JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает уникальную технику, называемую тренировкой с отягощениями с поправкой на дозировку (DART), которая может быть включена в точные реабилитационные исследования, проводимые на мелких животных, таких как мыши.

Аннотация

Прогрессивная тренировка с отягощениями (PRT), которая включает в себя выполнение мышечных сокращений против постепенно увеличивающихся внешних нагрузок, может увеличить мышечную массу и силу у здоровых людей и в популяциях пациентов. Существует потребность в точных реабилитационных инструментах для проверки безопасности и эффективности PRT для поддержания и/или восстановления мышечной массы и силы в доклинических исследованиях на малых и крупных животных моделях. Методология и устройство PRT, описанные в этой статье, могут быть использованы для выполнения тренировок с отягощениями с поправкой на дозировку (DART). Устройство DART может быть использовано в качестве автономного динамометра для объективной оценки концентрического сократительного крутящего момента, генерируемого дорсифлексорами голеностопного сустава у мышей, или может быть добавлено к ранее существовавшей изокинетической динамометрической системе. Устройство DART может быть изготовлено со стандартным 3D-принтером на основе инструкций и файлов 3D-печати с открытым исходным кодом, представленных в этой работе. В статье также описывается рабочий процесс для исследования по сравнению вызванного сокращением повреждения мышц, вызванного одним приступом DART, с повреждением мышц, вызванным сопоставимым приступом изометрических сокращений (ISOM) в мышиной модели мышечной дистрофии конечностей типа 2B / R2 (мыши BLAJ). Данные восьми мышей BLAJ (четыре животных для каждого состояния) свидетельствуют о том, что менее 10% передней мышцы большеберцовой кости (TA) было повреждено от одного приступа DART или ISOM, причем DART был менее повреждающим, чем ISOM.

Введение

Физические упражнения дают многочисленные преимущества для здоровья скелетных мышц (рассмотрено в Vina et al.1). В частности, прогрессивная тренировка с отягощениями (PRT), которая включает в себя выполнение мышечных сокращений против постепенно увеличивающихся внешних нагрузок (например, штанг, гантелей, кабельных шкивов- силовых схем), как известно, помогает увеличить мышечную массу и силу как у здоровых людей, так и у пациентов (рассмотренных в предыдущих публикациях 2,3 ). PRT основан на принципе перегрузки, который гласит, что, когда мышца сокращается против все больших внешних нагрузок, она адаптируется, увеличивая свою физиологическую площадь поперечного сечения, а также силообразующую способность4. Существующие модели PRT у грызунов включают подъем по лестнице с сопротивлением, приложенным к хвосту, совместное сокращение мышц агонистов против сопротивления антагонистов, бег с утяжеленным жгутом, упражнение на корточках, вызванное электрическим током, и сопротивление колесному бегу 5,6,7,8,9,10 (рассмотрено в предыдущих публикациях11,12 ). Тем не менее, в настоящее время нет исследовательских инструментов для выполнения точно мышечной таргетной, скорректированной дозировки PRT у мышей, которые очень похожи на методы и устройства PRT, используемые в клинических исследованиях и практике человека12,13. Это ограничивает способность исследователей изучать безопасность и эффективность точно дозированного PRT в базовых и доклинических исследованиях на мышах.

Для преодоления этого барьера в данном исследовании разработаны методология и устройство PRT на основе схемы кабель-шкив-вес, используемой в тренажерах с отягощениями в современных гимназиях 14,15,16. Этот метод PRT называется тренировкой с поправкой на дозировку (DART), а устройство называется устройством DART. В дополнение к своей функциональности в качестве прецизионного реабилитационного тренировочного инструмента, устройство DART также может использоваться в качестве автономного инструмента для объективной оценки максимального концентрического сократительного крутящего момента, который может быть сгенерирован передней мышцей большеберцовой кости (TA) у мыши, подобно тому, как максимальная нагрузка с одним повторением (1RM, максимальная нагрузка, которая может быть успешно поднята / перемещена / нажата / приседания только один раз при сохранении хорошей формы) оценивается у людей17, 18. Устройство DART также может быть соединено с изготовленным по индивидуальному заказу или коммерческим изокинетическим динамометрическим динамометрическим для измерения пиковой изометрической тетановой силы, создаваемой мышцей ТА у мыши (сопоставимой с максимальным произвольным сокращением [MVC] у людей), а затем для выполнения скорректированной дозировки PRT с сопротивлением, которое основано на пиковой тетановой силе (например, 50% пиковой силы).

В этой статье описывается конструкция устройства DART и объясняется, как его можно соединить с изготовленным на заказ динамометром, который был описан в предыдущих публикациях 19,20,21,22, для оценки сократительного крутящего момента и выполнения DART. В исследовании также описывается, как устройство DART использовалось для сравнения вызванного физической нагрузкой повреждения мышц, вызванного одним приступом DART (4 набора из 10 концентрически смещенных сокращений с 50% 1RM), с повреждением, вызванным сопоставимым приступом изометрических сокращений (4 набора из 10 изометрических сокращений) в мышиной модели мышечной дистрофии конечностей-пояса типа 2B (LGMD2B, или LGMDR2)23,24. В изученной мышиной модели отсутствует белок, называемый дисферлином, который играет важную роль в защите скелетных мышц от повреждения мышц с задержкой начала после травмирующих эксцентрических сокращений 22,25,26,27,28,29,30 . На самцах мышей с дефицитом дисферлина также было продемонстрировано, что концентрически предвзятые принудительные упражнения не так вредны, как эксцентрически предвзятые принудительные упражнения, и что предыдущее воздействие концентрически предвзятого обучения обеспечивает защиту от травм от последующего приступа эксцентрически предвзятых сокращений22. Поскольку текущее исследование было проведено для проверки осуществимости нынешней методологии и устройства DART при выполнении скорректированных дозировок, концентрически смещенных тренировок с отягощениями, самцы мышей с дефицитом дисферлина были выбраны для исследования для сравнения новых данных с устройства DART с предыдущими данными. В будущих исследованиях самки мышей BLAJ будут включены для изучения влияния пола как биологической переменной по отношению к реакции на DART. Мыши, которым было ~ 1,5 года, были изучены, поскольку у них уже есть дистрофические изменения во многих группах мышц и, следовательно, моделируют патофизиологическое состояние, в котором мышцы могут быть у пациентов, которые уже имеют мышечную слабость и истощение и ищут реабилитационную помощь для поддержания мышечной массы и силы26.

протокол

Эксперименты, описанные в этой статье, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Государственном университете Уэйна, Детройт, штат Мичиган, США, в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (1996, опубликовано National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, США). В6. Мыши A-Dysfprmd/GeneJ (также известные как мыши BLAJ, самцы, ~ 1,5 года), которые моделировали LGMD2B / R2, были использованы для настоящего исследования. Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Изучите дизайн

  1. Выберите штамм (штаммы) мыши, относящийся к исследовательскому вопросу (вопросам) — например, исследованию B6. Мыши A-Dysfprmd / GeneJ (мыши BLAJ), если пытаются ответить на вопрос о том, вызывает ли концентрически смещенный DART широко распространенное повреждение мышц у мышей, которые моделируют LGMD2B / R2.
  2. Назначьте мышей в исследовательские группы на основе дизайна исследования - например, случайным образом назначьте мышей в группу тренировок с отягощениями с поправкой на дозировку (DART) или в изометрическую тренировочную группу (ISOM) и попытайтесь сбалансировать группы как можно лучше на основе соответствия по помету и / или возрасту (например, таблица 1).

2. Изготовление устройства DART

  1. Спроектируйте компоненты устройства DART с помощью соответствующего программного обеспечения для автоматизированного использования (САПР) (рисунок 1), выполнив следующие действия.
    1. Конструкция корпуса для подшипника колеса с низким коэффициентом трения (см. Таблицу материалов, основанная на конструкции подшипника блока подушки) со встроенным транспортиратором (для использования в качестве гониометра для измерения углов голеностопного сустава).
    2. Спроектируйте башню для корпуса ступичного подшипника плюс транспортир.
    3. Спроектируйте подножку для позиционирования стопы мыши. Спроектируйте ось для подключения подножки к ступичному подшипнику.
  2. Изготовьте компоненты устройства DART с помощью подходящего 3D-принтера (рисунок 1).
    1. Сохраните проекты, созданные с помощью программного обеспечения САПР, как стереолитографию (. STL) файлов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа . Файлы STL (Дополнительные кодовые файлы 1-4) могут быть использованы и изменены путем предоставления кредита соответствующему автору этой статьи и цитирования этой статьи.
    2. Откройте платформу . Файлы STL с подходящим программным обеспечением для нарезки (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Slicing преобразует виртуальную 3D-модель в стопку фрагментов, которые могут быть напечатаны последовательно 3D-принтером для создания 3D-объекта.
    3. С помощью программного обеспечения для нарезки генерируйте G-CODE автоматизированное производство (CAM, . GCODE) файлы, которые специфичны для 3D-принтера и нити, которая будет использоваться.
    4. Следуйте руководству по эксплуатации 3D-принтера (см. Таблицу материалов), чтобы напечатать компоненты устройства DART с помощью . Файлы GCODE.
    5. Выберите подходящую нить 3D-принтера, например полимолочную кислоту (PLA) 1,75 мм 1 кг/катушку, серый (см. Таблицу материалов).
  3. Соберите устройство DART, выполнив следующие действия.
    1. Вставьте подшипник колеса с низким коэффициентом трения 608 (диаметр отверстия 8 мм, наружный диаметр 22 мм, например, с керамическими шариками из нитрида кремния, размещенными в нержавеющей стали 420, см. Таблицу материалов) в корпус подшипника колеса (рисунок 1).
    2. Вставьте ось в отверстие ступичного подшипника (рисунок 1).
    3. Наклейте подножку на ось с помощью клея (см. Таблицу материалов), который подходит для склеивания PLA (рисунок 1).
    4. Поместите корпус ступичного подшипника над башней корпуса ступичного подшипника и прикрепите весь узел к акриловому основанию с помощью винтовых креплений (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет особых требований к размеру акриловой основы — она просто должна быть достаточно большой, чтобы вместить животное и устройство DART, и достаточно маленькой, чтобы поместиться на рабочей поверхности. Акриловая основа, используемая для настоящего исследования, составляет около 30 см в ширину, 45 см в длину и 0,5 см в толщину.

3. Подготовка мышей к DART или ISOM

  1. Поместите каждую мышь под общую анестезию с ингаляционным изофлураном, доставленным через подходящую систему анестезии (см. Таблицу материалов, 2%-5% для индукции; 1%-4% для поддержания; для эффекта), чтобы уменьшить стресс и боль.
    1. Индуцировать анестезию в индукционной камере анестезиологической системы (2%-5% изофлурана).
    2. Переведите мышь на носовой конус для поддержания анестезии при выполнении процедур на животном (1%-4% изофлурана). Подтвердить эффективность анестезии на основании отсутствия отмены задних конечностей до щипки пальца ноги от пары пинцетов.
    3. Обеспечьте тепловую поддержку — например, с помощью изотермической гелевой грелки и тепловой лампы, расположенной примерно на 1 м над мышью. Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что температура на акриловой основе и вокруг нее поддерживается на уровне ~ 38 ° C, чтобы мышь не перегревалась.
  2. Подготовьте кожу над левой большеберцовой передней (TA) мышцей мыши и над всем передним и боковым аспектами левой задней конечности для DART или ISOM.
    1. Удалите шерсть мыши кремом для удаления волос (крем для депиляции, см. Таблица материалов). Нанесите крем для депиляции и дайте ему поработать ~2 мин.
    2. Очистите ногу салфетками, смоченными в дистиллированной воде, чтобы удалить мех и весь остаточный крем с кожи. Кремы для депиляции могут раздражать и / или повреждать кожу, если их оставить на коже мыши на длительные периоды времени и, следовательно, полностью удалить.
    3. После удаления меха дезинфицируйте кожу одобренным методом скрабирования, например, раствором для скрабирования повидон-йодом и 70% этанолом.
  3. Нанесите защитное средство (например, вазелин) на глаза и депилированную кожу чистым ватным тампоном, чтобы защитить глаза и депилированную кожу от пересыхания.
  4. Поместите стабилизирующий штифт через метафиз большеберцовой кости.
    1. Нанесите 5% лидокаиновый крем на большеберцовую кость, чтобы обезболить область.
    2. Пропустите 26 G, полудюймовую, стерильную, подкожную иглу через самую широкую часть проксимальной части большеберцовой кости (т. Е. Метафиз большеберцовой кости, также известный как головка большеберцовой кости). После того, как стабилизирующий штифт закреплен, удалите пластиковую часть подкожной иглы, удерживая иглу стерильным гемостатом и сгибая пластиковую часть, пока она не сломается.
  5. Позиционируйте мышь для обучения DART или ISOM.
    1. Уложите мышь в положение лежа на спине. Убедитесь, что мышь по-прежнему надежно подключена к носовому конусу для поддержания анестезии.
    2. С помощью пары пинцета со стерильными наконечниками подайте булавку большеберцовой кости в металлический зажим для аллигатора (см. Таблицу материалов), чтобы концы большеберцового штифта удерживались зажимом аллигатора. Переместите регулируемый рычаг зажима аллигатора, чтобы убедиться, что нога мыши помещена на подножку устройства DART.
    3. Прикрепите ногу мыши к подножке устройства DART с помощью клейкой лабораторной ленты.
    4. Поместите ногу мыши под углом 90° по отношению к длинной оси большеберцовой кости мыши. При правильном размещении подножка будет перпендикулярна акриловому основанию (т.е. полу или тому, что считается горизонтальной плоскостью).
    5. Положите подножку на подошвенный упор, созданный путем помещения 18 G, 1,5 в длинную подкожную иглу через предварительно просверленные отверстия на транспорторе устройства DART (рисунок 1).

4. Обучение DART или ISOM

  1. Оптимизируйте размещение электродов, разместив биполярный, чрескожный, нервно-мышечный электростимуляционный (NMES, см. Таблицу материалов) электрод на инферолатеральном аспекте коленного сустава мыши (рисунок 1B).
    1. Одиночными импульсами (1 Гц) от лабораторного электростимулятора (см. Таблицу материалов) стимулируют малоберцовую ветвь седалищного нерва, которая обеспечивает двигательную иннервацию мышц дорсифлекса голеностопного сустава (рисунок 1В).
    2. Поскольку на переднюю (ТА) мышцу большеберцовой кости приходится более 90% общей сократительной силы, вырабатываемой мышцами дорсифлексалодыжки 31, обратите внимание на мышцу ТА живота и сухожилия для доказательства электрически вызванных сокращений подергивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой костный выступ, который соответствует кости малоберцовой кости, может помочь с размещением электрода, если тестер может почувствовать его через электрод. Это требует некоторой практики и обучения со стороны тестировщика, чтобы почувствовать оптимальное размещение электродов.
    3. Переместите стопу подошвенной флексии в отверстие на транспорторе, соответствующее 20° подошвенного сгибания, из положения, в котором стопа ортогональна (90°), в большеберцовую кость — это положение, в котором обычно наблюдается максимальный сократительный крутящий момент от мышцы ТА на основе предыдущих отчетов21. Возможно, это должно быть настроено пользователем на основе факторов, специфичных для мышей, которые изучаются.
    4. Визуализируйте крутящий момент с помощью динамометрического динамометра мыши, связав подножку устройства DART с подножкой динамометра — например, свяжите подножку устройства DART с изготовленной на заказ роботизированной подножкой динамометрической лодыжки с неэластичным шелковым швом (аналогично рисунку 1A) и привяжите шов к подножке динамометра (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подножка имеет отверстия, встроенные в дизайн 3D-печати. Размещение шва через пару отверстий, которые находятся во втором ряду от носка подножки, ставит шов на ~ 20 мм от оси дорсифлексии / подошвенной флексии (рисунок 1A, B). Динамометр был описан в предыдущих докладах 19,20,21,22.
  2. Оптимизируйте выходное напряжение от стимулятора NMES.
    1. После оптимизации размещения электрода оптимизируют амплитуду выходного напряжения от электростимулятора — это необходимо, чтобы ограничить NMES общим малоберцовым нервом и мышцей ТА и снизить риск возникновения совместных сокращений в подошвенных флексаторах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникают совместные сокращения, они могут быть визуализированы через крутящий момент динамометра, а также видны в подошвенном сгибании пальцев ног.
  3. Установите стимулятор NMES для обучения DART или ISOM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки, возможно, должны быть настроены пользователем на основе факторов, характерных для мышей, которые изучаются, и цели исследований.
    1. Установите стимулятор для производства повторяющихся импульсных поездов, частота которых составляет 125 Гц — эта частота производит максимальные слитые тетанические сокращения без переполнения NMES в другие группы мышц у мышей BLAJ21. Выполните это, отрегулировав циферблаты частоту импульсов (125 Гц), продолжительность поезда (500 мс) и поездов в секунду (1 поезд/с) и включив тумблер для повторения импульсных поездов.
    2. Установите стимулятор для получения импульсных поездов длительностью 500 мс, перемежающихся с отдыхом 500 мс между импульсными поездами.
    3. Переместите стопу подошвенной флексии в отверстие на транспорторе, соответствующее 160° длинной оси большеберцовой кости (70° подошвенное сгибание от стопы ортогональной к большеберцовой кости). Это положение, в которое нога мыши BLAJ может быть перемещена пассивно без сопротивления мягких тканей21.
    4. Для DART примените подходящее сопротивление, против которого мышца ТА должна работать концентрически — например, 5 г, как показано на рисунке 1A, B; см. кривую калибровки веса к крутящему моменту в дополнительном файле 1.
    5. Нанесите сопротивление, подвесив вес неэластичным шелковым швом, который прикреплен к подножке устройства DART (рисунок 1A, B).
    6. Отрегулируйте сопротивление - т.е. примените ~50% от максимума одного повторения (1RM) (например, 5 г, если мышь может поднять максимальный вес 10 г с одним сокращением), которое протягивает ногу через по меньшей мере половину доступного активного диапазона дорсифлексии.
    7. Выполните подходящую тренировку DART на мышах, назначенных в группу DART — например, выполните один бой тренировки DART, которая включает в себя четыре подхода по 10 повторений концентрических сокращений с 2-минутным отдыхом между подходами, аналогично прогрессивным программам тренировок с отягощениями, используемым у людей32 (см. Дополнительное видео 1).
    8. Выполните подходящую тренировку ISOM на мышах, назначенных в группу ISOM, например, выполните один бой тренировки ISOM, которая включает в себя четыре подхода по 10 повторений изометрических сокращений с 2-минутным отдыхом между подходами, аналогично DART (см. Дополнительное видео 2).
    9. Для тренировки ISOM поместите ногу мыши под углом 160° к длинной оси большеберцовой кости (подошвенное сгибание 70° от ортогональной стопы к голени) и поддерживайте это статическое положение, приклеив шелковый шов к подножке роботизированного динамометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку шов не может скользить, подножка устройства DART не может перемещаться в дорсифлексию, тем самым ограничивая дорсифлексоры изометрическим сжатием.

5. Постпроцедурный уход за мышами

  1. Примите меры предосторожности для поддержания надлежащей гигиены задней конечности и уменьшения боли в месте иглы.
    1. После тренировки DART или ISOM покройте видимую часть большеберцовой булавки тройной антибиотической мазью (400 ЕД/г бацитрацина, 3,5 мг/г неомицина и 5000 Ед/г полимиксина-В, см. Таблицу материалов), а затем осторожно извлеките штифт из медиальной стороны большеберцовой кости. Промыть кожу над боковым бедром и верхней частью ноги повидоном-йодом и стерильной водой. Нанесите 5% лидокаиновый крем на большеберцовую кость, чтобы контролировать боль в месте иглы.
  2. Позвольте мышам восстановиться после анестезии.
    1. Извлеките мышь из носового конуса и позвольте ей восстановиться после анестезии в восстановительной клетке, свободной от подстилки. Обеспечьте тепловую поддержку мыши, пока она восстанавливается после анестезии, например, с помощью изотермической гелевой грелки.
  3. Верните мышь в исходную клетку после того, как она полностью оправится от анестезии. Затем верните клетку в помещение для животных, где размещаются исследуемые мыши до проведения последующих экспериментов. Ежедневно наблюдайте за мышами.

6. Коллекция тканей

  1. Соберите мышцу TA мыши целиком и заморозьте для криоконсервации, выполнив следующие действия.
    1. Основываясь на исследовательском вопросе (вопросах), в подходящее время после обучения (например, через 3 дня после DART или ISOM), усыпьте мышей в соответствии с утвержденными протоколами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования мышей усыпляли при вывихе шейки матки под общим наркозом (ингаляционный изофлуран, 2%-5% для эффекта). Двусторонняя торакотомия обеспечила смерть.
    2. Рассекните задние конечности мыши, чтобы удалить тренируемую мышцу ТА (слева) и нетренчерцированную мышцу ТА (справа). Взвесьте собранные мышцы. Затем окуните каждую мышцу в минеральное масло для криозащиты и поместите мышцу на чистую лабораторную салфетку, чтобы промокнуть избыток масла21.
  2. Поместите мышцу на кусок алюминиевой фольги. Удерживайте край фольги с помощью длинного гемостата и быстро погружайте фольгу и мышцы в жидкий азот, содержащийся в подходящем пластиковом контейнере, чтобы заморозить мышцу.
    1. Примерно через 2 мин погружения в жидкий азот переместите замороженную мышцу на меченые криогенные флаконы. Храните флаконы в морозильной камере при температуре −80 °C до тех пор, пока это не понадобится для дальнейших исследований.

7. Гистологические исследования мышечной ткани

  1. Подготовьте криостатные участки мышцы ТА толщиной 5 мкм. Собирайте секции криостата на заряженных предметных стеклах микроскопа. Закрепите секции ацетоном, который держится холодным при −30 °C, и дайте секциям высохнуть на воздухе.
  2. Окрашивают участки мышечной ткани гематоксилином с последующим эозином (окрашивание H&E, см. Таблицу материалов).
    1. Погрузите срезы на 5 мин в гематоксилин (темно-синее ядерное пятно) в стеклянную витражную банку. Удалите избыток гематоксилина, промыв участки водопроводной водой до тех пор, пока не будет видно дальнейшего посинения воды.
    2. Погрузите срезы на 5 мин в реагент в стеклянную банку. Аспирируйте избыток реагента для окрашивания из секций стеклянной всасывающей пипеткой.
    3. Погрузить срезы на 5 мин в эозин (розовое цитоплазматическое пятно) в стеклянную витражную банку. Удалите избыток эозина, быстро и многократно (~ 10 раз) окунув срезы в 95% этанол в стеклянной витражной банке.
    4. Дайте секциям высохнуть на воздухе и приступайте к визуализации под световым микроскопом.
  3. Подготовьте мозаичные изображения с высоким разрешением целых поперечных сечений мышц ТА с помощью микроскопической визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователю, возможно, придется настроить следующие этапы визуализации и анализа изображений на основе своего микроскопа и программного обеспечения для сбора и анализа изображений.
    1. Захват цифровых изображений с помощью 10-кратного объектива светового микроскопа и цифровой камеры, установленной на микроскопе.
    2. Захватите около 15-20 изображений, двигаясь вдоль поперечного сечения каждой мышцы в виде сетки, так что каждое новое изображение перекрывает ~ 25% с предыдущим изображением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс помогает захватить набор изображений, которые могут быть обработаны цифровой плиткой (также известной как сшивание изображений) для создания композитного изображения с высоким разрешением всего поперечного сечения мышц TA (рисунок 2).
    3. Сохранение цифровых изображений в . Формат TIFF.
    4. Открытые цифровые изображения с помощью подходящего программного обеспечения для обработки и анализа изображений (см. Таблицу материалов).
    5. Выложите плитку или сшите отдельные изображения в составное изображение всей мышцы ТА с помощью следующих шагов: когда все отдельные перекрывающиеся изображения каждой мышцы ТА откроются в программном обеспечении, нажмите «Файл» > «Выбрать автоматизировать > выбрать фотослияние > выбрать коллаж > выбрать «Добавить открытые файлы» > нажмите «ОК».
    6. Когда будет подготовлено и отображено новое мозаичное/сшитое изображение мышцы ТА, сохраните изображение в . Формат TIFF для дальнейшего анализа.
  4. Оцените повреждение мышц путем визуального анализа на плиточных изображениях всей мышцы ТА с помощью подходящего программного обеспечения для анализа изображений.
    1. В программном обеспечении для анализа изображений выберите функцию Измерение в меню Анализ , чтобы очертить и измерить площадь всего поперечного сечения мышцы ТА (рисунок 2).
    2. В программном обеспечении для анализа изображений выберите функцию «Измерение» в меню «Анализ», чтобы очертить и измерить поврежденные области каждой мышцы ТА, то есть области, которые показывают цитоплазматическое нарушение мышечных волокон, отсутствующие мышечные волокна и инфильтрацию воспалительных клеток22 (рисунок 2).
    3. Выражают сумму общей площади повреждения в процентах от всей площади поперечного сечения мышцы ТА (рисунок 2, таблица 2).

8. Статистический анализ

  1. Организуйте данные, как показано в таблицах 1-3 , и выполняйте непарные Т-тесты (если тесты на нормальность и однородные дисперсии пройдены)33 или тесты Mann-Whitney Rank Sum (если тесты нормальности и однородных дисперсий не пройдены)21 с помощью подходящего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Результаты

Были изучены самцы мышей BLAJ, которым было ~ 1,5 года. Мыши BLAJ моделируют заболевание мышц человека, LGMD2B / R2. Эти мыши особенно восприимчивы к отсроченному повреждению мышц от одного приступа эксцентрических мышечных сокращений22,29. Поэтому мыши BLAJ были выбра?...

Обсуждение

В этой статье представлены пошаговые инструкции о том, как сконструировать устройство для выполнения типа прецизионной реабилитационной тренировки, называемой тренировкой сопротивления с поправкой на дозировку (DART). В работе также описывается применение устройства и методологии DART ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось грантами jain Foundation Inc., R03HD091648 от NICHD, пилотным грантом от AR3T в рамках NIH P2CHD086843, премией FRAP от EACPHS в Государственном университете Уэйна, пакетом стартапов факультета от Государственного университета Уэйна и субподрядом от 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) к JAR. Это исследование также финансировалось Исследовательским грантом Американской ассоциации физической терапии - Мичиган (APTA-MI) для JMB, MEP и JAR. Авторы выражают признательность доктору Ренуке Роше (доценту Университета Восточного Мичигана, Мичиган) за критическое прочтение рукописи и предоставление обратной связи. Авторы выражают признательность г-ну Ансельму Д. Мотхе за советы по 3D-печати. Авторы благодарят пациентов с дисферлинопатией, которые поделились своими историями на веб-сайте Jain Foundation в https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, особенно их опытом с физическими упражнениями.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball BearingAnmiao Star (N/A)AMS127High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscopeCarl Zeiss (Peabody, MA)Product #Axio Scope.A1Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice)The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin.Stock #012767Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrodeHarvard Apparatus, Holliston, MABS4 50–6824Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining DishThermoFisher (Waltham, MA)Catalog No. S17495Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. SoftwareUltimaker, Utrecht, NetherlandsUltimaker Cura 4.4.1.Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating padBraintree Scientific (Braintree, MA)Item #39DPHeating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LPink cytoplasmic stain
Gorilla Super GlueThe Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro PreciseCyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3Millipore Sigma (Burlington, MA)GHS332-1LDark blue stain for nuclei
HM525NX cryostatThermoFisher (Waltham, MA)Catalog #HM525NXCryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyThermoFisher (Waltham, MA)Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, USALabview 2014Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar FlasksThermoFisher (Waltham, MA)S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMDFlask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory creamSoftsheen Carson (New York, NY)N/ARazorless hair removal cream
Metal alligator clipJINSHANGTOPK (web-based business)24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring ClampsSpring clamp to hold tibial pin
Micrscope slidesGlobe Scientific (Mahwah, NJ)1354W. Diamond White Glass SlidesCharged microscope slides
Mineral OilThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printerMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)Mini V2 3D3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image softwareNational Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)NIH Image for WindowsImage processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4Adobe (San Jose, CA)Creative Suite (CS4). 64 bit version for WindowsImage processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unitGrass Instruments (West Warwick, RI)PSIU6 isolation unitIsolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture materialRoboz Surgical (Gaithersburg, MD)Roboz Surgical SUT152Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulatorGrass Instruments (West Warwick, RI)S48 StimulatorLaboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagentRicca Chemical Company (Arlington, TX)6697-32Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5Systat Software (San Jose, CA)SigmaStat version 3.5Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizerVetEquip (Livermore, CA)Item #901801Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointmentGlobal Health Products (wed-based business)Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic OintmentAntibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

Ссылки

  1. Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
  2. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
  3. Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H., Chandler, T. J., Brown, L. E. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. , 547-570 (2019).
  4. Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
  5. Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
  6. Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
  7. Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
  8. Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
  9. Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
  10. Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
  11. Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
  12. Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 39-59 (2022).
  13. Roche, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 61-84 (2022).
  14. Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
  15. . Dr. Gustav Zander's Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child's Play Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016)
  16. Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
  17. ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
  18. Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
  19. Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , (2012).
  20. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  21. Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
  22. Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
  23. Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies - Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
  24. . DYSFERLIN Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021)
  25. Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
  26. Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
  27. Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
  28. Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
  29. Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
  30. Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
  31. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
  32. Dutton, M. . Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , 238 (2011).
  33. Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
  34. Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist's guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
  35. Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
  36. Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers - A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
  37. Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
  38. Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
  39. Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
  40. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  41. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  42. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
  43. Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
  44. Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
  45. . Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation - Inaugural Scientific Retreat Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021)
  46. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
  47. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены