^10,11 минут. Клинические испытания у пациентов с муковисцидозом показали, что снижение вязкоупругости слизи дыхательных путей при вдыхании rhDNase снижает частоту легочных обострений и улучшает функцию легких и общее самочувствие пациента 12,13,14. В результате ингаляция rhDNase, направленная на облегчение клиренса, стала стандартом ухода за пациентами с муковисцидозом на протяжении более двух десятилетий. Аналогичные клинические преимущества наблюдались при использовании ингаляционного гипертонического физиологического раствора для гидратации слизи при муковисцидозе, что коррелировало с изменениями реологических свойств и приводило к ускорению мукоцилиарного клиренса и улучшению функции легких^15,16. Следовательно, быстрый и надежный протокол измерения вязкоупругих свойств слизи в клинических условиях важен для оптимизации терапевтических подходов.

Настольный реометр, протестированный здесь, предлагает быструю и удобную альтернативу для выполнения комплексных вязкоупругих измерений образцов слизи / мокроты. Используя динамические колебания с контролируемым угловым смещением, прибор обеспечивает деформацию с помощью пары регулируемых параллельных пластин (например, шероховатых или гладких геометрий) для измерения крутящего момента и смещения с разрешением 15 нН^. м и 150 нм соответственно¹⁷. Стандартизированная калибровка по умолчанию в сочетании с рекомендациями пользователя, адаптированными для специалистов, не являющихся реологами, позволяет проводить простые измерения и снижает риск ошибок оператора. Устройство создает кривую развертки деформации, которая обрабатывается и анализируется в режиме реального времени (в течение ~ 5 мин) и автоматически обеспечивает как линейные вязкоупругие (G', G", G^* и δ загара), так и точки геля (γ_c и σ_c) характеристики (см. Таблицу 1). Модуль упругости или накопления (G') описывает, как образец реагирует на напряжение (т.е. способность возвращаться к своей первоначальной форме), в то время как модуль вязкости или потерь (G") описывает энергию, рассеиваемую за цикл синусоидальной деформации (т.е. энергию, потерянную из-за трения молекул). Комплексный или динамический модуль (G*) — это отношение напряжения к деформации, которое описывает величину накопления внутренней силы в ответ на сдвиговое смещение (т. е. общие вязкоупругие свойства). Коэффициент демпфирования (тан δ) представляет собой отношение модуля вязкости к модулю упругости, что указывает на способность образца рассеивать энергию (т. Е. Низкий загар δ указывает на упруго-доминантное/твердое поведение, в то время как высокий δ загара указывает на вязко-доминантное/жидкостоподобное поведение). Для характеристик точки геля деформация кроссовера (γ_c) является мерой деформации сдвига, рассчитанной по отношению пути отклонения к высоте зазора сдвига, при которой образец переходит от твердого к жидкостоподобному поведению и возникает, по определению, при колебательной деформации, где G' = G" или загар δ = 1. Предел текучести кроссовера (σ_c) представляет собой меру величины напряжения, приложенного устройством, при котором пересекаются модули упругости и вязкости. У здоровой мокроты эластичность доминирует над механической реакцией на деформацию (G' > G). При слизисто-обструктивных заболеваниях как G', так и G" увеличиваются в результате патологических изменений слизи 17,18,19. Эксплуатационная простота устройства облегчает измерения на месте и позволяет обойти необходимость хранения/транспортировки/транспортировки/транспортировки проб на удаленный объект для анализа, что позволяет избежать воздействия времени и замораживания-оттаивания на свойства этих биологических образцов.

В этом исследовании для проверки диапазона измерений коммерческого настольного реометра (Таблица материалов) использовали 8 растворов полиэтиленоксида (ПЭО) различных концентраций (1%-3%), а полученную концентрационно-зависимую кривую непосредственно сравнивали с измерениями, полученными с помощью традиционного объемного реометра (Таблица материалов). ). Затем оценивали повторяемость реологических измерений с использованием бронхоскопически собранной слизи у интубированного пациента, страдающего астматическим статусом (SA), экстремальной формой обострения астмы, характеризующейся бронхоспазмом, эозинофильным воспалением и гиперпроизводством слизи в ответ на экологический или инфекционный агент ^8,20 . В этом случае пациент с СА был интубирован для тяжелой дыхательной недостаточности и нуждался в ЭКМО (экстракорпоральная мембранная оксигенация) из-за неспособности эффективно и безопасно поддерживать пациента только с помощью механической вентиляции, несмотря на агрессивные стандартные методы лечения астмы. Во время клинически показанной бронхоскопии для долькового коллапса были отмечены густые, прозрачные, цепкие выделения, обструктирующие дольковые бронхи и аспирированные с использованием солевых промываний. Сразу после сбора излишки физиологического раствора удаляли из аспирата, а вязкоупругие свойства оставшегося образца SA анализировали с помощью настольного устройства. Дополнительные образцы аликвот обрабатывали восстановителем, трис (2-карбоксилэтил)фосфингидрохлоридом (TCEP), чтобы определить, может ли этот протокол быть использован для характеристики эффективности терапевтического соединения ex vivo.

Результаты показали, что этот протокол и настольное устройство могут эффективно использоваться в клинических условиях. Реологические свойства, определяемые по кривым, зависящим от концентрации ПЭО (рисунок 1А), были неразличимы между испытанным настольным устройством и традиционным параллельным пластинчатым реометром (рисунок 1В). Тройные измерения слизи SA были повторяемыми, с 10% коэффициентом вариации для конечных точек G*, G' и G" и отражали существенные аномалии вязкоупругости слизи, которые были клинически очевидны в случае этого пациента (рисунок 1D). Наконец, лечение ex vivo TCEP привело к значительному снижению G' и G" и увеличению δ загара, демонстрируя реакцию на лечение изменениями в сети муцина (рисунок 2). В заключение, этот протокол с использованием настольного реометра обеспечивает простой и эффективный подход к оценке вязкоупругих свойств образцов слизи, полученных из клиники. Эта возможность может быть использована для облегчения подходов точной медицины к лечению, поскольку клиницисты могут проверить эффективность одобренных мукоактивных препаратов на месте, что может помочь определить альтернативные варианты лечения. Кроме того, этот подход может быть использован в клинических испытаниях для изучения эффектов исследуемых препаратов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В настоящем исследовании образцы были собраны во время клинически показанной бронхоскопии после получения информированного согласия в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом UNC.

1. Сбор и хранение мокроты/слизи

1. Сбор слизи дыхательных путей с помощью сбора мокроты или аспирации бронхоскопии.
   1. Собирайте мокроту либо с помощью спонтанного отхаркивания, либо индуцируйте мокроту путем 3% гипертонического физиологического раствора. В качестве альтернативы, непосредственно аспирировать слизь из дыхательных путей во время процедуры бронхоскопии.
   2. Храните собранную мокроту дыхательных путей / слизь в стерильных чашках для образцов. В случае мокроты удалите лишнюю слюну из образца сразу после сбора.
   3. Поместите образцы на лед для транспортировки. Ограничьте время транспортировки до менее 4 ч.
2. Анализируйте образцы во время сбора или храните при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут обработаны.
   1. Перед хранением гомогенизируйте слизь, осторожно пипетируя вверх и вниз три-пять раз пипеткой с положительным смещением или пипеткой непосредственно в трубки микроцентрифуги.
   2. Аликвотирование образцов для хранения в объемах ≥500 мкл для обеспечения достаточного объема для экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание и оттаивание могут повлиять на вязкоупругие свойства образца. Сравнивайте только образцы, которые прошли аналогичные циклы замораживания/оттаивания.

2. Пробоподготовка

1. Пипетки свежей и замороженной спута/слизи непосредственно или гомогенизируют образцы с использованием пипетки с положительным смещением, осторожно пипетируя вверх и вниз три-пять раз перед аликвотированием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация важна для образцов, содержащих толстые пробки, которые могут повлиять на воспроизводимость.
2. Аликвота 400-500 мкл образца в отдельные микроцентрифужные пробирки. Приготовьте столько аликвот, сколько необходимо для повторных измерений и/или лечения фармакологическими реагентами (например, rhDNase, N-ацетилцистеин). Инкубируйте аликвоты, подлежащие испытанию при температуре 37 °C, в течение не менее 5 минут до измерения.
3. Для тестирования фармакологических средств (необязательно) используют высокие концентрации стоковых растворов для предотвращения разбавления пробы.
   1. Добавьте от 0,4% до 10% объема (для минимизации разбавления образца) желаемого реагента (например, TCEP) непосредственно на образец. Убедитесь, что ни одна капля соединения не остается на боковой стороне трубки.
   2. Инкубируют образцы при 37 °C в течение желаемого периода времени, чтобы обеспечить химическую реакцию (<1 ч для предотвращения протеолитического разложения слизи).
   3. Смешайте образец слизи и реагента, щелкая нижней частью трубки микроцентрифуги каждые 2 мины, чтобы обеспечить прогрессирующее проникновение реагента в образец слизи без ущерба для муциновой сети (например, имитируя цилиарное биение и мукоцилиарный клиренс). При сравнении нескольких лекарственных реагентов убедитесь, что время инкубации одинаково.

3. Инициализация и калибровка прибора

1. Включите машину (Таблица материалов) и инициализируйте программное обеспечение.
2. Выберите Новое измерение. Введите идентификационный номер образца в поле Идентификатор меры и имя оператора в поле Оператор , чтобы продолжить. Введите дополнительную информацию или комментарии в разделе Комментарии.
3. Выберите набор геометрии (например, грубые или гладкие 25-миллиметровые параллельные пластины) и тщательно осмотрите большие и маленькие пластины, чтобы убедиться, что пластины чистые и находятся в идеальном состоянии).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Грубые пластины предназначены для больших объемов (350-500 мкл), а гладкие пластины предназначены для меньших объемов (250-350 мкл). Использование меньшего или большего объема образца, чем рекомендуется, может привести к неточным измерениям.
4. Плотно вставьте большую пластину на нижнюю кафедру.
5. Аккуратно вставьте небольшую пластину на верхнюю кафедру и зафиксируйте пластину, слегка повернув, пока не услышите «щелчок», который указывает на то, что пластина правильно зажата. Отметим, что свободное колебание верхней пластины является нормальным.
6. Подождите, пока температура не достигнет целевого значения 37 °C. Затем запустите автоматическую калибровку в соответствии с запросом программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойте поверхность машины или стола во время этого процесса.

4. Загрузка образца

1. Используя пипетку с положительным смещением, медленно пипетку между 250 и 500 мкл образца по центру большой нижней пластины. После нанесения на пластину вязкие образцы примут форму купола, тогда как высокоэластичные образцы могут потребовать физического разрыва (используйте рассекающие ножницы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков воздуха. При необходимости удалите остаточные пузырьки, отталкиваясь кончиком пипетки.
2. Опустите измерительную головку, несущую небольшую пластину с помощью программного обеспечения, и наблюдайте за образцом. При правильной загрузке на нижнюю пластину образец будет контактировать и центрироваться между двумя пластинами.
3. Чтобы убедиться, что образец заполняет зазор (т.е. путем распространения к краям пластин), используйте функцию Reduce Gap до тех пор, пока образец больше не будет иметь двояковыпуклую форму или не будет выровнен с краем пластин. Функция Reduce Gap понижает измерительную головку с шагом 0,1 мм и ограничена семью шагами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте образец и постепенно регулируйте зазор, чтобы избежать перелива.
   1. Если зазор остается после семи шагов, нажмите « Повторить установку», чтобы вернуться в исходное положение и отрегулировать положение и/или объем образца.
   2. Если зазор чрезмерно уменьшен (например, двояковыпуклая форма), удалите лишний образец шпателем круговым движением вдоль края верхней пластины. Обязательно аккуратно обрежьте лишний образец, чтобы избежать напряжения сдвига.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага край образца должен быть выровнен с краем верхней пластины, как показано в руководстве пользователя.
4. Опустите защитную крышку, чтобы избежать случайного выпадения загрязненных жидкостей во время колебаний.

5. Начало биофизического измерения

1. Чтобы начать измерение, нажмите кнопку Начать анализ. Полный цикл займет 4-7 мин.
   1. Избегайте громких разговоров и прикосновений к устройству или скамейке в течение всего цикла. Тихая обстановка особенно важна в течение первых 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение цикла прибор выполняет стандартизированное испытание на развертку деформации, которое состоит из последовательных колебательных ступеней. Каждый шаг представляет собой серию из 10 колебаний при постоянной амплитуде и частоте (1 Гц), во время которых соответствующий крутящий момент измеряется в режиме реального времени. Сигналы деформации и крутящего момента позволяют вычислять комплексный (G*), упругий (G') и вязкий (G") модули, а также коэффициент демпфирования (tan δ) на каждом шаге. Колебания постепенно увеличиваются в амплитуде, что усиливает деформацию, наложенную на образец.

6. Удаление образцов

1. После завершения цикла нажмите кнопку Далее , чтобы поднять измерительную головку и сгенерировать отчет об анализе образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для отчета программное обеспечение вычисляет записанные данные и автоматически строит графики двух кривых, показывающих эволюцию вязкости и модулей упругости по отношению к деформации, оказываемой на образец, и отображает линейный вязкоупругий режим (т.е. плато при низкой деформации), если таковой имеется. Если линейный режим не обнаружен, значения G', G", G* и δ загара извлекаются при деформации 0,05. Кроме того, деформация кроссовера и предел текучести (γ_c и σ_c) рассчитываются при δ загара = 1. Данные также предоставляются в электронных таблицах для каждого шага для дальнейшего анализа.
2. Как только измерительная головка будет полностью убрана, поднимите защитную крышку, выбросьте образец и аккуратно снимите пластины. Очистите и продезинфицируйте тарелки, используя теплую воду и мыло.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно высушите геометрию перед повторным использованием.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На фиг.1 показана точность и повторяемость реологических измерений с использованием концентрационно-зависимых кривых вязкоупругого контроля, т.е. раствора полиэтиленоксида (ПЭО) и состояния астматической (SA) слизи. Измерения вязкоупругих характеристик ПЭО 8 МДа при пят...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Уникальные вязкоупругие свойства слизи имеют важное значение для поддержания здоровья дыхательных путей. Внутренние и внешние факторы могут изменять биофизические свойства слизи дыхательных путей, вызывая клинические осложнения, характерные для мукобструктивных заболеваний. Следо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.