JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה ייחודית הנקראת אימון התנגדות מותאם מינון (DART), אשר ניתן לשלב במחקרי שיקום מדויקים המבוצעים בחיות קטנות, כגון עכברים.

Abstract

אימוני התנגדות פרוגרסיביים (PRT), הכוללים ביצוע התכווצויות שרירים כנגד עומסים חיצוניים גדולים יותר ויותר, יכולים להגדיל את מסת השריר ואת כוחם אצל אנשים בריאים ובאוכלוסיות מטופלים. יש צורך בכלי שיקום מדויקים כדי לבחון את הבטיחות והיעילות של PRT כדי לשמור ו/או לשחזר מסת שריר וחוזק במחקרים פרה-קליניים על מודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים. ניתן להשתמש במתודולוגיית PRT ובהתקן המתוארים במאמר זה כדי לבצע אימוני התנגדות מותאמים למינון (DART). מכשיר ה-DART יכול לשמש כדינמומטר עצמאי כדי להעריך באופן אובייקטיבי את מומנט ההתכווצות הקונצנטרי שנוצר על ידי דורסיפלקסורי הקרסול בעכברים או שניתן להוסיף אותו למערכת דינמומטריה איזוקינטית קיימת. ניתן לייצר את התקן ה- DART עם מדפסת תלת-ממד סטנדרטית המבוססת על ההוראות וקבצי הדפסה תלת-ממדית בקוד פתוח המסופקים בעבודה זו. המאמר מתאר גם את זרימת העבודה של מחקר להשוואת נזק שרירי הנגרם על ידי התכווצות הנגרמת על ידי התקף יחיד של DART לנזק לשרירים שנגרם על ידי התקף דומה של התכווצויות איזומטריות (ISOM) במודל עכבר של ניוון שרירים מסוג 2B/R2 (עכברי BLAJ). הנתונים של שמונה עכברי BLAJ (ארבעה בעלי חיים לכל מצב) מצביעים על כך שפחות מ-10% מהשריר הקדמי של הטיביאליס (TA) ניזוק מהתקף יחיד של DART או ISOM, כאשר DART היה פחות מזיק מ-ISOM.

Introduction

פעילות גופנית מעניקה יתרונות בריאותיים רבים לשרירי השלד (נבדקו ב-Vina et al.1). באופן ספציפי, אימוני התנגדות פרוגרסיביים (PRT), הכוללים ביצוע התכווצויות שרירים כנגד עומסים חיצוניים גדולים יותר ויותר (למשל, משקולות, משקולות, מעגלי משקל גלגלות כבלים), ידועים כמסייעים בהגדלת מסת השריר והכוח הן אצל אנשים בריאים והן אצל אוכלוסיות מטופלים (נסקרו בפרסומים קודמים 2,3 ). PRT מבוסס על עקרון עומס היתר, הקובע כי כאשר השריר מתכווץ כנגד עומסים חיצוניים גדולים יותר ויותר, הוא מסתגל על ידי הגדלת שטח החתך הפיזיולוגי שלו, כמו גם כושר ייצור כוח4. דגמים קיימים של PRT במכרסמים כוללים טיפוס בסולם עם התנגדות המופעלת על הזנב, התכווצות משותפת של שרירי אגוניסט כנגד התנגדות של אנטגוניסטים, ריצה עם רתמה משוקללת, תרגיל סקוואט המעורר על ידי התחשמלות, והתנגדות לריצת גלגלים 5,6,7,8,9,10 (נסקרה בפרסומים קודמים 11,12 ). עם זאת, אין כיום כלי מחקר לביצוע PRT ממוקד שרירים ומותאם מינון מדויק בעכברים הדומים מאוד לשיטות ולמכשירים של PRT המשמשים במחקר קליני בבני אדםובפרקטיקה 12,13. זה מגביל את יכולתם של חוקרים לחקור את הבטיחות והיעילות של PRT במינון מדויק במחקרים בסיסיים ופרה-קליניים בעכברים.

כדי להתגבר על מחסום זה, מתודולוגיית PRT ומכשיר מפותחים במחקר זה בהתבסס על עיצובי מעגלי כבל-גלגלת-משקל המשמשים בציוד אימון התנגדות באולמות התעמלות מודרניים14,15,16. שיטה זו של PRT מכונה אימון התנגדות מותאם מינון (DART), והמכשיר נקרא התקן DART. בנוסף לפונקציונליות שלו ככלי אימון שיקום מדויק, מכשיר ה- DART יכול לשמש גם כמכשיר עצמאי להערכה אובייקטיבית של מומנט ההתכווצות הקונצנטרי המרבי שיכול להיווצר על ידי השריר הקדמי של טיביאליס (TA) בעכבר, בדומה לאופן שבו מקסימום החזרה האחת (1RM, העומס המרבי שניתן להרים בהצלחה / להזיז / ללחוץ / לכרוע רק פעם אחת תוך שמירה על צורה טובה) מוערך בבני אדם17, 18. ניתן גם להצמיד את מכשיר ה-DART לדינמומטר איזוקינטי שנבנה בהתאמה אישית או מסחרית כדי למדוד את שיא הכוח הטטני האיזומטרי המיוצר על ידי שריר ה-TA בעכבר (דומה להתכווצות רצונית מקסימלית [MVC] בבני אדם) ולאחר מכן לבצע PRT מותאם מינון עם התנגדות המבוססת על כוח הטטני המרבי (למשל, 50% מכוח השיא).

מאמר זה מתאר את בנייתו של התקן DART ומסביר כיצד ניתן להצמיד אותו לדינמומטר שנבנה בהתאמה אישית, אשר תואר בפרסומים קודמים 19,20,21,22, כדי להעריך מומנט התכווצות ולבצע DART. המחקר מתאר גם כיצד נעשה שימוש במכשיר DART כדי להשוות נזק לשרירים הנגרם כתוצאה מפעילות גופנית שנגרם על ידי התקף יחיד של DART (4 סטים של 10 התכווצויות מוטות צנטריות עם 50% 1RM) לנזק שנגרם על ידי התקף דומה של התכווצויות איזומטריות (4 קבוצות של 10 התכווצויות איזומטריות) במודל עכבר של ניוון שרירים מסוג 2B (LGMD2B, או LGMDR2)23,24. במודל העכבר שנחקר חסר חלבון בשם דיספרלין, הממלא תפקיד חשוב בהגנה על שרירי השלד מפני פגיעה בשרירים לאחר התכווצויות אקסצנטריות מזיקות 22,25,26,27,28,29,30 . כמו כן, הוכח בעכברים זכרים חסרי דיספרלין כי פעילות גופנית כפויה מוטה צנטרית אינה מזיקה כמו פעילות גופנית כפויה מוטה באופן אקסצנטרי, וכי חשיפה מוקדמת לאימונים מוטים באופן קונצנטרי מציעה הגנה מפני פציעה מפני התקף נוסף של התכווצויות מוטות אקסצנטריות22. מכיוון שהמחקר הנוכחי נערך כדי לבחון את ההיתכנות של מתודולוגיית ה-DART והמכשיר הנוכחיים בביצוע אימוני התנגדות מותאמי מינון ומוטה קונצנטרית, עכברים זכרים עם מחסור בדיספרלין נבחרו לחקירה כדי להשוות נתונים חדשים ממכשיר ה-DART לנתונים קודמים. במחקרים עתידיים, נקבות עכברי BLAJ ייכללו כדי לחקור את השפעת המין כמשתנה ביולוגי ביחס לתגובה ל-DART. עכברים שהיו בני ~ 1.5 נחקרו מכיוון שכבר יש להם שינויים דיסטרופיים בקבוצות שרירים רבות, ולכן מודל למצב הפתופיזיולוגי שבו השרירים עשויים להיות בחולים שכבר יש להם חולשת שרירים ובזבוז והם מחפשים טיפול שיקומי כדי לשמור על מסת שריר וכוח26.

Protocol

הניסויים המתוארים במאמר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ויין סטייט, דטרויט, מישיגן, ארה"ב, בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (1996, פורסם על ידי National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, וושינגטון הבירה 20055, ארה"ב). ב6. עכברי A-Dysfprmd/GeneJ (עכברי BLAJ, זכרים, בני ~1.5 שנים) מדגם LGMD2B/R2 שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. תכנון לימודים

  1. בחר זנים של עכברים הרלוונטיים לשאלות המחקר - למשל, מחקר B6. עכברי A-Dysfprmd/GeneJ (עכברי BLAJ) אם מנסים לענות על השאלה האם DART מוטה קונצנטרית גורם לנזק נרחב לשרירים בעכברים המדגמים LGMD2B/R2.
  2. הקצה עכברים לקבוצות מחקר על סמך תכנון המחקר - לדוגמה, הקצה עכברים באופן אקראי לקבוצת אימוני התנגדות מותאמת מינון (DART) או לקבוצת אימון איזומטרית (ISOM), ונסה לאזן את הקבוצות בצורה הטובה ביותר האפשרית על סמך התאמה לפי המלטה ו/או גיל (לדוגמה, טבלה 1).

2. ייצור של התקן DART

  1. תכנן את רכיבי התקן ה-DART עם תוכנה מתאימה בעזרת מחשב (CAD) (איור 1) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. עיצוב בית למיסב גלגלים בעל חיכוך נמוך (ראו טבלת חומרים, בהתבסס על עיצוב מיסב בלוק כרית) עם משענת מובנית (לשימוש כגוניומטר למדידת זוויות מפרקי הקרסול).
    2. תכנן מגדל לדיור מיסב גלגלים בתוספת משגיח.
    3. עצבו לוחית למיקום כף הרגל של העכבר. עצבו סרן לחיבור לוחית הרגל למיסב הגלגלים.
  2. ייצור רכיבי התקן DART במדפסת תלת-ממד מתאימה (איור 1).
    1. שמור את העיצובים שנוצרו באמצעות תוכנת CAD כסטריאוליתוגרפיה (. סיומת STL) קבצים.
      הערה: ה- . ניתן להשתמש בקבצי STL (קבצי קידוד משלימים 1-4) ולשנותם על ידי מתן קרדיט למחבר המתאים של מאמר זה וציטוט מאמר זה.
    2. פתח את קובץ ה- . קובצי STL עם תוכנת חיתוך מתאימה (ראה טבלת חומרים).
      הערה: תוכנת חיתוך ממירה מודל תלת-ממדי וירטואלי לערימה של פרוסות, שמדפסת תלת-ממד יכולה להדפיס ברצף כדי ליצור אובייקט תלת-ממדי.
    3. באמצעות תוכנת חיתוך, צור ייצור בעזרת מחשב G-CODE (CAM, . סיומת GCODE) קבצים, שהם ספציפיים למדפסת התלת-ממד ולנימים שישמשו אותם.
    4. עקוב אחר המדריך למדפסת תלת-ממד (ראה טבלת חומרים) כדי להדפיס רכיבי התקן DART באמצעות . קבצי GCODE.
    5. בחר נימה מתאימה למדפסת תלת-ממד, כגון חומצה פולילקטית (PLA) 1.75 מ"מ 1 ק"ג/סליל, אפור (ראה טבלת חומרים).
  3. הרכיבו את התקן ה-DART לפי השלבים הבאים.
    1. הכנס מיסב גלגל בעל 608 חיכוך נמוך (קוטר נשא של 8 מ"מ, קוטר חיצוני של 22 מ"מ, כגון מיסב עם כדורי קרמיקה מסיליקון ניטריד המאוחסנים בפלדת אל-חלד 420, ראו טבלת חומרים) לתוך בית מיסב הגלגלים (איור 1).
    2. הכנס את הסרן לתוך הבור של מיסב הגלגלים (איור 1).
    3. הדבק את לוחית הרגל על הסרן באמצעות דבק (ראו טבלת חומרים) המתאים לחיבור PLA (איור 1).
    4. הנח את בית מיסב הגלגלים מעל מגדל בית מיסב הגלגלים וחבר את כל המכלול לבסיס אקרילי באמצעות מהדקי ברגים (איור 1).
      הערה: אין דרישות גודל ספציפיות לבסיס האקרילי - הוא רק צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל את החיה ואת מכשיר ה- DART וקטן מספיק כדי להתאים למשטח עבודה. הבסיס האקרילי ששימש למחקר הנוכחי הוא ברוחב של כ-30 ס"מ, באורך של 45 ס"מ ובעובי של 0.5 ס"מ.

3. הכנת עכברים ל-DART או ISOM

  1. יש למקם כל עכבר תחת הרדמה כללית עם איזופלורן בשאיפה המועבר דרך מערכת הרדמה מתאימה (ראו טבלת חומרים, 2%-5% לאינדוקציה; 1%-4% לתחזוקה; להשפעה) כדי להפחית מתח וכאב.
    1. השראת הרדמה בחדר האינדוקציה של מערכת ההרדמה (2%-5% איזופלוראן).
    2. העבירו את העכבר לחרוט אף כדי לשמור על הרדמה תוך ביצוע פרוצדורות על החיה (1%-4% איזופלורן). אשרו את יעילות ההרדמה על סמך היעדר נסיגה אחורית לצביטת בוהן מזוג פינצטות.
    3. ספק תמיכה תרמית - למשל, עם כרית חימום איזותרמית עם ג'ל ומנורת חום הממוקמת ~1 מ' מעל העכבר. בדוק עם מדחום כדי לוודא שהטמפרטורה על בסיס האקריליק ובסביבתו נשמרת ב~ 38 מעלות צלזיוס, כך שהעכבר לא יתחמם יתר על המידה.
  2. הכן את העור מעל שריר הטיביאליס הקדמי השמאלי (TA) של העכבר ומעל כל ההיבטים הקדמיים והרוחביים של החוט האחורי השמאלי עבור DART או ISOM.
    1. הסר את פרוות העכבר עם קרם להסרת שיער (קרם דפילציה, ראה טבלת חומרים). החל קרם דפילציה ולתת לו לעבוד במשך ~ 2 דקות.
    2. נקו את הרגל עם מגבונים ספוגים במים מזוקקים כדי להסיר את הפרווה ואת כל שאריות הקרם מהעור. קרמים דפילטוריים עלולים לגרות ו/או להזיק לעור אם משאירים אותם על עור העכבר לפרקי זמן ארוכים ולכן מסירים אותם לחלוטין.
    3. לאחר הסרת הפרווה, יש לחטא את העור בשיטת קרצוף מאושרת, כגון בתמיסת קרצוף פובידון-יוד ו-70% אתנול.
  3. יש למרוח חומר מגן (למשל, פטרולאטום) על העיניים ועל העור הנטוי בעזרת צמר גפן נקי כדי להגן על העיניים ועל העור הנטוי מפני ייבוש.
  4. מניחים סיכה מייצבת דרך המטפיזה הטיביאלית.
    1. יש למרוח קרם לידוקאין 5% על השוקה כדי להקהות את האזור.
    2. מעבירים מחט היפודרמית בגודל 26 גרם, חצי אינץ', סטרילית, דרך החלק הרחב ביותר של החלק הפרוקסימלי של העצם הטיביאלית (כלומר, המטאפיזה הטיביאלית, הידועה גם בשם הראש הטיביאלי). לאחר הידוק הסיכה המייצבת, הסר את חלק הפלסטיק של המחט ההיפודרמית על ידי החזקת המחט בהמוסטאט סטרילי וכיפוף חלק הפלסטיק עד שהוא מתנתק.
  5. מקם את העכבר לאימון DART או ISOM.
    1. הנח את העכבר במצב שכיבה. ודא שהעכבר עדיין מחובר היטב לחרוט האף כדי לשמור על הרדמה.
    2. בעזרת זוג פינצטות סטריליות, מזינים את הסיכה הטיביאלית לתוך קליפס תנין מתכתי (ראו טבלת חומרים), כך שקצות הסיכה הטיביאלית מוחזקים על ידי מהדק התנין. הזז את הזרוע המתכווננת של מהדק התנין כדי להבטיח שכף הרגל של העכבר תונח על לוחית הרגל של התקן ה- DART.
    3. הצמידו את כף רגלו של העכבר ללוחית הרגל של התקן DART עם סרט מעבדה דביק.
    4. מקם את כף הרגל של העכבר בזווית של 90° ביחס לציר הארוך של העצם הטיביאלית של העכבר. אם הוא ממוקם נכון, לוחית הרגליים תהיה בניצב לבסיס האקרילי (כלומר, הרצפה או מה שנחשב למישור האופקי).
    5. הנח את לוחית הרגל על מעצור הפלנטרפלקסיה שנוצר על-ידי הנחת מחט היפודרמית ארוכה של 18 גרם, 1.5 אינץ' דרך החורים המקדימים על המשקוף של התקן ה-DART (איור 1).

4. הדרכת DART או ISOM

  1. מטב את מיקום האלקטרודה על-ידי הצבת אלקטרודה של גירוי חשמלי עצבי-שרירי דו-קוטבי, טרנס-עורי (NMES, ראו טבלת חומרים) על ההיבט האינפרולטרלי של מפרק הברך של העכבר (איור 1B).
    1. עם פולסים בודדים (1 הרץ) ממגרה חשמלי במעבדה (ראו טבלת חומרים), עוררו את הענף הפיבולרי של העצב הסיאטי, המספק עצבנות מוטורית לשרירי הקרסול (איור 1B).
    2. מכיוון ששריר הטיביאליס הקדמי (TA) מהווה למעלה מ-90% מכוח ההתכווצות הכולל המיוצר על ידי שרירי הקרסול דורסיפלקסור31, התבוננו בבטן ובגיד של שריר ה-TA כדי למצוא עדות להתכווצויות עווית חשמליות.
      הערה: בולטות גרמית קלה המתכתבת עם עצם הפיבולה עשויה לסייע במיקום האלקטרודה אם הבודק יכול להרגיש אותה דרך האלקטרודה. זה דורש קצת תרגול ולמידה מצד הבוחן כדי לקבל תחושה של מיקום אלקטרודות אופטימלי.
    3. הזיזו את עצירת הפלנטרפלקסיה לחור במדחף המתאים ל-20° של פלנטרפלקסיה מהמיקום שבו כף הרגל אורתוגונלית (90°) אל השוקה - זהו המיקום שבו נצפה בדרך כלל מומנט התכווצות מקסימלי משריר ה-TA על סמך דיווחים קודמים21. ייתכן שהמשתמש יצטרך להתאים אישית זאת בהתבסס על גורמים ספציפיים לעכברים הנחקרים.
    4. דמיינו את מומנט העוויתות עם דינמומטר עכבר על-ידי קישור לוחית הרגל של מכשיר ה-DART ללוחית כף הרגל של הדינמומטר - לדוגמה, קשרו את לוחית הרגל של מכשיר ה-DART ללוחית דינמית רובוטית של הקרסול שנבנתה בהתאמה אישית עם תפר משי לא אלסטי (בדומה לאיור 1A) והצמידו את התפר ללוחית הדינמומטר (ראו טבלת חומרים).
      הערה: לוח הרגליים כולל חורים המובנים בעיצוב ההדפסה התלת-ממדית. הצבת התפר דרך זוג החורים שנמצאים בשורה השנייה מקצה הבוהן של לוחית הרגל מעמידה את התפר במרחק של ~20 מ"מ מציר הדורסיפלקסיה/פלנטרפלקסיה (איור 1A, B). הדינמומטר תואר בדוחות קודמים 19,20,21,22.
  2. מטב את יציאת המתח ממגרה NMES.
    1. לאחר אופטימיזציה של מיקום האלקטרודה, מטב את המשרעת של יציאת המתח מהמגרה החשמלי - הדבר נחוץ כדי להגביל את NMES לעצב הפיבולרי המשותף ולשריר TA ולהפחית את הסיכון לעורר התכווצויות משותפות בפלנטפלקסורים.
      הערה: אם מעוררים התכווצויות משותפות, ניתן לדמיין אותן דרך פלט המומנט מהדינמומטר וגם לראות אותן ב-plantarflexing של הבהונות.
  3. הגדר את מגרה NMES לאימוני DART או ISOM.
    הערה: ייתכן שהמשתמש יצטרך להתאים אישית את ההגדרות הבאות בהתבסס על גורמים ספציפיים לעכברים הנחקרים ומטרת המחקרים.
    1. הגדר את הגירוי לייצר רכבות דופק חוזרות ונשנות בתדר של 125 הרץ - תדר זה מייצר התכווצויות טטניות מתמזגות מקסימליות ללא הצפה של NMES לקבוצות שרירים אחרות בעכברי BLAJ21. בצע זאת על-ידי כוונון החוגות לתדר פולסים (125 הרץ), משך הרכבת (500 אלפיות השנייה) ורכבות לשנייה (1 רכבת/שנייה) והפעלת מתג החלפת המצב לרכבות דופק חוזרות.
    2. הגדר מגרה כדי לייצר רכבות דופק שאורכן 500 מילישניות משולבות עם מנוחה של 500 מילישניות בין רכבות דופק.
    3. הזיזו את עצירת הפלנטרפלקסיה לחור על המשקוף המתאים ל-160° לציר הארוך של השוקה (70° פלנטרפלקסיה מאורתוגונלית כף הרגל ועד השוקה). זוהי התנוחה שאליה ניתן להזיז את כף רגלו של עכבר BLAJ באופן פסיבי ללא התנגדות לרקמות רכות21.
    4. עבור DART, הפעילו התנגדות מתאימה שכנגדה שריר ה-TA צריך לעבוד בצורה קונצנטרית – למשל, 5 גרם כפי שמוצג באיור 1A, B; ראה את עקומת כיול המשקל למומנט בקובץ משלים 1.
    5. הפעל התנגדות על-ידי תליית המשקולת עם תפר משי לא אלסטי הקשור ללוחית הרגל של מכשיר ה-DART (איור 1A, B).
    6. כוונן את ההתנגדות - כלומר, החל ~ 50% מהמקסימום של חזרה אחת (1RM) (למשל, 5 גרם אם העכבר יכול להרים משקל מרבי של 10 גרם עם כיווץ יחיד), אשר מושך את כף הרגל דרך לפחות מחצית מהטווח הפעיל הזמין של dorsiflexion.
    7. בצעו אימוני DART מתאימים בעכברים שהוקצו לקבוצת ה-DART - לדוגמה, בצעו התקף יחיד של אימוני DART, הכולל ארבעה סטים של 10 חזרות על התכווצויות קונצנטריות עם מנוחה של 2 דקות בין סטים, בדומה לתוכניות אימוני התנגדות פרוגרסיביות המשמשות בבני אדם32 (ראו סרטון משלים 1).
    8. בצע אימון ISOM מתאים בעכברים שהוקצו לקבוצת ISOM - לדוגמה, בצע התקף יחיד של אימון ISOM, הכולל ארבעה סטים של 10 חזרות על התכווצויות איזומטריות עם מנוחה של 2 דקות בין סטים, בדומה ל- DART (ראה סרטון משלים 2).
    9. לאימון ISOM, מקם את כף הרגל של העכבר בזווית של 160° לציר הארוך של השוקה (70° plantarflexion מאורתוגונלית כף הרגל לטיביה), ושמור על מיקום סטטי זה על ידי הצמדת תפר המשי ללוחית הרגל של הדינמומטר הרובוטי.
      הערה: מכיוון שהתפר אינו יכול להחליק, לוחית הרגל של התקן DART אינה יכולה לנוע לתוך דורסיפלקסיה, ובכך מגבילה את הדורסיפלקסורים להתכווץ באופן איזומטרי.

5. טיפול פוסט-פרוצדורלי בעכברים

  1. נקוט אמצעי זהירות כדי לשמור על היגיינה נאותה של hindlimb התאמן ולהפחית את הכאב באתר המחט.
    1. לאחר אימון DART או ISOM, מצפים את החלק הנראה לעין של הסיכה הטיביאלית במשחה אנטיביוטית משולשת (400 U/g של בציטרצין, 3.5 מ"ג/גרם של נאומיצין, ו-5000 U/g של פולימיקסין-B, ראו טבלת חומרים) ולאחר מכן משכו את הסיכה בזהירות מהצד המדיאלי של השוקה. יש לשטוף את העור מעל הירך הצידית והרגל העליונה עם פובידון-יוד ומים סטריליים. יש למרוח קרם לידוקאין 5% על השוקה כדי לשלוט בכאבים באתר המחט.
  2. אפשרו לעכברים להתאושש מההרדמה.
    1. הסר את העכבר מקונוס האף ואפשר לו להתאושש מהרדמה בכלוב התאוששות נקי ממצעים. ספק תמיכה תרמית לעכבר בזמן שהוא מתאושש מהרדמה, למשל, באמצעות כרית חימום איזותרמית לג'ל.
  3. החזירו את העכבר לכלוב המקורי שלו לאחר שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה. לאחר מכן, החזירו את הכלוב למתקן החי, שם שוכנים עכברי המחקר עד לביצוע ניסויי מעקב. עקוב אחר העכברים מדי יום.

6. איסוף רקמות

  1. קציר שריר TA של העכבר בשלמותו והקפאה מהירה לשימור בהקפאה לפי השלבים הבאים.
    1. בהתבסס על שאלות המחקר, בזמן מתאים לאחר האימון (למשל, 3 ימים לאחר DART או ISOM), הרדימו את העכברים על פי פרוטוקולים מאושרים.
      הערה: במחקר הנוכחי, עכברים הומתו על ידי נקע צוואר הרחם בהרדמה כללית (איזופלורן בשאיפה, 2%-5% להשפעה). כריתת בית החזה הדו-צדדית הבטיחה מוות.
    2. נתחו את אחורי העכבר כדי להסיר את שריר ה-TA המופעל (משמאל) ואת שריר ה-TA הלא ממומש (מימין). שוקלים את השרירים שנקטפו. לאחר מכן, טבלו כל שריר בשמן מינרלי להגנה מפני קריותרפיה והניחו את השריר על מגבון מעבדה נקי כדי להכתים את עודפי השמן21.
  2. מניחים את השריר על חתיכת רדיד אלומיניום. החזיקו את קצה נייר הכסף בהמוסטאט ארוך וטבלו במהירות את נייר הכסף והשריר לתוך חנקן נוזלי הכלול במיכל פלסטיק מתאים כדי להקפיא את השריר.
    1. לאחר כ-2 דקות של טבילה בחנקן נוזלי, העבירו את השריר הקפוא לבקבוקונים קריוגניים המסומנים. אחסנו את הבקבוקונים במקפיא של 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך במחקרים נוספים.

7. מחקרים היסטולוגיים על רקמת שריר

  1. הכינו מקטעי קריוסטאט של שריר TA בעובי 5 מיקרומטר. לאסוף קטעי cryostat על שקופיות מיקרוסקופ טעון. לתקן את החלקים עם אצטון שנשמר קר ב -30 מעלות צלזיוס ולאפשר למקטעים להתייבש באוויר.
  2. הכתימו את חלקי רקמת השריר בהמטוקסילין ואחריו אוזין (צביעת H&E, ראו טבלת חומרים).
    1. לטבול את החלקים במשך 5 דקות בהמטוקסילין (כתם גרעיני כחול כהה) בצנצנת צביעה מזכוכית. הסר עודפי המטוקסילין על ידי שטיפת החלקים במי ברז עד שלא נראה טשטוש נוסף של מים.
    2. טבלו את החלקים במשך 5 דקות בריאגנט טשטוש בצנצנת זכוכית. שאפו ריאגנט טשטוש עודף מהקטעים עם פיפטה יניקה מזכוכית.
    3. לטבול את החלקים במשך 5 דקות ב eosin (כתם ציטופלסמי ורוד) בצנצנת צביעה זכוכית. הסר עודפי eosin על ידי טבילת החלקים במהירות ושוב ושוב (~ 10 פעמים) לתוך 95% אתנול בצנצנת צביעה זכוכית.
    4. אפשרו למקטעים להתייבש באוויר והמשיכו לדמיין תחת מיקרוסקופ אור.
  3. הכן תמונות אריחים ברזולוציה גבוהה של חתכי שרירי TA שלמים באמצעות הדמיה במיקרוסקופ.
    הערה: ייתכן שהמשתמש יצטרך להתאים אישית את שלבי ההדמיה וניתוח התמונות הבאים בהתבסס על המיקרוסקופ ועל תוכנת הרכישה והניתוח של התמונות.
    1. צלם תמונות דיגיטליות עם עדשת המטרה פי 10 של מיקרוסקופ אור ומצלמה דיגיטלית המותקנת על המיקרוסקופ.
    2. צלם כ- 15-20 תמונות, תוך תנועה לאורך החתך של כל שריר באופן דמוי רשת, כך שכל תמונה חדשה חופפת ~ 25% עם התמונה הקודמת.
      הערה: תהליך זה עוזר ללכוד קבוצה של תמונות שניתן לפרוס באופן דיגיטלי (המכונה גם תפירת תמונה) כדי ליצור תמונה מורכבת ברזולוציה גבוהה של כל חתך שריר ה- TA (איור 2).
    3. שמור תמונות דיגיטליות ב- . פורמט TIFF.
    4. פתח תמונות דיגיטליות עם תוכנה מתאימה לעיבוד וניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים).
    5. אריח או תפר תמונות בודדות לתמונה מורכבת של כל שריר ה- TA באמצעות השלבים הבאים: כאשר כל התמונות החופפות הנפרדות של כל שריר TA פתוחות בתוכנה, לחץ על קובץ > בחר הפוך לאוטומטי > בחר מיזוג תמונות > בחר קולאז' > בחר הוסף קבצים פתוחים > לחץ על אישור.
    6. כאשר תמונה חדשה מרוצפת/תפורה של שריר TA מוכנה ומוצגת, שמור את התמונה ב- . פורמט TIFF לניתוחים נוספים.
  4. כימות נזק לשרירים על ידי ניתוח חזותי בתמונות המרוצפות של כל שריר ה- TA באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה.
    1. בתוכנת ניתוח התמונה, בחר את הפונקציה Measure בתפריט נתח כדי לתאר ולמדוד את האזור של כל חתך שריר ה- TA (איור 2).
    2. בתוכנת ניתוח התמונות, בחרו את פונקציית המדידה בתפריט ' נתח' כדי לתאר ולמדוד את האזורים של כל שריר TA שניזוקו – כלומר, אזורים שמראים הפרעה ציטופלסמית בסיבי השריר, היעדר סיבי שריר וחדירת תאי דלקת22 (איור 2).
    3. בטא את סכום שטח הנזק הכולל כאחוז מכלל שטח החתך של שריר ת"א (איור 2, טבלה 2).

8. ניתוחים סטטיסטיים

  1. ארגן נתונים כפי שמוצג בטבלאות 1-3 ובצע בדיקות T שאינן מזווגות (אם בדיקות של נורמליות ושונות הומוגנית עוברות)33 או מבחני Mann-Whitney Rank Sum (אם בדיקות של נורמליות ושונות הומוגנית לא עברו)21 עם תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

עכברים זכרים של BLAJ, שהיו בני ~ 1.5 שנים, נחקרו. עכברי BLAJ מדגימים את מחלת השרירים האנושית, LGMD2B/R2. עכברים אלה רגישים במיוחד לפגיעה מאוחרת בשרירים כתוצאה מהתקף יחיד של התכווצויות שרירים אקסצנטריות22,29. עכברי BLAJ נבחרו, אם כן, למחקרים אלה כדי ללמוד אם ניתן לבצע DART באופ...

Discussion

מאמר זה מציג הוראות שלב אחר שלב כיצד לבנות מכשיר לביצוע סוג של אימון שיקום מדויק הנקרא אימון התנגדות מותאם מינון (DART). העבודה מתארת גם את היישום של מכשיר ה-DART ואת המתודולוגיה במחקר אימון להשוואת נזק לשרירים 3 ימים לאחר התקף יחיד של DART (קבוצת DART) עם נזק 3 ימים לאחר התקף דומה של אימון איזומטרי (ק?...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענקים מקרן Jain Inc., R03HD091648 מ- NICHD, מענק פיילוט מ- AR3T תחת NIH P2CHD086843, פרס FRAP מ- EACPHS באוניברסיטת ויין סטייט, חבילת סטארט-אפ של הפקולטה מאוניברסיטת ויין סטייט, וקבלן משנה מ- 1R01AR079884-01 (פיטר ל. ג'ונס PI) ל- JAR. מחקר זה מומן גם על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקאית לפיזיותרפיה - מישיגן (APTA-MI) ל-JMB, MEP ו-JAR. המחברים מודים לד"ר רנוקה רושה (פרופסור חבר, אוניברסיטת מזרח מישיגן, מישיגן) על כך שקראה את כתב היד באופן ביקורתי וסיפקה משוב. המחברים מודים למר אנסלם ד. מוטה על ייעוץ בנושא הדפסה בתלת-ממד. המחברים מודים למטופלים עם דיספרלינופתיות ששיתפו את סיפוריהם באתר האינטרנט של קרן ג'יין ב-https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, ובמיוחד את חוויותיהם מפעילות גופנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball BearingAnmiao Star (N/A)AMS127High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscopeCarl Zeiss (Peabody, MA)Product #Axio Scope.A1Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice)The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin.Stock #012767Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrodeHarvard Apparatus, Holliston, MABS4 50–6824Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining DishThermoFisher (Waltham, MA)Catalog No. S17495Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. SoftwareUltimaker, Utrecht, NetherlandsUltimaker Cura 4.4.1.Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating padBraintree Scientific (Braintree, MA)Item #39DPHeating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LPink cytoplasmic stain
Gorilla Super GlueThe Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro PreciseCyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3Millipore Sigma (Burlington, MA)GHS332-1LDark blue stain for nuclei
HM525NX cryostatThermoFisher (Waltham, MA)Catalog #HM525NXCryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyThermoFisher (Waltham, MA)Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, USALabview 2014Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar FlasksThermoFisher (Waltham, MA)S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMDFlask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory creamSoftsheen Carson (New York, NY)N/ARazorless hair removal cream
Metal alligator clipJINSHANGTOPK (web-based business)24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring ClampsSpring clamp to hold tibial pin
Micrscope slidesGlobe Scientific (Mahwah, NJ)1354W. Diamond White Glass SlidesCharged microscope slides
Mineral OilThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printerMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)Mini V2 3D3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image softwareNational Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)NIH Image for WindowsImage processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4Adobe (San Jose, CA)Creative Suite (CS4). 64 bit version for WindowsImage processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unitGrass Instruments (West Warwick, RI)PSIU6 isolation unitIsolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture materialRoboz Surgical (Gaithersburg, MD)Roboz Surgical SUT152Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulatorGrass Instruments (West Warwick, RI)S48 StimulatorLaboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagentRicca Chemical Company (Arlington, TX)6697-32Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5Systat Software (San Jose, CA)SigmaStat version 3.5Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizerVetEquip (Livermore, CA)Item #901801Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointmentGlobal Health Products (wed-based business)Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic OintmentAntibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

References

  1. Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
  2. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
  3. Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H., Chandler, T. J., Brown, L. E. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. , 547-570 (2019).
  4. Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
  5. Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
  6. Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
  7. Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
  8. Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
  9. Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
  10. Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
  11. Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
  12. Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 39-59 (2022).
  13. Roche, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 61-84 (2022).
  14. Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
  15. . Dr. Gustav Zander's Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child's Play Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016)
  16. Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
  17. ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
  18. Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
  19. Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , (2012).
  20. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  21. Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
  22. Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
  23. Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies - Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
  24. . DYSFERLIN Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021)
  25. Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
  26. Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
  27. Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
  28. Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
  29. Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
  30. Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
  31. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
  32. Dutton, M. . Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , 238 (2011).
  33. Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
  34. Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist's guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
  35. Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
  36. Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers - A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
  37. Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
  38. Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
  39. Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
  40. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  41. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  42. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
  43. Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
  44. Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
  45. . Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation - Inaugural Scientific Retreat Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021)
  46. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
  47. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved