벤치탑 레오미터를 이용한 기도 점액의 신속한 점탄성 특성화

요약

점액의 점탄성 특성은 점액 제거에 중요한 역할을합니다. 그러나 전통적인 점액 유변학 기술은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 접근법이 필요합니다. 이 연구는 점탄성 측정을 신속하고 안정적으로 수행할 수 있는 벤치탑 레오미터의 사용에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

점막폐쇄성 폐 질환(예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭포성 섬유증) 및 다른 호흡기 상태(예를 들어, 바이러스/박테리아 감염)에서, 점액 생물물리학적 특성은 잔 세포 과분비, 기도 탈수, 산화 스트레스 및 세포외 DNA의 존재에 의해 변화된다. 이전의 연구는 가래 점탄성이 폐 기능과 상관 관계가 있으며 객담 유변학 (예 : 점막 용해제)에 영향을 미치는 치료법이 놀라운 임상 적 이점을 초래할 수 있음을 보여주었습니다. 일반적으로, 비뉴턴 유체의 유변학적 측정은 분석을 수행하고 데이터를 해석하기 위해 광범위한 훈련이 필요한 정교하고 시간이 많이 걸리는 접근법(예를 들어, 병렬/원뿔 플레이트 레오미터 및/또는 마이크로비드 입자 추적)을 사용한다. 이 연구는 5분 이내에 임상 샘플에 대해 선형 점탄성 모듈리(G', G", G^*, tan δ) 및 겔 포인트 특성(γ c 및 σ_c)을 제공하기 위해 전단 스트레인 스윕을 통해 동적 진동을 사용하여 신속한 측정을 수행하도록 설계된 사용자 친화적인 벤치탑 장치인 Rheomuco의 신뢰성, 재현성 및 감도를 테스트했습니다. 장치 성능은 점액 시뮬란트, 8 MDa 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO)의 상이한 농도를 사용하여 및 전통적인 벌크 유변학 측정에 대해 검증되었다. 상태 천식 (SA)을 가진 삽관 환자로부터 수확 된 임상 격리물을 세 배 측정으로 평가 한 다음 측정 간의 변동 계수는 <10 %입니다. SA 점액 상에서 강력한 점액 환원제인 TCEP의 생체외 사용은 탄성 모듈러스의 다섯 배 감소와 전체적으로 더 "액체-유사한" 거동(예를 들어, 더 높은 황갈색 δ)을 향한 변화를 가져왔다. 함께, 이러한 결과는 테스트 된 벤치 탑 레오미터가 임상 및 연구 환경에서 점액 점탄성의 신뢰할 수있는 측정을 할 수 있음을 보여줍니다. 요약하면, 기술된 프로토콜은 점막성 약물(예를 들어, rhDNase, N-아세틸 시스테인)의 효과를 사례별로 또는 신규한 화합물의 전임상 연구에서 사례별로 적응시키기 위해 현장에서 효과를 탐구하는데 사용될 수 있다.

서문

천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭포성 섬유증 (CF) 및 바이러스 성 및 세균성 폐렴과 같은 기타 호흡기 질환을 포함한 점막 폐쇄성 기도 질환은 전 세계적으로 널리 퍼진 건강 문제입니다. 병태생리학은 각 조건마다 크게 다르지만, 공통적인 주요 특징은 비정상적인 점막염 제거이다. 건강한 폐에서 점액은 기도 상피를 정렬하여 흡입 된 입자를 포획하고 병원균에 대한 물리적 장벽을 제공합니다. 일단 분비되면, ~97.5%의 물, 0.9%의 염, ~1.1%의 구상 단백질, 및 ~0.5%의 뮤신으로 구성된 기도 점액은 섬모 ^1,2의 조정된 박동에 의해 점차적으로 응고염 쪽으로 수송된다. 뮤신은 점액의 뚜렷한 점탄성 특성을 제공하기 위해 비공유 및 공유 결합을 통해 상호작용하는 큰 O-결합 당단백질이며, 이는 효율적인 수송을 위해 요구된다³. 변경된 이온 수송, 뮤신 언폴딩, 정전기적 상호작용, 가교결합, 또는 조성의 변화로 인한 뮤신 네트워크의 초구조의 변화는 점액 점탄성에 유의하게 영향을 미치고 점액 클리어런스를 손상시킬 수 있다^4,5. 따라서, 기도 점액의 생체물리학적 특성의 변화를 확인하는 것은 질병 병인을 이해하고 새로운 점액성 화합물⁶을 시험하는 데 필수적이다.

다양한 요인들이 폐에서 비정상적인 점액의 생성으로 이어질 수 있습니다. COPD에서 담배 연기의 만성 흡입은 잔 세포 형화의 결과로 점액 과다 분비뿐만 아니라 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 채널의 하향 조절을 통한 기도 탈수를 유발하여 점액 과다 농도 및 작은기도 폐색 ^7,8을 유발합니다. 유사하게, CFTR 유전자의 돌연변이와 관련된 유전 질환인 CF는 수송^8,9에 부적합한 점성^, 부착성 점액의 생성을 특징으로 한다. 간단히 말해서, CFTR 기능 장애는 기도 표면 액체 고갈, 고분자 뮤신 얽힘 및 생화학 적 상호 작용 증가를 유도하여 만성 염증 및 박테리아 감염을 초래합니다. 또한, 정적 점액에 갇힌 염증 세포는 겔 매트릭스에 또 다른 큰 분자인 DNA를 첨가함으로써 점액의 점탄성을 더욱 악화시켜 기도 폐색⁽⁵)을 악화시킨다. 폐의 전반적인 건강에 대한 점액 유변학의 중요성에 대한 가장 좋은 예들 중 하나는 낭포성 섬유증 환자의 치료에서 재조합 인간 DNFase (rhDNase)의 예에 의해 제공된다. rhDNase의 효과는 먼저 거담 된 가래에 대한 생체외 입증되었으며, 이는 점성 점액에서^10,11 분 이내에 흐르는 액체로의 전환을 ^{보여주었습니다.} CF 환자에 대한 임상 시험은 rhDNase 흡입으로 기도 점액 점액 점탄성을 감소시켜 폐 악화 속도를 감소시키고 폐 기능과 전반적인 환자 복지를 개선한다는 것을 입증했습니다^12,13,14. 그 결과, 클리어런스를 촉진하기 위한 rhDNase 흡입은 이십 년 이상 CF 환자들을 위한 치료의 표준이 되었다. CF에서 점액 수화를 위해 흡입된 고장성 식염수의 사용과 유사한 임상 적 이점이 관찰되었는데, 이는 유변학적 특성의 변화와 상관관계가 있으며 점액 클리어런스 가속 및 폐 기능 개선^15,16을 초래하였다. 따라서 임상 설정에서 점액 점탄성 특성을 측정하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 프로토콜은 치료 접근법을 최적화하는 데 중요합니다.

여기에서 테스트된 벤치탑 레오미터는 점액/객담 샘플의 포괄적인 점탄성 측정을 수행하기 위한 빠르고 편리한 대안을 제공합니다. 제어된 각도 변위가 있는 동적 진동을 사용하는 이 계측기는 한 쌍의 조정 가능한 평행 플레이트(예: 거칠거나 부드러운 형상)를 통해 변형을 제공하여 15nN의 해상도로 토크와 변위를 측정합니다^. m 및 150 nm, 각각¹⁷. 비유변학 전문가를 위해 채택된 사용자 지침과 결합된 기본 표준화된 교정은 간단한 측정을 가능하게 하고 작업자 오류의 위험을 줄여줍니다. 이 장치는 실시간으로 처리 및 분석되는 스트레인 스윕 곡선을 생성하고(~5분 이내) 선형 점탄성(G', G", G^*, 황갈색 δ)과 겔 점(γ c 및 σ_c) 특성을 자동으로 제공합니다(표 1 참조). 탄성 또는 저장 모듈러스 (G')는 샘플이 응력에 어떻게 반응하는지 (즉, 원래의 모양으로 돌아갈 수있는 능력)를 설명하는 반면, 점성 또는 손실 모듈러스 (G")는 정현파 변형의 사이클 당 소산되는 에너지 (즉, 분자의 마찰로 인해 손실 된 에너지)를 설명합니다. 복합 또는 동적 모듈러스(G*)는 응력 대 변형률의 비율로, 전단 변위에 반응하여 축적되는 내부 힘의 양(즉, 전체 점탄성 특성)을 설명합니다. 감쇠 계수 (tan δ)는 탄성 모듈러스에 대한 점성 모듈러스의 비율로, 샘플이 에너지를 발산하는 능력을 나타냅니다 (즉, 낮은 황갈색 δ은 탄성 우성 / 고체 유사 거동을 나타내는 반면, 높은 황갈색 δ은 점성 우성 / 액체와 같은 행동을 나타냅니다). 겔 포인트 특성의 경우, 크로스오버 변형률(γ_c)은 전단 갭 높이에 대한 편향 경로의 비율에 의해 계산되는 전단 변형률의 척도이며, 여기서 샘플은 고체형에서 액체형 거동으로 전이되고 정의에 따라 진동 변형에서 G' = G" 또는 황갈색 δ = 1로 발생합니다. 크로스오버 항복응력(_{σ c)}은 탄성 및 점성 모듈리가 교차하는 장치에 의해 가해지는 응력의 양을 측정한 것이다. 건강한 가래에서 탄력은 변형에 대한 기계적 반응을 지배합니다 (G '> G"). 점막 폐쇄성 질환에서 G'와 G"는 병리학 적 점액 변화의 결과로 증가합니다^17,18,19. 장치의 작동 단순성은 현장 측정을 용이하게 하고 분석을 위해 시료 저장/운송/오프사이트 시설로의 선적의 필요성을 회피하므로 이러한 생물학적 샘플의 특성에 대한 시간 및 동결 해동 영향을 피할 수 있습니다.

이 연구에서는 상용 벤치탑 레오미터의 측정 범위를 검증하기 위해 다양한 농도의 8 MDa 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 용액 (1 % -3 %)을 사용했으며 얻은 농도 의존 곡선은 전통적인 벌크 레오미터로 얻은 측정치와 직접 비교되었습니다 (재료 표 ). 유변학적 측정의 반복성은 상태 천식(SA)을 앓고 있는 삽관 환자로부터 기관지경으로 수확된 점액, 환경적 또는 감염원에 대한 반응으로 기관지 경련, 호산구 염증 및 점액 과잉 생성을 특징으로 하는 극단적인 형태의 천식 악화를 사용하여 평가되었다 ^8,20 . 이 경우, SA 환자는 심한 호흡 부전으로 삽관되었고, 공격적인 표준 천식 치료법에도 불구하고 기계적 환기만으로 환자를 효과적이고 안전하게 지원할 수 없기 때문에 ECMO (체외 막 산소화)가 필요했습니다. 로바 붕괴에 대한 임상적으로 지시 된 기관지 내시경 검사 중에 두껍고 맑고 끈질긴 분비물이 기관지를 막는 것으로 밝혀졌으며 식염수 세척을 사용하여 흡인되었습니다. 수집 직후, 과량의 식염수를 흡인물로부터 제거하고, 나머지 SA 샘플의 점탄성 특성을 벤치탑 장치를 사용하여 분석하였다. 추가의 샘플 분취량을 환원제인 트리스(2-카르복실에틸)포스핀 히드로클로라이드(TCEP)로 처리하여, 이러한 프로토콜이 생체외 치료 화합물 효능을 특성화하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하였다.

결과는이 프로토콜과 벤치 탑 장치가 임상 환경에서 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주었습니다. PEO 농도 의존 곡선에서 결정된 유변학적 특성(그림 1A)은 테스트된 벤치탑 장치와 전통적인 평행 플레이트 레오미터(그림 1B) 간에 구별할 수 없었습니다. SA 점액의 삼중 측정은 G*, G' 및 G" 종점에 대한 10% 변동 계수로 반복 가능했으며, 이 환자의 경우 임상적으로 명백한 점액 점탄성의 실질적인 이상을 반영했습니다(그림 1D). 마지막으로, TCEP를 사용한 생체외 처리는 G' 및 G"의 현저한 감소와 황갈색 δ의 증가를 가져왔고, 뮤신 네트워크의 변경에 의한 치료에 대한 반응성을 입증하였다(도 2). 결론적으로, 벤치탑 레오미터를 이용한 이 프로토콜은 클리닉으로부터 수득된 점액 샘플의 점탄성 특성을 평가하기 위한 간단하고 효과적인 접근법을 제공한다. 이 기능은 임상의가 현장에서 승인 된 점액 활성 약물의 효능을 테스트 할 수 있기 때문에 정밀 의학 접근법을 용이하게하는 데 사용될 수 있으며, 이는 대체 치료 옵션을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한,이 접근법은 임상 시험에서 조사 약물의 효과를 검사하는 데 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

본 연구에서, 샘플은 UNC 기관 검토 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의를 얻은 후 임상적으로 지시된 기관지 내시경 검사 동안 수집되었다.

1. 가래 / 점액 수집 및 저장

1. 가래 수집 또는 기관지 내시경 흡인을 통해 기도 점액을 수집하십시오.
   1. 자발적인 거담을 통해 가래를 수집하거나 3 % 고장성 생리 식염수 흡입으로 가래를 유도하십시오. 또는 기관지 내시경 검사 절차 중에기도에서 점액을 직접 흡인하십시오.
   2. 수집 된 기도 가래 / 점액을 멸균 표본 컵에 보관하십시오. 가래의 경우, 수집 즉시 샘플에서 과도한 타액을 제거하십시오.
   3. 운반을 위해 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 전송 시간을 4시간 미만으로 제한하십시오.
2. 수집 시에 샘플을 분석하거나 처리될 때까지 -80°C에서 저장한다.
   1. 보관하기 전에 미세 원심분리 튜브에 직접 포지티브 변위 피펫 또는 피펫으로 세 번에서 다섯 번 부드럽게 피펫팅하여 점액을 균질화하십시오.
   2. 실험을 위한 충분한 부피를 보장하기 위해 샘플을 ≥500 μL의 부피로 분취한다.
      참고: 동결 및 해동은 샘플의 점탄성 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 비슷한 동결/해동 주기를 거친 샘플만 비교합니다.

2. 시료 준비

1. 피펫은 신선하고 얼어 붙은 스푸타 / 점액을 직접 사용하거나 분취하기 전에 세 번에서 다섯 번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 긍정적 인 변위 피펫을 사용하여 표본을 균질화합니다.
   참고: 균질화는 재현성에 영향을 줄 수 있는 두꺼운 플러그가 포함된 샘플에 중요합니다.
2. 시료 400-500 μL를 분취하여 별도의 미세원심분리 튜브에 넣는다. 반복적 인 측정 및 / 또는 약리학 시약 (예 : rhDNase, N- 아세틸 시스테인)으로 치료하기 위해 필요한만큼 많은 분취량을 준비하십시오. 시험될 분취량을 측정 전에 최소 5분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
3. 약리학 적 제제 (선택 사항)를 테스트하려면 샘플 희석을 방지하기 위해 고농도의 원액을 사용하십시오.
   1. 0.4% 내지 10% 부피(시편 희석을 최소화하기 위해)의 원하는 시약(예를 들어, TCEP)을 샘플 상에 직접 첨가한다. 화합물의 방울이 튜브의 측면에 머물러 있지 않은지 확인하십시오.
   2. 샘플을 원하는 시간 동안 37°C에서 인큐베이션하여 화학 반응을 허용한다(점액의 단백질 분해 분해를 방지하기 위해 <1 h).
   3. 점액 네트워크(예를 들어, 섬모 박동 및 점액 클리어런스를 모방함)를 손상시키지 않으면서 점액 샘플 내로의 시약의 점진적 침투를 허용하기 위해 매 2분마다 마이크로원심분리 튜브의 바닥을 플리킹함으로써 점액 샘플과 시약을 혼합한다. 여러 약물 시약을 비교할 때 배양 시간이 유사한지 확인하십시오.

3. 계측기 초기화 및 교정

1. 기계 (재료 테이블)를 켜고 소프트웨어를 초기화하십시오.
2. 새 측정을 선택합니다. 계속하려면 측정 ID 아래에 샘플 식별 번호를 입력하고 연산자 아래에 운영자 이름을 입력합니다. 설명 아래에 추가 정보 또는 설명을 입력합니다.
3. 형상 세트(예: 거칠거나 부드러운 25mm 평행 플레이트)를 선택하고 크고 작은 플레이트를 주의 깊게 검사하여 플레이트가 깨끗하고 완벽한 상태인지 확인합니다.
   참고: 거친 플레이트는 대용량 (350-500 μL)을 위해 설계되었으며 부드러운 플레이트는 더 작은 볼륨 (250-350 μL)을 위해 설계되었습니다. 권장보다 낮거나 높은 샘플 부피를 사용하면 부정확한 측정이 발생할 수 있습니다.
4. 큰 접시를 바닥 강단에 단단히 삽입하십시오.
5. 작은 접시를 상부 강단에 부드럽게 삽입하고 플레이트가 제대로 고정되었음을 나타내는 "클릭"소리가 들릴 때까지 약간 회전하여 플레이트를 잠급니다. 상부 플레이트의 자유 진동은 정상입니다.
6. 온도가 37°C 목표치에 도달할 때까지 기다리십시오. 그런 다음 소프트웨어의 지시에 따라 자동 보정을 시작합니다.
   참고: 이 과정에서 기계나 벤치탑 표면을 방해하지 마십시오.

4. 샘플 로딩

1. 포지티브 변위 피펫을 사용하여, 큰 바닥 플레이트의 중앙에 샘플의 250 내지 500 μL 사이의 천천히 피펫을 한다. 일단 플레이트에 증착되면, 점성 샘플은 돔 모양을 채택하는 반면, 탄성이 높은 샘플은 물리적 절단이 필요할 수 있습니다 (해부 가위 사용).
   참고: 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 필요한 경우 피펫 팁으로 밀어 넣어 잔류 거품을 제거하십시오.
2. 소프트웨어를 통해 작은 플레이트를 운반하는 측정 헤드를 내리고 샘플을 관찰하십시오. 바닥 플레이트에 적절하게로드되면 샘플이 접촉하고 두 플레이트 사이에 중심을 맞 춥니 다.
3. 샘플이 틈새를 채우도록 하려면(즉, 플레이트의 가장자리로 확산하여) 샘플이 더 이상 비스컨오목한 모양이 아니거나 플레이트의 가장자리와 정렬될 때까지 갭 감소 기능을 사용합니다. 간격 감소 기능은 측정 헤드를 0.1mm 단위로 낮추고 일곱 증분으로 제한됩니다.
   참고: 샘플을 주의 깊게 모니터링하고 간격을 점진적으로 조정하여 과다 유출을 방지하십시오.
   1. 일곱 증분 후에도 간격이 남아 있으면 설치 다시 실행 을 클릭하여 초기 위치로 돌아가 샘플의 위치 및/또는 볼륨을 조정합니다.
   2. 갭이 매우 감소되면(예를 들어, 쌍볼록한 형상), 상부 플레이트의 가장자리를 따라 원형 운동에 의해 주걱으로 과량의 샘플을 제거한다. 전단 응력을 피하기 위해 초과 샘플을 부드럽게 다듬으십시오.
      참고: 이 단계가 끝날 때 샘플의 가장자리는 사용자 지침에 표시된 대로 위쪽 플레이트의 가장자리와 정렬되어야 합니다.
4. 진동 중에 오염된 유체가 우발적으로 투사되지 않도록 보호 커버를 내립니다.

5. 생물물리학적 측정 개시

1. 측정을 시작하려면 분석 시작을 클릭합니다. 전체 사이클은 4-7 분이 소요됩니다.
   1. 사이클의 전체 기간 동안 큰 소리로 말하고 장치 또는 벤치를 만지지 마십시오. 조용한 환경은 처음 2 분 동안 특히 중요합니다.
      참고: 사이클 동안 계측기는 연속적인 진동 단계로 구성된 표준화된 스트레인 스윕 테스트를 수행합니다. 각 단계는 일정한 진폭과 주파수(1Hz)에서 일련의 10회 진동이며, 이 동안 해당 토크가 실시간으로 측정됩니다. 스트레인 및 토크 신호를 통해 복합 (G *), 탄성 (G') 및 점성 (G") 모듈리뿐만 아니라 각 단계에서 감쇠비 (황갈색 δ)를 계산할 수 있습니다. 진동은 진폭이 점차 증가하여 샘플에 부과 된 변형을 강화합니다.

6. 샘플 제거

1. 주기가 완료되면 다음을 클릭하여 측정 헤드를 올리고 샘플 분석 보고서를 생성합니다.
   참고: 보고서의 경우, 소프트웨어는 기록된 데이터를 계산하고 샘플에 가해지는 변형과 관련하여 점성 및 탄성 모듈리의 진화를 보여주는 두 개의 곡선을 자동으로 그래프로 표시하고 선형 점탄성 체제(즉, 낮은 변형의 고원)가 있는 경우 이를 표시합니다. 선형 정권이 검출되지 않으면, G', G", G*, TAN δ의 값이 0.05 변형률에서 추출된다. 또한, 크로스오버 변형률 및 항복 응력(γ c_, 및 σ_c)은 tan δ=1에서 계산된다. 데이터는 추가 분석을 위해 각 단계에 대한 스프레드 시트에도 제공됩니다.
2. 측정 헤드가 완전히 수축되면 보호 커버를 들어 올리고 샘플을 버리고 조심스럽게 플레이트를 제거하십시오. 따뜻한 물과 비누로 접시를 청소하고 소독하십시오.
   참고: 반복 사용하기 전에 형상 세트를 완전히 건조하십시오.

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결과

도 1은 점탄성 대조군, 즉 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 용액, 및 천식 상태(SA) 점액의 농도 의존적 곡선을 이용한 유변학적 측정의 정확도 및 반복성을 보여준다. 5가지 농도(1%, 1.5%, 2%, 2%, 2.5%, 및 3%)에서 8 MDa PEO의 점탄성 특성의 측정은 평가된 벤치탑 레오미터와 전통적인 벌크 레오미터 사이에서 직접 비교되었다(표 재료). SA 점액과는 달리, PEO 용액은 전체 균주 범?...

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토론

점액의 독특한 점탄성 특성은 건강한 기도를 유지하는 데 필수적입니다. 내부 및 외부 요인은기도 점액 생물 물리학 적 특성을 변화시켜 점막 폐쇄성 질환의 특징적인 임상 합병증을 일으킬 수 있습니다. 따라서 점액 점탄성의 변화를 모니터링하는 것은 질병 상태 평가 및 점액 점탄성을 감소시키는 치료법의 탐구 중에 고려 될 수 있습니다. 1980 년대의 경험적 연구는 자기 비드 레오 미터

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.