Dosiertes Widerstandstraining bei Mäusen mit reduziertem Risiko für Muskelschäden

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Technik namens dosage-adjusted resistance training (DART), die in Präzisionsrehabilitationsstudien an Kleintieren wie Mäusen integriert werden kann.

Zusammenfassung

Progressives Widerstandstraining (PRT), bei dem Muskelkontraktionen gegen zunehmend größere äußere Belastungen durchgeführt werden, kann die Muskelmasse und -kraft bei gesunden Personen und in Patientenpopulationen erhöhen. Es besteht ein Bedarf an Präzisionsrehabilitationsinstrumenten, um die Sicherheit und Wirksamkeit von PRT zur Erhaltung und/oder Wiederherstellung von Muskelmasse und -kraft in präklinischen Studien an Klein- und Großtiermodellen zu testen. Die in diesem Artikel beschriebene PRT-Methodik und das PRT-Gerät können verwendet werden, um ein dosisangepasstes Widerstandstraining (DART) durchzuführen. Das DART-Gerät kann als eigenständiges Dynamometer verwendet werden, um das konzentrische kontraktile Drehmoment, das von den Knöcheldorsiflexoren bei Mäusen erzeugt wird, objektiv zu bewerten, oder kann zu einem bereits vorhandenen isokinetischen Dynamometriesystem hinzugefügt werden. Das DART-Gerät kann mit einem Standard-3D-Drucker basierend auf den Anweisungen und Open-Source-3D-Druckdateien hergestellt werden, die in dieser Arbeit bereitgestellt werden. Der Artikel beschreibt auch den Workflow für eine Studie, um kontraktionsinduzierte Muskelschäden zu vergleichen, die durch einen einzelnen Anfall von DART verursacht werden, mit Muskelschäden, die durch einen vergleichbaren Anfall von isometrischen Kontraktionen (ISOM) in einem Mausmodell der Gliedmaßengürtel-Muskeldystrophie Typ 2B / R2 (BLAJ-Mäuse) verursacht werden. Die Daten von acht BLAJ-Mäusen (vier Tiere für jede Bedingung) deuten darauf hin, dass weniger als 10% des Musculus tibialis anterior (TA) durch einen einzigen Anfall von DART oder ISOM geschädigt wurden, wobei DART weniger schädlich war als ISOM.

Einleitung

Bewegung verleiht der Skelettmuskulatur zahlreiche gesundheitliche Vorteile (überprüft in Vina et ^al.1). Insbesondere ist bekannt, dass progressives Widerstandstraining (PRT), bei dem Muskelkontraktionen gegen zunehmend größere äußere Belastungen (z. B. Langhanteln, Hanteln, Seilzug-Gewichtsschaltungen) durchgeführt werden, dazu beiträgt, die Muskelmasse und -kraft sowohl bei gesunden Personen als auch bei Patientenpopulationen zu erhöhen (überprüft in früheren Publikationen ^2,3 ). PRT basiert auf dem Überlastprinzip, das besagt, dass sich der Muskel, wenn er sich gegen immer größere äußere Belastungen zusammenzieht, anpasst, indem er seine physiologische Querschnittsfläche sowie seine Krafterzeugungskapazität vergrößert⁴. Bestehende Modelle von PRT bei Nagetieren umfassen Leiterklettern mit Widerstand am Schwanz, Co-Kontraktion von Agonistenmuskeln gegen Widerstand von Antagonisten, Laufen mit einem gewichteten Gurtzeug, eine Hockenübung, die durch einen elektrischen Schlag ausgelöst wird, und Widerstand gegen Radlauf 5,6,7,8,9,10 (überprüft in früheren Publikationen ^11,12 ). Derzeit gibt es jedoch keine Forschungsinstrumente, um eine präzise muskelgezielte, dosisangepasste PRT bei Mäusen durchzuführen, die den PRT-Methoden und -Geräten ähneln, die in der klinischen Forschung und Praxis am Menschen verwendet werden^12,13. Dies schränkt die Fähigkeit der Forscher ein, die Sicherheit und Wirksamkeit von genau dosiertem PRT in grundlegenden und präklinischen Studien an Mäusen zu untersuchen.

Um diese Barriere zu überwinden, werden in dieser Studie eine PRT-Methodik und ein Gerät entwickelt, die auf den Kabel-Riemenscheiben-Gewichts-Schaltungsdesigns basieren, die in Widerstandstrainingsgeräten in modernen Turnhallen verwendet^{werden 14,15,16}. Diese Methode des PRT wird als dosisangepasstes Widerstandstraining (DART) bezeichnet, und das Gerät wird als DART-Gerät bezeichnet. Zusätzlich zu seiner Funktionalität als Präzisions-Rehabilitations-Trainingswerkzeug kann das DART-Gerät auch als eigenständiges Instrument verwendet werden, um das maximale konzentrische kontraktile Drehmoment, das vom Musculus tibialis anterior (TA) in einer Maus erzeugt werden kann, objektiv zu bewerten, ähnlich wie das Maximum von einer Wiederholung (1RM, die maximale Belastung, die nur einmal erfolgreich gehoben / bewegt / gedrückt / gehogt werden kann) bei Menschen beurteilt wird^{17. 18}. Das DART-Gerät kann auch mit einem speziell angefertigten oder kommerziellen isokinetischen Dynamometer gekoppelt werden, um die isometrische tetanische Spitzenkraft zu messen, die vom TA-Muskel in einer Maus erzeugt wird (vergleichbar mit der maximalen freiwilligen Kontraktion [MVC] beim Menschen) und dann eine dosisangepasste PRT mit einem Widerstand durchzuführen, der auf der maximalen tetanischen Kraft basiert (z. B. 50% der Spitzenkraft).

Dieser Artikel beschreibt die Konstruktion des DART-Geräts und erklärt, wie es mit einem speziell angefertigten Dynamometer gekoppelt werden kann, das in früheren Publikationen 19,20,21,22 beschrieben wurde^, um das kontraktile Drehmoment zu bewerten und DART durchzuführen. Die Studie beschreibt auch, wie das DART-Gerät verwendet wurde, um belastungsinduzierte Muskelschäden zu vergleichen, die durch einen einzigen Anfall von DART (4 Sätze von 10 konzentrisch verzerrten Kontraktionen mit 50% 1RM) verursacht wurden, mit Schäden, die durch einen vergleichbaren Anfall von isometrischen Kontraktionen (4 Sätze von 10 isometrischen Kontraktionen) in einem Mausmodell der Gliedmaßengürtel-Muskeldystrophie Typ 2B (LGMD2B, oder LGMDR2)^23,24. Dem untersuchten Mausmodell fehlt ein Protein namens Dysferlin, das eine wichtige Rolle beim Schutz der Skelettmuskulatur vor verzögert einsetzenden Muskelschäden nach schädlichen exzentrischen Kontraktionen spielt 22,25,26,27,28,29,30 . Es wurde auch bei männlichen Mäusen mit Dysferlin-Mangel gezeigt, dass konzentrisch voreingenommenes Zwangstraining nicht so schädlich ist wie exzentrisch voreingenommenes Zwangstraining und dass eine vorherige Exposition gegenüber konzentrisch voreingenommenem Training Schutz vor Verletzungen durch einen nachfolgenden Anfall exzentrisch voreingenommener Kontraktionen bietet²². Da die aktuelle Studie durchgeführt wurde, um die Machbarkeit der derzeitigen DART-Methodik und des Geräts bei der Durchführung eines dosisangepassten, konzentrisch verzerrten Widerstandstrainings zu testen, wurden männliche Dysferlin-defiziente Mäuse für die Untersuchung ausgewählt, um neue Daten aus dem DART-Gerät mit früheren Daten zu vergleichen. In zukünftigen Studien werden weibliche BLAJ-Mäuse einbezogen, um die Wirkung des Geschlechts als biologische Variable in Bezug auf die Reaktion auf DART zu untersuchen. Mäuse, die ~1,5 Jahre alt waren, wurden untersucht, da sie bereits dystrophische Veränderungen in vielen Muskelgruppen aufweisen und daher den pathophysiologischen Zustand modellieren, in dem sich Muskeln bei Patienten befinden könnten, die bereits Muskelschwäche und -schwund haben und rehabilitative Pflege suchen, um Muskelmasse und Kraft zu erhalten²⁶.

Protokoll

Die in diesem Artikel beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (1996, veröffentlicht von National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, USA) genehmigt. B6. A-Dysf^prmd/GeneJ-Mäuse (alias BLAJ-Mäuse, Männchen, ~1,5 Jahre alt) mit dem Modell LGMD2B/R2 wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Studiendesign

1. Wählen Sie Mausstämme aus, die für die Forschungsfrage(n) relevant sind - z. B. Studie B6. A-Dysf^prmd/GeneJ-Mäuse (BLAJ-Mäuse), wenn versucht wird, die Frage zu beantworten, ob konzentrisch voreingenommenes DART bei Mäusen, die LGMD2B / R2 modellieren, weit verbreitete Muskelschäden induziert oder nicht.
2. Weisen Sie Mäuse basierend auf dem Studiendesign Studiengruppen zu - z. B. ordnen Sie Mäuse zufällig einer DART-Gruppe (Dart) oder einer isometrischen Trainingsgruppe (ISOM) zu und versuchen Sie, die Gruppen so gut wie möglich auszugleichen, basierend auf dem Abgleich nach Wurf und / oder Alter (z. B. Tabelle 1).

2. Herstellung des DART-Geräts

1. Entwerfen Sie die DART-Gerätekomponenten mit geeigneter CAD-Software (Computer Aided) (Abbildung 1), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Konstruktionsgehäuse für reibungsarme Radlager (siehe Materialtabelle, basierend auf der Konstruktion von Tretblocklagern) mit eingebautem Winkelmesser (zur Verwendung als Goniometer zur Messung von Knöchelgelenkwinkeln).
   2. Entwerfen Sie einen Turm für Radlagergehäuse und einen Winkelmesser.
   3. Entwerfen Sie eine Fußplatte zum Positionieren des Mausfußes. Entwerfen Sie eine Achse, um die Fußplatte mit dem Radlager zu verbinden.
2. Stellen Sie die DART-Gerätekomponenten mit einem geeigneten 3D-Drucker her (Abbildung 1).
   1. Speichern Sie die mit CAD-Software erstellten Entwürfe als Stereolithographie (. STL-Erweiterung) Dateien.
      HINWEIS: Die . STL-Dateien (Supplementary Coding Files 1-4) können verwendet und geändert werden, indem der korrespondierende Autor dieses Artikels genannt und diesen Artikel zitiert wird.
   2. Öffnen Sie die . STL-Dateien mit geeigneter Slicing-Software (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Slicing-Software wandelt ein virtuelles 3D-Modell in einen Stapel von Slices um, die nacheinander von einem 3D-Drucker gedruckt werden können, um ein 3D-Objekt zu generieren.
   3. Mit Slicing-Software generieren Sie G-CODE computergestützte Fertigung (CAM, . GCODE-Erweiterung), die spezifisch für den 3D-Drucker und das Filament sind, das verwendet wird.
   4. Folgen Sie dem 3D-Druckerhandbuch (siehe Materialtabelle), um DART-Gerätekomponenten mit zu drucken. GCODE-Dateien.
   5. Wählen Sie ein geeignetes 3D-Druckerfilament, z. B. Polymilchsäure (PLA) 1,75 mm 1 kg/Spule, Grau (siehe Materialtabelle).
3. Montieren Sie das DART-Gerät, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Setzen Sie ein reibungsarmes Radlager 608 (8 mm Bohrungsdurchmesser, 22 mm Außendurchmesser, z. B. eines mit Siliziumnitrid-Keramikkugeln aus Edelstahl 420, siehe Materialtabelle) in das Radlagergehäuse ein (Abbildung 1).
   2. Stecken Sie die Achse in die Bohrung des Radlagers (Abbildung 1).
   3. Kleben Sie die Fußplatte mit Klebstoff (siehe Materialtabelle) auf die Achse, der zum Verkleben von PLA geeignet ist (Abbildung 1).
   4. Platzieren Sie das Radlagergehäuse über dem Radlagergehäuseturm, und befestigen Sie die gesamte Baugruppe mit Schraubbefestigungen an einer Acrylbasis (Abbildung 1).
      HINWEIS: Es gibt keine spezifischen Größenanforderungen für die Acrylbasis - sie muss nur groß genug sein, um das Tier und das DART-Gerät aufzunehmen, und klein genug, um auf eine Arbeitsfläche zu passen. Der für die vorliegende Studie verwendete Acrylsockel ist etwa 30 cm breit, 45 cm lang und 0,5 cm dick.

3. Vorbereitung von Mäusen für DART oder ISOM

1. Setzen Sie jede Maus unter Vollnarkose mit inhaliertem Isofluran, das durch ein geeignetes Anästhesiesystem abgegeben wird (siehe Materialtabelle, 2%-5% für Induktion; 1%-4% für Erhaltung, um Stress und Schmerzen zu reduzieren).
   1. Induktion der Anästhesie in der Induktionskammer des Anästhesiesystems (2% -5% Isofluran).
   2. Übertragen Sie die Maus auf einen Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, während Eingriffe am Tier durchgeführt werden (1% -4% Isofluran). Bestätigen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie basierend auf dem fehlenden Rückzug der Hinterbeine zu einer Zehenklemme von einer Pinzette.
   3. Sorgen Sie für thermische Unterstützung - z. B. mit einem isothermen Gelheizkissen und einer Wärmelampe, die ~1 m über der Maus platziert ist. Überprüfen Sie mit einem Thermometer, ob die Temperatur auf und um die Acrylbasis bei ~ 38 ° C gehalten wird, damit die Maus nicht überhitzt.
2. Bereiten Sie die Haut über dem linken Musculus tibialis anterior (TA) der Maus und über die gesamten vorderen und lateralen Aspekte der linken Hinterbeine auf DART oder ISOM vor.
   1. Entfernen Sie das Fell der Maus mit einer Haarentfernungscreme (Enthaarungscreme, siehe Materialtabelle). Enthaarungscreme auftragen und ~2 min einwirken lassen.
   2. Reinigen Sie das Bein mit in destilliertem Wasser getränkten Tüchern, um das Fell und alle Restcreme von der Haut zu entfernen. Enthaarungscremes können die Haut reizen und/oder schädigen, wenn sie längere Zeit auf der Haut der Maus verbleiben und daher vollständig entfernt werden.
   3. Desinfizieren Sie die Haut nach der Fellentfernung mit einer zugelassenen Schrubbmethode, z. B. mit einer Povidon-Jod-Waschlösung und 70% Ethanol.
3. Tragen Sie ein Schutzmittel (z. B. Vaseline) mit einem sauberen Wattestäbchen auf die Augen und die enthaarte Haut auf, um die Augen und die enthaarte Haut vor dem Austrocknen zu schützen.
4. Setzen Sie einen stabilisierenden Stift durch die Tibiametaphyse.
   1. Tragen Sie 5% Lidocain-Creme auf die Tibia auf, um den Bereich zu betäuben.
   2. Führen Sie eine 26 G, halbe Zoll, sterile, hypodermische Nadel durch den breitesten Teil des proximalen Teils des Tibiaknochens (dh die Tibiametaphyse, auch bekannt als Tibiakopf). Sobald der Stabilisierungsstift gesichert ist, entfernen Sie den Kunststoffteil der Injektionsnadel, indem Sie die Nadel mit einem sterilen Hämostat halten und den Kunststoffteil biegen, bis er abbricht.
5. Positionieren Sie die Maus für DART- oder ISOM-Schulungen.
   1. Legen Sie die Maus in Rückenlage. Stellen Sie sicher, dass die Maus noch sicher mit dem Nasenkonus verbunden ist, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
   2. Führen Sie den Tibiastift mit einer sterilen Pinzette in einen Metall-Krokodilklemmen (siehe Materialtabelle), so dass die Enden des Tibiastifts von der Krokodilklemme gehalten werden. Bewegen Sie den verstellbaren Arm der Krokodilklemme, um sicherzustellen, dass der Fuß der Maus auf der Fußplatte des DART-Geräts platziert ist.
   3. Befestigen Sie den Fuß der Maus mit Laborklebeband auf der Fußplatte des DART-Geräts.
   4. Platzieren Sie den Fuß der Maus in einem 90°-Winkel in Bezug auf die Längsachse des Tibiaknochens der Maus. Bei richtiger Platzierung steht die Fußplatte senkrecht zur Acrylbasis (d. H. Der Boden oder die horizontale Ebene).
   5. Legen Sie die Fußplatte auf den Plantarflexionsstopp, der durch Platzieren einer 18 G, 1,5 Zoll langen Injektionsnadel durch die vorgebohrten Löcher am Winkelmesser des DART-Geräts erzeugt wird (Abbildung 1).

4. DART- oder ISOM-Schulung

1. Optimieren Sie die Elektrodenplatzierung, indem Sie eine bipolare, transkutane, neuromuskuläre elektrische Stimulationselektrode (NMES, siehe Materialtabelle) auf dem inferolateralen Aspekt des Kniegelenks der Maus platzieren (Abbildung 1B).
   1. Mit einzelnen Impulsen (1 Hz) aus einem elektrischen Laborstimulator (siehe Materialtabelle) wird der Fibulast des Ischiasnervs stimuliert, der die dorsiflexormuskulatur des Knöchels motorisch innerviert (Abbildung 1B).
   2. Da der Musculus tibialis anterior (TA) über 90% der gesamten kontraktilen Kraft ausmacht, die von den Knöchelmuskeln³¹ erzeugt wird, beobachten Sie den TA-Muskelbauch und die Sehne auf Hinweise auf elektrisch ausgelöste Zuckenkontraktionen.
      HINWEIS: Eine leichte knöcherne Prominenz, die dem Wadenbein entspricht, kann bei der Elektrodenplatzierung helfen, wenn der Tester sie durch die Elektrode spüren kann. Dies erfordert etwas Übung und Lernen seitens des Testers, um ein Gefühl für die optimale Elektrodenplatzierung zu bekommen.
   3. Bewegen Sie den Plantarflexionsanschlag zu dem Loch am Winkelmesser, das 20° Plantarflexion entspricht, von der Position, in der der Fuß orthogonal (90°) zur Tibia ist - dies ist die Position, an der das maximale kontraktile Drehmoment des TA-Muskels typischerweise auf der Grundlage früherer Berichte^{beobachtet wird 21}. Dies muss möglicherweise vom Benutzer basierend auf Faktoren angepasst werden, die für die untersuchten Mäuse spezifisch sind.
   4. Visualisieren Sie das Zuckenmoment mit einem Mausdynamometer, indem Sie die Fußplatte des DART-Geräts mit der Fußplatte des Leistungsprüfstands verbinden, z. B. die Fußplatte des DART-Geräts mit einer speziell angefertigten Roboterfußplatte des Knöcheldynamometers mit einer nicht elastischen Seidennaht (ähnlich Abbildung 1A) und die Naht an die Fußplatte des Leistungsprüfstands befestigen (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Fußplatte hat Löcher, die in das 3D-Druckdesign integriert sind. Das Platzieren der Naht durch das Lochpaar, das sich in der zweiten Reihe vom Zehenende der Fußplatte befindet, bringt die Naht auf ~ 20 mm von der Achse der Dorsalflexion/Plantarflexion entfernt (Abbildung 1A, B). Der Leistungsprüfstand wurde in früheren Berichten 19,20,21,22 beschrieben.
2. Optimieren Sie den Spannungsausgang des NMES-Stimulators.
   1. Nach der Optimierung der Elektrodenplatzierung optimieren Sie die Amplitude der vom elektrischen Stimulator ausgehenden Spannung - dies ist notwendig, um NMES auf den gemeinsamen Fibularnerv und den TA-Muskel zu beschränken und das Risiko von Co-Kontraktionen in den Plantarflexoren zu reduzieren.
      HINWEIS: Wenn Co-Kontraktionen ausgelöst werden, können sie durch die Drehmomentabgabe des Dynamometers visualisiert werden und auch in der Plantarflexion der Zehen gesehen werden.
3. Stellen Sie den NMES-Stimulator für DART- oder ISOM-Training ein.
   HINWEIS: Die folgenden Einstellungen müssen möglicherweise vom Benutzer basierend auf den für die untersuchten Mäuse spezifischen Faktoren und dem Zweck der Studien angepasst werden.
   1. Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er wiederholte Pulsfolgen mit einer Frequenz von 125 Hz erzeugt - diese Frequenz erzeugt maximale fusionierte tetanische Kontraktionen ohne Überlauf von NMES in andere Muskelgruppen bei BLAJ-Mäusen²¹. Stellen Sie dazu die Regler für Pulsfrequenz (125 Hz), Zugdauer (500 ms) und Züge pro Sekunde (1 Zug/s) ein und schalten Sie den Kippschalter für sich wiederholende Impulszüge ein.
   2. Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er Pulsfolgen mit einer Dauer von 500 ms erzeugt, die mit einer Ruhezeit von 500 ms zwischen den Pulsfolgen durchsetzt sind.
   3. Bewegen Sie den Plantarflexionsanschlag zu dem Loch am Winkelmesser, das 160° zur Längsachse der Tibia entspricht (70° Plantarflexion vom Fuß orthogonal zur Tibia). Dies ist die Position, in die der Fuß der BLAJ-Maus passiv ohne Weichteilwiderstand bewegt werden kann²¹.
   4. Für DART wenden Sie einen geeigneten Widerstand an, gegen den der TA-Muskel konzentrisch arbeiten muss - z. B. 5 g wie in Abbildung 1A, B gezeigt; siehe die Kalibrierkurve zwischen Gewicht und Drehmoment in der Zusatzdatei 1.
   5. Üben Sie Widerstand aus, indem Sie das Gewicht mit einer nicht elastischen Seidennaht aufhängen, die an der Fußplatte des DART-Geräts befestigt ist (Abbildung 1A, B).
   6. Passen Sie den Widerstand an - d. H. Wenden Sie ~ 50% des Ein-Wiederholungsmaximums (1RM) an (z. B. 5 g, wenn die Maus ein maximales Gewicht von 10 g mit einer einzigen Kontraktion heben kann), wodurch der Fuß durch mindestens die Hälfte des verfügbaren aktiven Dorsalflexionsbereichs gezogen wird.
   7. Führen Sie ein geeignetes DART-Training an Mäusen durch, die der DART-Gruppe zugeordnet sind - z. B. führen Sie ein einzelnes DART-Training durch, das vier Sätze von 10 Wiederholungen konzentrischer Kontraktionen mit 2 Minuten Pause zwischen den Sätzen umfasst, ähnlich wie progressive Widerstandstrainingsprogramme, die beim Menschen verwendet werden³² (siehe ergänzendes Video 1).
   8. Führen Sie ein geeignetes ISOM-Training an Mäusen durch, die der ISOM-Gruppe zugeordnet sind - z. B. führen Sie ein einzelnes ISOM-Training durch, das vier Sätze von 10 Wiederholungen isometrischer Kontraktionen mit 2 Minuten Pause zwischen den Sätzen umfasst, ähnlich wie DART (siehe Ergänzendes Video 2).
   9. Für das ISOM-Training platzieren Sie den Fuß der Maus um 160° zur Längsachse der Tibia (70° Plantarflexion vom Fuß orthogonal zur Tibia) und halten Sie diese statische Position bei, indem Sie die Seidennaht auf die Fußplatte des Roboterdynamometers kleben.
      HINWEIS: Da die Naht nicht gleiten kann, kann sich die Fußplatte des DART-Geräts nicht in die Dorsalflexion bewegen, wodurch die Dorsiflexoren gezwungen werden, sich isometrisch zusammenzuziehen.

5. Nachsorge für Mäuse

1. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die richtige Hygiene der trainierten Hinterbeine aufrechtzuerhalten und Nadelstellenschmerzen zu reduzieren.
   1. Beschichten Sie nach dem DART- oder ISOM-Training den sichtbaren Teil des Tibiastifts mit einer dreifachen antibiotischen Salbe (400 U / g Bacitracin, 3,5 mg / g Neomycin und 5000 U / g Polymixin-B, siehe Materialtabelle) und ziehen Sie den Stift dann vorsichtig von der medialen Seite der Tibia zurück. Spülen Sie die Haut über den seitlichen Oberschenkel und Oberschenkel mit Povidon-Jod und sterilem Wasser aus. Tragen Sie 5% Lidocain-Creme auf die Tibia auf, um Nadelschmerzen zu kontrollieren.
2. Lassen Sie die Mäuse von der Anästhesie erholen.
   1. Entfernen Sie die Maus vom Nasenzapfen und lassen Sie sie sich in einem Auffangkäfig, der frei von Einstreu ist, von der Narkose erholen. Unterstützen Sie die Maus thermisch, während sie sich von der Narkose erholt, z. B. mit einem isothermen Gel-Heizkissen.
3. Bringen Sie die Maus in ihren ursprünglichen Käfig zurück, nachdem sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Dann bringen Sie den Käfig in die Tiereinrichtung zurück, wo Studienmäuse untergebracht werden, bis Folgeexperimente durchgeführt werden. Überwachen Sie die Mäuse täglich.

6. Gewebeentnahme

1. Ernten Sie den TA-Muskel der Maus in seiner Gesamtheit und frieren Sie ihn zur Kryokonservierung ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Basierend auf den Forschungsfragen, zu einem geeigneten Zeitpunkt nach dem Training (z. B. 3 Tage nach DART oder ISOM), euthanasieren Sie die Mäuse nach genehmigten Protokollen.
      HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Mäuse durch zervikale Dislokation unter Vollnarkose eingeschläfert (inhaliertes Isofluran, 2%-5% zur Wirkung). Die bilaterale Thorakotomie sorgte für den Tod.
   2. Sezieren Sie die Hinterbeine der Maus, um den trainierten TA-Muskel (links) und den nicht trainierten TA-Muskel (rechts) zu entfernen. Wiegen Sie die geernteten Muskeln. Tauchen Sie dann jeden Muskel zur Kryoprotektion in Mineralöl und legen Sie den Muskel auf ein sauberes Labortuch, um das überschüssige Öl²¹ abzutupfen.
2. Legen Sie den Muskel auf ein Stück Aluminiumfolie. Halten Sie den Rand der Folie mit einem langen Hämostat und tauchen Sie die Folie und den Muskel schnell in flüssigen Stickstoff ein, der in einem geeigneten Plastikbehälter enthalten ist, um den Muskel einzufrieren.
   1. Nach etwa 2 Minuten Eintauchen in flüssigen Stickstoff übertragen Sie den gefrorenen Muskel in markierte kryogene Fläschchen. Lagern Sie die Durchstechflaschen in einem Gefrierschrank von −80 °C, bis sie für weitere Studien benötigt werden.

7. Histologische Untersuchungen am Muskelgewebe

1. Bereiten Sie Kryostatabschnitte des TA-Muskels vor, die 5 μm dick sind. Kryostatschnitte auf geladenen Objektträgern sammeln. Fixieren Sie die Abschnitte mit Aceton, das bei −30 °C kalt gehalten wird, und lassen Sie die Abschnitte an der Luft trocknen.
2. Färben Sie die Muskelgewebeschnitte mit Hämatoxylin, gefolgt von Eosin (H&E-Färbung, siehe Materialtabelle).
   1. Tauchen Sie die Abschnitte für 5 min in Hämatoxylin (dunkelblauer Kernfleck) in ein Glasfärbeglas. Entfernen Sie überschüssiges Hämatoxylin, indem Sie die Abschnitte mit Leitungswasser abspülen, bis kein weiteres Blaulicht des Wassers zu sehen ist.
   2. Tauchen Sie die Abschnitte für 5 Minuten in bläuliches Reagenz in einem Glasgefäß. Überschüssiges bläuliches Reagenz mit einer Glassaugpipette aus den Abschnitten absaugen.
   3. Tauchen Sie die Abschnitte für 5 min in Eosin (rosa zytoplasmatische Färbung) in ein Glasfärbungsgefäß. Entfernen Sie überschüssiges Eosin, indem Sie die Abschnitte schnell und wiederholt (~ 10 mal) in 95% Ethanol in einem Glasfärbungsglas tauchen.
   4. Lassen Sie die Abschnitte an der Luft trocknen und fahren Sie mit der Visualisierung unter einem Lichtmikroskop fort.
3. Bereiten Sie hochauflösende Kachelbilder ganzer TA-Muskelquerschnitte durch mikroskopische Bildgebung vor.
   HINWEIS: Der Benutzer muss möglicherweise die folgenden Bildgebungs- und Bildanalyseschritte basierend auf seiner Mikroskop- und Bilderfassungs- und Analysesoftware anpassen.
   1. Nehmen Sie digitale Bilder mit dem 10-fachen Objektiv eines Lichtmikroskops und einer am Mikroskop montierten Digitalkamera auf.
   2. Nehmen Sie etwa 15-20 Bilder auf und bewegen Sie sich entlang des Querschnitts jedes Muskels in einer gitterartigen Weise, so dass jedes neue Bild ~ 25% mit dem vorherigen Bild überlappt.
      HINWEIS: Dieser Prozess hilft bei der Erfassung einer Reihe von Bildern, die digital gekachelt werden können (auch als Bild-Stitching bezeichnet), um ein hochauflösendes zusammengesetztes Bild des gesamten TA-Muskelquerschnitts zu erstellen (Abbildung 2).
   3. Speichern Sie digitale Bilder in . TIFF-Format.
   4. Öffnen Sie digitale Bilder mit geeigneter Bildverarbeitungs- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
   5. Kacheln oder nähen Sie einzelne Bilder zu einem zusammengesetzten Bild des gesamten TA-Muskels durch die folgenden Schritte: Wenn alle einzelnen überlappenden Bilder jedes TA-Muskels in der Software geöffnet sind, klicken Sie auf Datei > Wählen Sie Automatisieren > wählen Sie Photomerge > Collage auswählen > Wählen Sie Geöffnete Dateien hinzufügen > Klicken Sie auf OK.
   6. Wenn ein neues gekacheltes/genähtes Bild des TA-Muskels vorbereitet und angezeigt wird, speichern Sie das Bild in . TIFF-Format für weitere Analysen.
4. Quantifizieren Sie Muskelschäden durch visuelle Analyse in den gekachelten Bildern des gesamten TA-Muskels mit geeigneter Bildanalysesoftware.
   1. Wählen Sie in der Bildanalysesoftware im Menü Analysieren die Funktion Messen, um den Bereich des gesamten TA-Muskelquerschnitts zu skizzieren und zu messen (Abbildung 2).
   2. Wählen Sie in der Bildanalysesoftware die Funktion Messen im Menü Analysieren , um die Bereiche jedes TA-Muskels zu skizzieren und zu messen, die beschädigt sind - d. H. Bereiche, die zytoplasmatische Störungen von Muskelfasern, fehlende Muskelfasern und entzündliche Zellinfiltration zeigen²² (Abbildung 2).
   3. Drücken Sie die Summe der gesamten Schadensfläche als Prozentsatz der gesamten TA-Muskelquerschnittsfläche aus (Abbildung 2, Tabelle 2).

8. Statistische Analysen

1. Organisieren Sie die Daten wie in den Tabellen 1-3 dargestellt, und führen Sie nicht gepaarte T-Tests (wenn Tests der Normalität und homogener Varianzen bestanden werden)³³ oder Mann-Whitney-Rangsummentests (wenn Tests der Normalität und homogener Varianzen nicht bestanden werden)²¹ mit geeigneter Software durch (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

BLAJ männliche Mäuse, die ~ 1,5 Jahre alt waren, wurden untersucht. BLAJ-Mäuse modellieren die menschliche Muskelerkrankung LGMD2B/R2. Diese Mäuse sind besonders anfällig für verzögert einsetzende Muskelschäden durch einen einzigen Anfall exzentrischer Muskelkontraktionen^22,29. BLAJ-Mäuse wurden daher für diese Studien ausgewählt, um zu erfahren, ob DART auf nicht-schädliche Weise durchgeführt werden kann, indem der Widerstand, gegen den der TA-Muske...

Diskussion

Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anweisungen zum Konstruieren eines Geräts zur Durchführung einer Art von Präzisionsrehabilitationstraining, das als dosisangepasstes Widerstandstraining (DART) bezeichnet wird. Die Arbeit beschreibt auch die Anwendung des DART-Geräts und der Methodik in einer Trainingsstudie, um Muskelschäden 3 Tage nach einem einzigen DART-Anfall (DART-Gruppe) mit Schäden 3 Tage nach einem vergleichbaren isometrischen Training (ISOM-Gruppe) zu vergleichen.

Di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing	Anmiao Star (N/A)	AMS127	High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope	Carl Zeiss (Peabody, MA)	Product #Axio Scope.A1	Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice)	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin.	Stock #012767	Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	BS4 50–6824	Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog No. S17495	Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software	Ultimaker, Utrecht, Netherlands	Ultimaker Cura 4.4.1.	Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad	Braintree Scientific (Braintree, MA)	Item #39DP	Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y	Millipore Sigma (Burlington, MA)	HT110132-1L	Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue	The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)	Gorilla Super Glue Micro Precise	Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3	Millipore Sigma (Burlington, MA)	GHS332-1L	Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog #HM525NX	Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120	Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014	National Instruments, Austin, Texas, USA	Labview 2014	Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks	ThermoFisher (Waltham, MA)	S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD	Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream	Softsheen Carson (New York, NY)	N/A	Razorless hair removal cream
Metal alligator clip	JINSHANGTOPK (web-based business)	24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps	Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides	Globe Scientific (Mahwah, NJ)	1354W. Diamond White Glass Slides	Charged microscope slides
Mineral Oil	ThermoFisher (Waltham, MA)	BP26291	Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA	Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)	#11778	Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer	Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)	Mini V2 3D	3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software	National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)	NIH Image for Windows	Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4	Adobe (San Jose, CA)	Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows	Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit	Grass Instruments (West Warwick, RI)	PSIU6 isolation unit	Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material	Roboz Surgical (Gaithersburg, MD)	Roboz Surgical SUT152	Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator	Grass Instruments (West Warwick, RI)	S48 Stimulator	Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent	Ricca Chemical Company (Arlington, TX)	6697-32	Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5	Systat Software (San Jose, CA)	SigmaStat version 3.5	Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer	VetEquip (Livermore, CA)	Item #901801	Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment	Global Health Products (wed-based business)	Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment	Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care