Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular

Resumen

El presente protocolo describe una técnica única llamada entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), que puede incorporarse a estudios de rehabilitación de precisión realizados en animales pequeños, como ratones.

Resumen

El entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que implica realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores, puede aumentar la masa muscular y la fuerza en individuos sanos y en poblaciones de pacientes. Se necesitan herramientas de rehabilitación de precisión para probar la seguridad y eficacia de PRT para mantener y / o restaurar la masa muscular y la fuerza en estudios preclínicos en modelos animales pequeños y grandes. La metodología y el dispositivo PRT descritos en este artículo se pueden usar para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El dispositivo DART se puede utilizar como un dinamómetro independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico generado por los dorsiflexores del tobillo en ratones o se puede agregar a un sistema de dinamometría isocinética preexistente. El dispositivo DART se puede fabricar con una impresora 3D estándar basada en las instrucciones y los archivos de impresión 3D de código abierto proporcionados en este trabajo. El artículo también describe el flujo de trabajo de un estudio para comparar el daño muscular inducido por la contracción causado por un solo ataque de DART con el daño muscular causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (ISOM) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B / R2 (ratones BLAZ). Los datos de ocho ratones BLAJ (cuatro animales para cada condición) sugieren que menos del 10% del músculo tibial anterior (TA) se dañó por un solo ataque de DART o ISOM, siendo DART menos dañino que ISOM.

Introducción

El ejercicio confiere numerosos beneficios para la salud en el músculo esquelético (revisado en Vina et ^al.1). Específicamente, se sabe que el entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que consiste en realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores (por ejemplo, barras, mancuernas, circuitos de cable-polea-peso), ayuda a aumentar la masa muscular y la fuerza tanto en individuos sanos como en poblaciones de pacientes (revisado en publicaciones anteriores ^2,3 ). La TRP se basa en el principio de sobrecarga, que establece que, cuando el músculo se contrae contra cargas externas progresivamente mayores, se adapta aumentando su área de sección transversal fisiológica, así como la capacidad de producción de fuerza⁴. Los modelos existentes de PRT en roedores incluyen subir escaleras con resistencia aplicada a la cola, co-contracción de los músculos agonistas contra la resistencia de los antagonistas, correr con un arnés pesado, un ejercicio de sentadilla provocado por una descarga eléctrica y resistir la carrera de la rueda 5,6,7,8,9,10 (revisado en publicaciones anteriores ^11,12 ). Sin embargo, actualmente no existen herramientas de investigación para realizar PRT precisamente dirigida al músculo y ajustada a la dosis en ratones que se asemejen mucho a los métodos y dispositivos PRT utilizados en la investigación clínica humana y la práctica^12,13. Esto limita la capacidad de los investigadores para estudiar la seguridad y eficacia de la PRT dosificada con precisión en estudios básicos y preclínicos en ratones.

Para superar esta barrera, en este estudio se desarrolla una metodología y un dispositivo PRT basados en los diseños de circuitos de cable-polea-peso empleados en equipos de entrenamiento de resistencia en gimnasios modernos^14,15,16. Este método de PRT se conoce como entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), y el dispositivo se llama dispositivo DART. Además de su funcionalidad como herramienta de entrenamiento de rehabilitación de precisión, el dispositivo DART también se puede utilizar como un instrumento independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico máximo que puede ser generado por el músculo tibial anterior (TA) en un ratón, similar a cómo se evalúa el máximo de una repetición (1RM, la carga máxima que se puede levantar / mover / presionar / poner en cuclillas con éxito solo una vez mientras se mantiene una buena forma) en humanos^{17, 18}. El dispositivo DART también se puede acoplar con un dinamómetro isocinético personalizado o comercial para medir la fuerza tetánica isométrica máxima producida por el músculo TA en un ratón (comparable a la contracción voluntaria máxima [MVC] en humanos) y luego realizar PRT ajustada a la dosis con una resistencia que se basa en la fuerza tetánica máxima (por ejemplo, 50% de la fuerza máxima).

Este artículo describe la construcción del dispositivo DART y explica cómo se puede acoplar con un dinamómetro personalizado, que se ha descrito en publicaciones anteriores 19,20,21,22^, para evaluar el par contráctil y realizar DART. El estudio también describe cómo se utilizó el dispositivo DART para comparar el daño muscular inducido por el ejercicio causado por un solo episodio de DART (4 series de 10 contracciones concéntricamente sesgadas con 50% de 1RM) con el daño causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (4 series de 10 contracciones isométricas) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)^23,24. El modelo de ratón que se estudió carece de una proteína llamada disferlina, que desempeña un papel importante en la protección del músculo esquelético contra el daño muscular de aparición tardía después de contracciones excéntricas perjudiciales 22,25,26,27,28,29,30 . También se ha demostrado en ratones machos deficientes en disferina que el ejercicio forzado concéntricamente sesgado no es tan dañino como el ejercicio forzado excéntricamente sesgado y que la exposición previa al entrenamiento concéntricamente sesgado ofrece protección contra lesiones de un episodio posterior de contracciones excéntricamente sesgadas²². Dado que el estudio actual se realizó para probar la viabilidad de la metodología y el dispositivo DART actuales para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis y sesgado concéntricamente, se eligieron ratones machos deficientes en disferlina para la investigación para comparar nuevos datos del dispositivo DART con datos anteriores. En futuros estudios, se incluirán ratones BLAJ hembra para estudiar el efecto del sexo como variable biológica en relación con la respuesta a DART. Se estudiaron ratones que tenían ~ 1,5 años de edad, ya que ya tienen cambios distróficos en muchos grupos musculares y, por lo tanto, modelan el estado fisiopatológico en el que podrían estar los músculos en pacientes que ya tienen debilidad muscular y desgaste y están buscando atención de rehabilitación para mantener la masa muscular y la fuerza²⁶.

Protocolo

Los experimentos descritos en este artículo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, Michigan, EE.UU., de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (1996, publicada por National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, EE.UU.). B6. Para el presente estudio se utilizaron ratones A-Dysf^prmd/GeneJ (también conocidos como ratones BLAZ, machos, ~1,5 años de edad) que modelo LGMD2B/R2 Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Diseño del estudio

1. Elija la(s) cepa(s) de ratón relevante(s) para la(s) pregunta(s) de investigación, por ejemplo, el estudio B6. Ratones A-Dysf^prmd/GeneJ (ratones BLAZ) si se intenta responder a la pregunta de si el DART sesgado concéntricamente induce o no daño muscular generalizado en ratones que modelan LGMD2B/R2.
2. Asigne ratones a grupos de estudio según el diseño del estudio, por ejemplo, asigne aleatoriamente ratones a un grupo de entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis (DART) o a un grupo de entrenamiento isométrico (ISOM), e intente equilibrar los grupos lo mejor posible según la coincidencia por camada y / o edad (por ejemplo, Tabla 1).

2. Fabricación del dispositivo DART

1. Diseñe los componentes del dispositivo DART con el software asistido por ordenador (CAD) adecuado (Figura 1) siguiendo los pasos a continuación.
   1. Carcasa de diseño para cojinetes de rueda de baja fricción (consulte la Tabla de materiales, basada en el diseño del cojinete de bloques de almohada) con un transportador incorporado (para usar como goniómetro para medir los ángulos de las articulaciones del tobillo).
   2. Diseñe una torre para la carcasa del rodamiento de la rueda más un transportador.
   3. Diseñe una plataforma para colocar el pie del ratón. Diseñe un eje para conectar la plataforma al cojinete de la rueda.
2. Fabrice los componentes del dispositivo DART con una impresora 3D adecuada (Figura 1).
   1. Guarde los diseños creados con software CAD como estereolitografía (. STL).
      NOTA: El archivo . Los archivos STL (Supplementary Coding Files 1-4) pueden ser utilizados y modificados dando crédito al autor correspondiente de este artículo y citando este artículo.
   2. Abra el archivo . STL con el software de corte adecuado (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El software de corte convierte un modelo 3D virtual en una pila de cortes, que puede ser impreso secuencialmente por una impresora 3D para generar un objeto 3D.
   3. Con el software de corte, genere G-CODE de fabricación asistida por computadora (CAM, . GCODE), que son específicos de la impresora 3D y el filamento que se utilizará.
   4. Siga el manual de la impresora 3D (consulte Tabla de materiales) para imprimir componentes del dispositivo DART con . GCODE.
   5. Elija un filamento de impresora 3D adecuado, como ácido poliláctico (PLA) 1.75 mm 1 kg / carrete, gris (consulte la tabla de materiales).
3. Ensamble el dispositivo DART siguiendo los pasos a continuación.
   1. Inserte un rodamiento de rueda de baja fricción 608 (diámetro de diámetro de 8 mm, diámetro exterior de 22 mm, como uno con bolas de cerámica de nitruro de silicio alojadas en acero inoxidable 420, consulte la Tabla de materiales) en la carcasa del rodamiento de la rueda (figura 1).
   2. Inserte el eje en el orificio del cojinete de la rueda (figura 1).
   3. Pegue el reposapiés en el eje con pegamento (consulte la Tabla de materiales) que sea adecuado para unir el PLA (Figura 1).
   4. Coloque la carcasa del cojinete de la rueda por encima de la torre de la carcasa del cojinete de la rueda y fije todo el conjunto a una base de acrílico con sujetadores de tornillo (Figura 1).
      NOTA: No hay requisitos de tamaño específicos para la base de acrílico, solo necesita ser lo suficientemente grande como para acomodar al animal y al dispositivo DART y lo suficientemente pequeña como para caber en una superficie de trabajo. La base acrílica utilizada para el presente estudio es de unos 30 cm de ancho, 45 cm de largo y 0,5 cm de espesor.

3. Preparación de ratones para DART o ISOM

1. Coloque cada ratón bajo anestesia general con isoflurano inhalado administrado a través de un sistema de anestesia adecuado (ver Tabla de materiales, 2% -5% para inducción; 1% -4% para mantenimiento; al efecto) para reducir el estrés y el dolor.
   1. Inducir anestesia en la cámara de inducción del sistema de anestesia (2% -5% isoflurano).
   2. Transfiera el ratón a un cono nasal para mantener la anestesia mientras realiza procedimientos en el animal (1% -4% isoflurano). Confirme la efectividad de la anestesia en función de la falta de retirada de las extremidades posteriores a un pellizco del dedo del pie de un par de pinzas.
   3. Proporcione soporte térmico, por ejemplo, con una almohadilla térmica de gel isotérmico y una lámpara de calor colocada ~ 1 m por encima del mouse. Verifique con un termómetro para asegurarse de que la temperatura en y alrededor de la base de acrílico se mantenga a ~ 38 ° C, para que el mouse no se sobrecaliente.
2. Prepare la piel sobre el músculo tibial anterior izquierdo (TA) del ratón y sobre todos los aspectos anterior y lateral de la extremidad posterior izquierda para DART o ISOM.
   1. Retire el pelaje del ratón con una crema depilatoria (crema depilatoria, consulte la Tabla de materiales). Aplique crema depilatoria y deje que actúe durante ~ 2 min.
   2. Limpie la pierna con toallitas empapadas en agua destilada para eliminar el pelaje y toda la crema residual de la piel. Las cremas depilatorias pueden irritar y/o dañar la piel si se dejan en la piel del ratón durante largos períodos y, por lo tanto, se eliminan por completo.
   3. Después de la eliminación del pelaje, desinfecte la piel con un método de lavado aprobado, como con una solución de lavado de povidona yodada y etanol al 70%.
3. Aplique un protector (por ejemplo, vaselina) sobre los ojos y la piel depilada con un hisopo de algodón limpio para proteger los ojos y la piel depilada de la sequedad.
4. Coloque un alfiler estabilizador a través de la metáfisis tibial.
   1. Aplique crema de lidocaína al 5% sobre la tibia para adormecer el área.
   2. Pase una aguja hipodérmica estéril de 26 G, media pulgada a través de la parte más ancha de la porción proximal del hueso tibial (es decir, la metáfisis tibial, también conocida como cabeza tibial). Una vez que el pasador estabilizador esté asegurado, retire la porción plástica de la aguja hipodérmica sosteniendo la aguja con un hemostático estéril y doblando la porción de plástico hasta que se rompa.
5. Coloque el ratón para el entrenamiento DART o ISOM.
   1. Coloque el ratón en posición supina. Asegúrese de que el ratón todavía esté conectado de forma segura al cono de la nariz para mantener la anestesia.
   2. Con un par de pinzas de punta estéril, introduzca el pasador tibial en un clip de cocodrilo metálico (consulte la Tabla de materiales), de modo que los extremos del pasador tibial estén sujetos por la pinza de cocodrilo. Mueva el brazo ajustable de la abrazadera de cocodrilo para asegurarse de que el pie del ratón esté colocado en la placa del dispositivo DART.
   3. Sujete el pie del ratón a la placa del dispositivo DART con cinta adhesiva de laboratorio.
   4. Coloque el pie del ratón en un ángulo de 90° en relación con el eje largo del hueso tibial del ratón. Si se coloca correctamente, el reposapiés será perpendicular a la base acrílica (es decir, el piso o lo que se considera el plano horizontal).
   5. Apoye la plataforma sobre el tope de flexión plantar creado al colocar una aguja hipodérmica larga de 18 G, 1.5 in a través de los orificios preperforados en el transportador del dispositivo DART (Figura 1).

4. Formación DART o ISOM

1. Optimice la colocación del electrodo colocando un electrodo bipolar, transcutáneo y de estimulación eléctrica neuromuscular (NMES, consulte la Tabla de materiales) en el aspecto inferolateral de la articulación de la rodilla del ratón (Figura 1B).
   1. Con pulsos simples (1 Hz) de un estimulador eléctrico de laboratorio (ver Tabla de materiales), estimule la rama fibular del nervio ciático, que proporciona inervación motora a los músculos dorsiflexores del tobillo (Figura 1B).
   2. Dado que el músculo tibial anterior (AT) representa más del 90% de la fuerza contráctil total producida por los músculos dorsiflexores del tobillo³¹, observe el vientre y el tendón del músculo TA para detectar evidencia de contracciones de contracción provocadas eléctricamente.
      NOTA: Una ligera prominencia ósea que se corresponde con el hueso del peroné podría ayudar con la colocación del electrodo si el probador puede sentirlo a través del electrodo. Esto requiere algo de práctica y aprendizaje por parte del probador para tener una idea de la colocación óptima de los electrodos.
   3. Mueva el tope de flexión plantar al orificio en el transportador que corresponde a 20° de flexión plantar desde la posición en la que el pie es ortogonal (90°) hasta la tibia — esta es la posición en la que se observa típicamente el torque contráctil máximo del músculo TA basado en informes anteriores²¹. Esto podría tener que ser personalizado por el usuario en función de los factores específicos de los ratones que se están estudiando.
   4. Visualice el torque de contracción con un dinamómetro de ratón vinculando la placa de pie del dispositivo DART a la placa del dinamómetro, por ej., vincule la placa del dispositivo DART a una placa robótica del dinamómetro de tobillo hecha a medida con una sutura de seda no elástica (similar a la Figura 1A) y amarre la sutura a la placa del dinamómetro (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La placa tiene agujeros integrados en el diseño de impresión 3D. Colocar la sutura a través del par de orificios que están en la segunda fila desde el extremo del dedo del pie coloca la sutura a ~ 20 mm del eje de dorsiflexión/flexión plantar (Figura 1A, B). El dinamómetro ha sido descrito en informes anteriores 19,20,21,22.
2. Optimice la salida de voltaje del estimulador NMES.
   1. Después de optimizar la colocación del electrodo, optimice la amplitud de la salida de voltaje del estimulador eléctrico; esto es necesario para confinar NMES al nervio fibular común y al músculo TA y reducir el riesgo de provocar cocontracciones en los flexores plantares.
      NOTA: Si se provocan co-contracciones, se pueden visualizar a través de la salida de par del dinamómetro y también se pueden ver en la flexión plantar de los dedos.
3. Configure el estimulador NMES para el entrenamiento DART o ISOM.
   NOTA: Es posible que el usuario tenga que personalizar la siguiente configuración en función de los factores específicos de los ratones que se están estudiando y el propósito de los estudios.
   1. Configure el estimulador para producir trenes de pulsos repetidos que tengan una frecuencia de 125 Hz: esta frecuencia produce contracciones tetánicas fusionadas máximas sin desbordamiento de NMES en otros grupos musculares en ratones BLAJ²¹. Para ello, ajuste los diales para la frecuencia de pulso (125 Hz), la duración del tren (500 ms) y los trenes por segundo (1 tren/s) y encienda el interruptor de palanca para repetir trenes de impulsos.
   2. Estimulador configurado para producir trenes de pulsos de 500 ms de duración intercalados con 500 ms de descanso entre trenes de pulsos.
   3. Mueva el tope de flexión plantar hasta el orificio en el transportador que corresponde a 160° al eje largo de la tibia (flexión plantar de 70° desde el pie ortogonal hasta la tibia). Esta es la posición a la que el pie del ratón BLAJ puede ser movido pasivamente sin resistencia de los tejidos blandos²¹.
   4. Para DART, aplique una resistencia adecuada contra la cual el músculo TA tiene que trabajar concéntricamente, por ejemplo, 5 g como se muestra en la Figura 1A, B; consulte la curva de calibración peso/par en el archivo complementario 1.
   5. Aplique resistencia colgando el peso con una sutura de seda no elástica que está atada a la placa de pie del dispositivo DART (Figura 1A, B).
   6. Ajuste la resistencia, es decir, aplique ~ 50% del máximo de una repetición (1RM) (por ejemplo, 5 g si el mouse puede levantar un peso máximo de 10 g con una sola contracción), que tira del pie a través de al menos la mitad del rango activo disponible de dorsiflexión.
   7. Realizar un entrenamiento DART adecuado en ratones asignados al grupo DART — por ejemplo, realizar un solo episodio de entrenamiento DART, que involucra cuatro series de 10 repeticiones de contracciones concéntricas con 2 minutos de descanso entre series, similar a los programas de entrenamiento de resistencia progresiva utilizados en humanos³² (ver Video Suplementario 1).
   8. Realizar un entrenamiento ISOM adecuado en ratones asignados al grupo ISOM, por ejemplo, realizar un solo episodio de entrenamiento ISOM, que implica cuatro series de 10 repeticiones de contracciones isométricas con 2 minutos de descanso entre series, similar a DART (ver Video suplementario 2).
   9. Para el entrenamiento ISOM, coloque el pie del ratón a 160° del eje largo de la tibia (flexión plantar de 70° desde el pie ortogonal hasta la tibia) y mantenga esta posición estática pegando la sutura de seda a la placa del dinamómetro robótico.
      NOTA: Dado que la sutura no puede deslizarse, la placa del reposapiés del dispositivo DART no puede moverse hacia la dorsiflexión, lo que limita a los dorsiflexores a contraerse isométricamente.

5. Cuidados post-procedimiento para ratones

1. Tome precauciones para mantener una higiene adecuada de la extremidad posterior ejercitada y reducir el dolor en el sitio de la aguja.
   1. Después del entrenamiento DART o ISOM, cubra la porción visible del clavo tibial con ungüento antibiótico triple (400 U/g de bacitracina, 3.5 mg/g de neomicina y 5000 U/g de polimixina-B, consulte la Tabla de materiales) y luego retire el alfiler cuidadosamente del lado medial de la tibia. Enjuague la piel sobre el muslo lateral y la parte superior de la pierna con povidona yodada y agua estéril. Aplique crema de lidocaína al 5% sobre la tibia para controlar el dolor en el sitio de la aguja.
2. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia.
   1. Retire el ratón del cono de la nariz y permita que se recupere de la anestesia en una jaula de recuperación que esté libre de ropa de cama. Proporcione soporte térmico al ratón mientras se recupera de la anestesia, por ejemplo, con una almohadilla térmica de gel isotérmico.
3. Devuelva el ratón a su jaula original después de que se recupere completamente de la anestesia. Luego, devuelva la jaula a la instalación de animales, donde se alojan los ratones de estudio hasta que se realicen experimentos de seguimiento. Controle a los ratones diariamente.

6. Recolección de tejidos

1. Cosecha el músculo TA del ratón en su totalidad y congela rápidamente para la criopreservación siguiendo los pasos a continuación.
   1. Sobre la base de la(s) pregunta(s) de investigación, en un momento adecuado después del entrenamiento (por ejemplo, 3 días después de DART o ISOM), eutanasia a los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados.
      NOTA: Para el presente estudio, los ratones fueron sacrificados por luxación cervical bajo anestesia general (isoflurano inhalado, 2% -5% al efecto). La toracotomía bilateral aseguró la muerte.
   2. Diseccionar las extremidades posteriores del ratón para eliminar el músculo TA ejercitado (izquierda) y el músculo TA no ejercitado (derecha). Pesa los músculos cosechados. Luego, sumerja cada músculo en aceite mineral para crioprotección y coloque el músculo en una toallita de laboratorio limpia para secar el exceso de aceite²¹.
2. Coloque el músculo en un trozo de papel de aluminio. Sostenga el borde de la lámina con un hemostático largo y sumerja rápidamente la lámina y el músculo en nitrógeno líquido contenido en un recipiente de plástico adecuado para congelar el músculo.
   1. Después de aproximadamente 2 minutos de inmersión en nitrógeno líquido, transfiera el músculo congelado a viales criogénicos marcados. Guarde los viales en un congelador de -80 °C hasta que sea necesario para estudios adicionales.

7. Estudios histológicos en tejido muscular

1. Preparar secciones de criostato del músculo TA que tengan un grosor de 5 μm. Recoja secciones de criostato en portaobjetos de microscopio cargados. Fijar las secciones con acetona que se mantenga fría a -30 °C y dejar que las secciones se sequen al aire.
2. Manchar las secciones de tejido muscular con hematoxilina seguida de eosina (tinción H&E, ver Tabla de materiales).
   1. Sumerja las secciones durante 5 minutos en hematoxilina (tinción nuclear azul oscuro) en un frasco de tinción de vidrio. Elimine el exceso de hematoxilina enjuagando las secciones con agua del grifo hasta que no se vea más azulado del agua.
   2. Sumerja las secciones durante 5 minutos en un reactivo azulado en un frasco de vidrio. Aspirar el exceso de reactivo azulado de las secciones con una pipeta de succión de vidrio.
   3. Sumerja las secciones durante 5 minutos en eosina (tinción citoplasmática rosa) en un frasco de tinción de vidrio. Elimine el exceso de eosina sumergiendo las secciones rápida y repetidamente (~ 10 veces) en etanol al 95% en un frasco de tinción de vidrio.
   4. Deje que las secciones se sequen al aire y proceda a visualizar bajo un microscopio óptico.
3. Prepare imágenes en mosaico de alta resolución de secciones transversales musculares completas de TA a través de imágenes de microscopio.
   NOTA: Es posible que el usuario tenga que personalizar los pasos de procesamiento de imágenes y análisis de imágenes que siguen en función de su microscopio y software de adquisición y análisis de imágenes.
   1. Capture imágenes digitales con la lente objetivo 10x de un microscopio óptico y una cámara digital montada en el microscopio.
   2. Capture alrededor de 15-20 imágenes, moviéndose a lo largo de la sección transversal de cada músculo en forma de cuadrícula, de modo que cada nueva imagen se superponga ~ 25% con la imagen anterior.
      NOTA: Este proceso ayuda a capturar un conjunto de imágenes que se pueden colocar digitalmente en mosaico (también conocido como costura de imágenes) para crear una imagen compuesta de alta resolución de toda la sección transversal del músculo TA (Figura 2).
   3. Guardar imágenes digitales en . Formato TIFF.
   4. Abra imágenes digitales con un software adecuado de procesamiento y análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
   5. Coloque mosaicos o puntadas imágenes individuales en una imagen compuesta de todo el músculo TA a través de los siguientes pasos: con todas las imágenes individuales superpuestas de cada músculo TA abiertas en el software, haga clic en Archivo > Seleccione Automatizar > Seleccione Photomerge > Seleccione Collage > Seleccione Agregar archivos abiertos > Haga clic en Aceptar.
   6. Cuando se prepare y muestre una nueva imagen en mosaico/cosida del músculo TA, guarde la imagen en . Formato TIFF para análisis posteriores.
4. Cuantificar el daño muscular mediante análisis visual en las imágenes en mosaico de todo el músculo TA con el software de análisis de imágenes adecuado.
   1. En el software de análisis de imágenes, seleccione la función Medir en el menú Analizar para delinear y medir el área de toda la sección transversal del músculo TA (Figura 2).
   2. En el software de análisis de imágenes, seleccione la función Medir en el menú Analizar para delinear y medir las áreas de cada músculo TA que están dañadas, es decir, áreas que muestran alteración citoplasmática de las fibras musculares, fibras musculares ausentes e infiltración celular inflamatoria²² (Figura 2).
   3. Exprese la suma del área total de daño como porcentaje de toda el área transversal del músculo TA (Figura 2, Tabla 2).

8. Análisis estadísticos

1. Organice los datos como se muestra en las Tablas 1-3 y realice pruebas T no pareadas (si se superan las pruebas de normalidad y varianzas homogéneas)³³ o pruebas de suma de rangos de Mann-Whitney (si no se superan las pruebas de normalidad y varianzas homogéneas)²¹ con el software adecuado (véase la Tabla de materiales).

Resultados

Se estudiaron ratones machos BLAZ, que tenían ~ 1.5 años de edad. Los ratones BLAJ modelan la enfermedad muscular humana, LGMD2B / R2. Estos ratones son particularmente susceptibles al daño muscular de aparición tardía de un solo episodio de contracciones musculares excéntricas^22,29. Por lo tanto, se eligieron ratones BLAJ para estos estudios para saber si DART podría realizarse de manera no perjudicial ajustando con precisión la resistencia contra la cua...

Discusión

Este artículo presenta instrucciones paso a paso sobre cómo construir un dispositivo para realizar un tipo de entrenamiento de rehabilitación de precisión llamado entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El trabajo también describe la aplicación del dispositivo y la metodología DART en un estudio de entrenamiento para comparar el daño muscular 3 días después de un solo episodio de DART (grupo DART) con el daño 3 días después de un episodio comparable de entrenamiento isométrico (grupo ISOM).<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing	Anmiao Star (N/A)	AMS127	High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope	Carl Zeiss (Peabody, MA)	Product #Axio Scope.A1	Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice)	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin.	Stock #012767	Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	BS4 50–6824	Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog No. S17495	Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software	Ultimaker, Utrecht, Netherlands	Ultimaker Cura 4.4.1.	Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad	Braintree Scientific (Braintree, MA)	Item #39DP	Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y	Millipore Sigma (Burlington, MA)	HT110132-1L	Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue	The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)	Gorilla Super Glue Micro Precise	Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3	Millipore Sigma (Burlington, MA)	GHS332-1L	Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog #HM525NX	Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120	Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014	National Instruments, Austin, Texas, USA	Labview 2014	Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks	ThermoFisher (Waltham, MA)	S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD	Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream	Softsheen Carson (New York, NY)	N/A	Razorless hair removal cream
Metal alligator clip	JINSHANGTOPK (web-based business)	24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps	Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides	Globe Scientific (Mahwah, NJ)	1354W. Diamond White Glass Slides	Charged microscope slides
Mineral Oil	ThermoFisher (Waltham, MA)	BP26291	Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA	Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)	#11778	Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer	Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)	Mini V2 3D	3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software	National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)	NIH Image for Windows	Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4	Adobe (San Jose, CA)	Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows	Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit	Grass Instruments (West Warwick, RI)	PSIU6 isolation unit	Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material	Roboz Surgical (Gaithersburg, MD)	Roboz Surgical SUT152	Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator	Grass Instruments (West Warwick, RI)	S48 Stimulator	Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent	Ricca Chemical Company (Arlington, TX)	6697-32	Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5	Systat Software (San Jose, CA)	SigmaStat version 3.5	Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer	VetEquip (Livermore, CA)	Item #901801	Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment	Global Health Products (wed-based business)	Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment	Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care