Caratterizzazione viscoelastica rapida del muco delle vie aeree utilizzando un reometro da banco

Riepilogo

Le proprietà viscoelastiche del muco svolgono un ruolo fondamentale nella clearance mucociliare. Tuttavia, le tecniche reologiche tradizionali del muco richiedono approcci complessi e dispendiosi in termini di tempo. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'uso di un reometro da banco in grado di eseguire in modo rapido e affidabile misurazioni viscoelastiche.

Abstract

Nelle malattie polmonari muco-ostruttive (ad esempio, asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, fibrosi cistica) e in altre condizioni respiratorie (ad esempio, infezioni virali / batteriche), le proprietà biofisiche del muco sono alterate dall'ipersecrezione delle cellule caliciformi, dalla disidratazione delle vie aeree, dallo stress ossidativo e dalla presenza di DNA extracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che la viscoelasticità dell'espettorato è correlata alla funzione polmonare e che i trattamenti che influenzano la reologia dell'espettorato (ad esempio, i mucolitici) possono portare a notevoli benefici clinici. In generale, le misurazioni reologiche di fluidi non newtoniani impiegano approcci elaborati e dispendiosi in termini di tempo (ad esempio, reometri paralleli / cone-plate e / o tracciamento delle particelle di microsfere) che richiedono una formazione approfondita per eseguire il test e interpretare i dati. Questo studio ha testato l'affidabilità, la riproducibilità e la sensibilità di Rheomuco, un dispositivo da banco di facile utilizzo progettato per eseguire misurazioni rapide utilizzando l'oscillazione dinamica con una sweep di taglio-deformazione per fornire moduli viscoelastici lineari (G', G", G ^* e δ di abbronzatura) e caratteristiche del punto gel (γ_c e σ_c) per campioni clinici entro 5 minuti. Le prestazioni del dispositivo sono state convalidate utilizzando diverse concentrazioni di un simulante di muco, 8 MDa ossido di polietilene (PEO) e rispetto alle tradizionali misurazioni di reologia di massa. Un isolato clinico prelevato da un paziente intubato con stato asmatico (SA) è stato quindi valutato in misurazioni triplicate e il coefficiente di variazione tra le misurazioni è <10%. L'uso ex vivo di un potente agente riducente del muco, TCEP, sul muco SA ha comportato una diminuzione di cinque volte del modulo elastico e un cambiamento verso un comportamento più "liquido" in generale (ad esempio, una maggiore δ di abbronzatura). Insieme, questi risultati dimostrano che il reometro da banco testato può effettuare misurazioni affidabili della viscoelasticità del muco in contesti clinici e di ricerca. In sintesi, il protocollo descritto potrebbe essere utilizzato per esplorare gli effetti dei farmaci mucoattivi (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina) in loco per adattare il trattamento caso per caso o in studi preclinici di nuovi composti.

Introduzione

Le malattie muco-ostruttive delle vie aeree, tra cui l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (FC) e altre condizioni respiratorie, come la polmonite virale e batterica, sono preoccupazioni per la salute prevalenti in tutto il mondo. Mentre la fisiopatologia varia notevolmente tra ogni condizione, una caratteristica chiave comune è la clearance mucociliare anormale. Nei polmoni sani, il muco allinea l'epitelio delle vie aeree per intrappolare le particelle inalate e fornire una barriera fisica contro gli agenti patogeni. Una volta secreto, il muco delle vie aeree, composto da ~ 97,5% di acqua, 0,9% di sale, ~ 1,1% di proteine globulari e ~ 0,5% di mucine, viene gradualmente trasportato verso la glottide dal battito coordinato delle ciglia ^1,2. Le mucine sono grandi glicoproteine legate all'O che interagiscono attraverso legami non covalenti e covalenti per fornire le distinte proprietà viscoelastiche del muco, che è necessario per un trasporto efficiente³. I cambiamenti nell'ultrastruttura della rete di mucina causati da alterato trasporto ionico, dispiegamento di mucina, interazioni elettrostatiche, reticolazione o cambiamenti nella composizione possono influenzare significativamente la viscoelasticità del muco e compromettere la clearance mucociliare ^4,5. Quindi, identificare i cambiamenti nelle proprietà biofisiche del muco delle vie aeree è essenziale per comprendere la patogenesi della malattia e testare nuovi composti mucoattivi⁶.

Vari fattori possono portare alla produzione di muco aberrante nei polmoni. Nella BPCO, l'inalazione cronica di fumo di sigaretta innesca l'ipersecrezione del muco a causa della metaplasia delle cellule caliciformi, così come la disidratazione delle vie aeree attraverso la downregulation del canale del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR), causando iperconcentrazione del muco e piccola ostruzione delle vie aeree ^7,8. Allo stesso modo, la FC, una malattia genetica associata a mutazioni nel gene CFTR, è caratterizzata dalla produzione di muco viscoso e aderente che è inadeguato per il trasporto ^8,9. In breve, la disfunzione CFTR induce l'esaurimento del liquido superficiale delle vie aeree, l'entanglement polimerico della mucina e l'aumento delle interazioni biochimiche, che provocano infiammazione cronica e infezioni batteriche. Inoltre, le cellule infiammatorie intrappolate nel muco statico esacerbano ulteriormente la viscoelasticità del muco aggiungendo un'altra grande molecola, il DNA, nella matrice del gel, peggiorando l'ostruzione delle vie aeree⁵. Uno dei migliori esempi dell'importanza della reologia del muco sulla salute generale dei polmoni è fornito dall'esempio della DNFase umana ricombinante (rhDNasi) nel trattamento dei pazienti con fibrosi cistica. Gli effetti della rhDNasi sono stati dimostrati per la prima volta ex vivo sull'espettorato espettorato, che ha mostrato una transizione dal muco viscoso a un liquido fluente entro^{pochi minuti 10,11}. Studi clinici in pazienti con FC hanno dimostrato che la riduzione della viscoelasticità del muco delle vie aeree con l'inalazione di rhDNasi ha ridotto il tasso di esacerbazioni polmonari e ha migliorato la funzione polmonare e il benessere generale del^{paziente 12,13,14}. Di conseguenza, l'inalazione di rhDNasi volta a facilitare la clearance è diventata lo standard di cura per i pazienti con FC per più di due decenni. Benefici clinici simili sono stati osservati con l'uso di soluzione salina ipertonica per via inalatoria per l'idratazione del muco nella FC, che è correlata con cambiamenti nelle proprietà reologiche e ha determinato un'accelerazione della clearance mucociliare e un miglioramento della funzione polmonare^15,16. Pertanto, un protocollo rapido e affidabile per misurare le proprietà viscoelastiche del muco in contesti clinici è importante per ottimizzare gli approcci terapeutici.

Il reometro da banco qui testato offre un'alternativa rapida e conveniente per eseguire misurazioni viscoelastiche complete di campioni di muco / espettorato. Utilizzando oscillazioni dinamiche con spostamento angolare controllato, lo strumento fornisce la deformazione tramite una coppia di piastre parallele regolabili (ad esempio, geometrie ruvide o lisce) per misurare la coppia e la cilindrata con risoluzioni di 15 nN^. m e 150 nm, rispettivamente¹⁷. Una calibrazione standardizzata predefinita combinata con le linee guida per l'utente adattate per gli specialisti non reologici consente misurazioni semplici e riduce il rischio di errori dell'operatore. Il dispositivo produce una curva di sweep di deformazione che viene elaborata e analizzata in tempo reale (entro ~ 5 minuti) e fornisce automaticamente sia le caratteristiche viscoelastiche lineari (G', G", G ^* e tan δ) che del punto gel (γ_c e σ_c) (vedere Tabella 1). Il modulo elastico o di stoccaggio (G') descrive come un campione risponde allo stress (cioè la capacità di tornare alla sua forma originale), mentre il modulo viscoso o di perdita (G") descrive l'energia dissipata per ciclo di deformazione sinusoidale (cioè l'energia persa a causa dell'attrito delle molecole). Il modulo complesso o dinamico (G*) è il rapporto tra sollecitazione e deformazione, che descrive la quantità di accumulo di forza interna in risposta a uno spostamento di taglio (cioè le proprietà viscoelastiche complessive). Il fattore di smorzamento (tan δ) è il rapporto tra il modulo viscoso e il modulo elastico, che indica la capacità di un campione di dissipare energia (cioè un basso tan δ indica un comportamento elastico-dominante / solido, mentre un alto tan δ indica un comportamento viscoso-dominante / liquido-simile). Per le caratteristiche del punto gel, la deformazione crossover (γ_c) è la misura della deformazione di taglio, calcolata dal rapporto tra il percorso di deflessione e l'altezza del gap di taglio, alla quale il campione passa da un comportamento simile a un solido a un comportamento simile a un liquido e si verifica, per definizione, a deformazione di oscillazione dove G' = G" o tan δ = 1. La tensione di snervamento crossover (σ_c) è una misura della quantità di sollecitazione applicata dal dispositivo a cui si incrociano i moduli elastici e viscosi. Nella sputa sana, l'elasticità domina la risposta meccanica allo sforzo (G' > G"). Nelle malattie muco-ostruttive, sia G' che G" aumentano a seguito di cambiamenti patologici del muco 17,18,19. La semplicità operativa del dispositivo facilita le misurazioni in loco ed elude la necessità di stoccaggio/trasporto/spedizione dei campioni a una struttura fuori sede per l'analisi, evitando così gli effetti di tempo e congelamento-disgelo sulle proprietà di questi campioni biologici.

In questo studio, 8 soluzioni di ossido di polietilene (PEO) MDa di diverse concentrazioni (1%-3%) sono state utilizzate per convalidare il campo di misura di un reometro da banco commerciale (Table of Materials) e la curva concentrazione-dipendente ottenuta è stata confrontata direttamente con le misurazioni acquisite con un reometro di massa tradizionale (Table of Materials ). La ripetibilità delle misurazioni reologiche è stata quindi valutata utilizzando muco raccolto per via broncoscopica da un paziente intubato affetto da stato asmatico (SA), una forma estrema di esacerbazione dell'asma caratterizzata da broncospasmo, infiammazione eosinofila e iperproduzione di muco in risposta a un agente ambientale o infettivo ^8,20 . In questo caso, il paziente SA era stato intubato per grave insufficienza respiratoria e aveva richiesto ECMO (ossigenazione extracorporea a membrana) a causa dell'incapacità di supportare il paziente in modo efficace e sicuro con la sola ventilazione meccanica, nonostante le aggressive terapie standard per l'asma. Durante una broncoscopia clinicamente indicata per il collasso lobare, secrezioni spesse, chiare e tenaci sono state notate per ostruire i bronchi lobari e sono state aspirate con lavaggi salini. Immediatamente dopo la raccolta, la soluzione salina in eccesso è stata rimossa dall'aspirato e le proprietà viscoelastiche del campione SA rimanente sono state analizzate utilizzando il dispositivo da banco. Ulteriori aliquote del campione sono state trattate con un agente riducente, tris (2-carbossiletil) fosfina cloridrato (TCEP), per determinare se questo protocollo potrebbe essere utilizzato per caratterizzare l'efficacia del composto terapeutico ex vivo.

I risultati hanno mostrato che questo protocollo e il dispositivo da banco possono essere utilizzati efficacemente in ambito clinico. Le proprietà reologiche determinate dalle curve dipendenti dalla concentrazione di PEO (Figura 1A) erano indistinguibili tra il dispositivo da banco testato e un reometro tradizionale a piastre parallele (Figura 1B). Le misurazioni triplicate del muco SA erano ripetibili, con un coefficiente di variazione del 10% per gli endpoint G*, G' e G" e riflettevano le anomalie sostanziali nella viscoelasticità del muco che erano clinicamente evidenti nel caso di questo paziente (Figura 1D). Infine, il trattamento ex vivo con TCEP ha comportato una significativa riduzione di G' e G" e un aumento dell'abbronzatura δ, dimostrando la reattività al trattamento mediante alterazioni della rete mucina (Figura 2). In conclusione, questo protocollo che utilizza un reometro da banco fornisce un approccio semplice ed efficace per valutare le proprietà viscoelastiche dei campioni di muco ottenuti dalla clinica. Questa capacità può essere utilizzata per facilitare gli approcci di medicina di precisione alla cura, in quanto i medici possono testare l'efficacia dei farmaci mucoattivi approvati in loco, che possono aiutare a identificare opzioni di trattamento alternative. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato negli studi clinici per esaminare gli effetti dei farmaci sperimentali.

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Protocollo

Nel presente studio, i campioni sono stati raccolti durante una broncoscopia clinicamente indicata dopo aver ottenuto il consenso informato in base a un protocollo approvato dal Comitato di revisione istituzionale dell'UNC.

1. Raccolta e conservazione dell'espettorato/muco

1. Raccogliere il muco delle vie aeree tramite la raccolta dell'espettorato o l'aspirazione per broncoscopia.
   1. Raccogliere l'espettorato tramite espettorazione spontanea o indurre l'espettorato per inalazione salina ipertonica al 3%. In alternativa, aspirare direttamente il muco dalle vie aeree durante una procedura di broncoscopia.
   2. Conservare l'espettorato/muco delle vie aeree raccolto in tazze di campioni sterili. Nel caso dell'espettorato, rimuovere la saliva in eccesso dal campione immediatamente dopo la raccolta.
   3. Posizionare i campioni sul ghiaccio per il trasporto. Limitare il tempo di trasporto a meno di 4 ore.
2. Analizzare i campioni al momento della raccolta o conservare a -80 °C fino alla lavorazione.
   1. Prima dello stoccaggio, omogeneizzare il muco tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta a spostamento positivo o una pipetta direttamente nei tubi del microcentrifuga.
   2. Aliquotare i campioni per la conservazione in volumi ≥500 μL per garantire un volume sufficiente per gli esperimenti.
      NOTA: il congelamento e lo scongelamento possono influire sulle proprietà viscoelastiche del campione. Confronta solo i campioni che hanno subito cicli di congelamento / disgelo simili.

2. Preparazione del campione

1. Pipettare direttamente sputa/muco fresco e congelato o omogeneizzare i campioni utilizzando una pipetta a spostamento positivo tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte prima dell'aliquotazione.
   NOTA: l'omogeneizzazione è importante per i campioni che contengono tappi spessi che possono influire sulla riproducibilità.
2. Aliquota 400-500 μL del campione in tubi microcentrifuga separati. Preparare tutte le aliquote necessarie per ripetere le misurazioni e/o il trattamento con reagenti farmacologici (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina). Incubare le aliquote da testare a 37 °C per un minimo di 5 minuti prima della misurazione.
3. Per testare gli agenti farmacologici (facoltativo), utilizzare alte concentrazioni di soluzioni stock per evitare la diluizione del campione.
   1. Aggiungere tra lo 0,4% e il 10% di volume (per ridurre al minimo la diluizione del campione) del reagente desiderato (ad esempio, TCEP) direttamente sul campione. Assicurarsi che nessuna goccia del composto rimanga sul lato del tubo.
   2. Incubare i campioni a 37 °C per il periodo di tempo desiderato per consentire una reazione chimica (<1 h per prevenire la degradazione proteolitica del muco).
   3. Mescolare il campione di muco e il reagente facendo scorrere il fondo della provetta di microcentrifuga ogni 2 minuti per consentire la progressiva penetrazione del reagente nel campione di muco senza compromettere la rete di mucina (ad esempio, imitando il battito ciliare e la clearance mucociliare). Quando si confrontano più reagenti farmacologici, assicurarsi che il tempo di incubazione sia simile.

3. Inizializzazione e calibrazione dello strumento

1. Accendere la macchina (Tabella dei materiali) e inizializzare il software.
2. Selezionare Nuova misurazione. Immettere il numero di identificazione del campione in ID misura e il nome dell'operatore in Operatore per continuare. Immettere ulteriori informazioni o commenti in Commenti.
3. Selezionare un set di geometrie (ad esempio, piastre parallele ruvide o lisce da 25 mm) e ispezionare attentamente piastre grandi e piccole per assicurarsi che le piastre siano pulite e in perfette condizioni).
   NOTA: le piastre ruvide sono progettate per grandi volumi (350-500 μL) e le piastre lisce sono progettate per volumi più piccoli (250-350 μL). L'utilizzo di un volume di campione inferiore o superiore a quello raccomandato può causare misurazioni imprecise.
4. Inserire saldamente la grande piastra sul pulpito inferiore.
5. Inserire delicatamente la piccola piastra sul pulpito superiore e bloccare la piastra ruotando leggermente fino a sentire un "clic", che indica che la piastra è correttamente bloccata. Si noti che l'oscillazione libera della piastra superiore è normale.
6. Attendere che la temperatura raggiunga il valore target di 37 °C. Quindi, avviare la calibrazione automatica come richiesto dal software.
   NOTA: non disturbare la macchina o la superficie del banco durante questo processo.

4. Caricamento del campione

1. Utilizzando una pipetta a spostamento positivo, pipettare lentamente tra 250 e 500 μL del campione al centro della grande piastra inferiore. Una volta depositati sulla piastra, i campioni viscosi adotteranno una forma a cupola, mentre i campioni altamente elastici possono richiedere il taglio fisico (utilizzare forbici per sezionare).
   NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria. Se necessario, rimuovere le bolle residue spingendo via con una punta di pipetta.
2. Abbassare la testa di misura che trasporta la piccola piastra tramite il software e osservare il campione. Se caricato correttamente sulla piastra inferiore, il campione entrerà in contatto e sarà centrato tra le due piastre.
3. Per garantire che il campione riempia lo spazio (ad esempio, diffondendosi ai bordi delle piastre), utilizzare la funzione Riduci spazio fino a quando il campione non è più in una forma biconcava o è allineato con il bordo delle piastre. La funzione Reduce Gap abbassa la testa di misura con incrementi di 0,1 mm ed è limitata a sette incrementi.
   NOTA: monitorare attentamente il campione e regolare progressivamente lo spazio per evitare sovraspole.
   1. Se rimane uno spazio vuoto dopo sette incrementi, fare clic su Ripeti installazione per tornare alla posizione iniziale e regolare la posizione e/o il volume del campione.
   2. Se lo spazio è eccessivamente ridotto (ad esempio, forma biconvessa), rimuovere il campione in eccesso con una spatola con un movimento circolare lungo il bordo della piastra superiore. Assicurarsi di tagliare delicatamente il campione in eccesso per evitare lo stress da taglio.
      NOTA: alla fine di questo passaggio, il bordo del campione deve essere allineato con il bordo della piastra superiore, come illustrato nelle linee guida per l'utente.
4. Abbassare il coperchio protettivo per evitare qualsiasi proiezione accidentale di fluidi contaminati durante l'oscillazione.

5. Avviare la misurazione biofisica

1. Per avviare la misurazione, fare clic su Avvia analisi. Un ciclo completo richiederà 4-7 minuti.
   1. Evitare di parlare ad alta voce e toccare il dispositivo o il banco durante l'intera durata del ciclo. Un ambiente tranquillo è particolarmente importante per i primi 2 minuti.
      NOTA: Durante il ciclo, lo strumento esegue una prova di deformazione standardizzata, che consiste in fasi oscillanti successive. Ogni passo è una serie di 10 oscillazioni ad ampiezza e frequenza costanti (1 Hz), durante le quali la coppia corrispondente viene misurata in tempo reale. I segnali di deformazione e coppia consentono il calcolo dei moduli complessi (G*), elastici (G') e viscosi (G"), nonché del rapporto di smorzamento (tan δ) ad ogni passo. Le oscillazioni aumentano gradualmente di ampiezza, il che intensifica la deformazione imposta al campione.

6. Rimozione del campione

1. Una volta completato il ciclo, fare clic su Avanti per sollevare la testa di misura e generare il rapporto di analisi del campione.
   NOTA: Per il report, il software calcola i dati registrati e rappresenta automaticamente due curve che mostrano l'evoluzione dei moduli viscosi ed elastici in relazione alla deformazione esercitata al campione e visualizza il regime viscoelastico lineare (cioè un plateau a bassa deformazione) se presente. Se non viene rilevato alcun regime lineare, i valori di G', G", G* e tan δ vengono estratti a 0,05 ceppi. Inoltre, la deformazione crossover e la tensione di snervamento (γ_c e σ_c) sono calcolate a tan δ = 1. I dati sono anche forniti in fogli di calcolo per ogni passaggio per ulteriori analisi.
2. Una volta che la testa di misurazione è completamente retratta, sollevare il coperchio protettivo, scartare il campione e rimuovere con cura le piastre. Pulire e disinfettare le piastre con acqua tiepida e sapone.
   NOTA: asciugare accuratamente la geometria impostata prima di un uso ripetuto.

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Risultati

La Figura 1 mostra l'accuratezza e la ripetibilità delle misurazioni reologiche utilizzando curve dipendenti dalla concentrazione del controllo viscoelastico, cioè soluzione di ossido di polietilene (PEO) e stato asmatico (SA) muco. Le misurazioni delle caratteristiche viscoelastiche di 8 MDa PEO a cinque diverse concentrazioni (1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%) sono state confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale (Table of Materials

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Discussione

Le proprietà viscoelastiche uniche del muco sono essenziali per mantenere le vie aeree sane. Fattori interni ed esterni possono alterare le proprietà biofisiche del muco delle vie aeree, causando complicanze cliniche caratteristiche delle malattie muco-ostruttive. Pertanto, il monitoraggio dei cambiamenti nella viscoelasticità del muco potrebbe essere preso in considerazione durante le valutazioni dello stato della malattia e l'esplorazione di terapie che riducono la viscoelasticità del muco. Studi empirici degli ann...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.