Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Resumen

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Resumen

La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.

Introducción

El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias¹. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales ^2,3,4. En los cerebros de mamífe....

Protocolo

Los huevos y los embriones de pollo se manejaron con cuidado y respeto de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jinan.

1. Preparación de huevos y plásmidos

1. Preparación del huevo
   1. Obtenga huevos de gallina fertilizados frescos (Gallus gallus) de la Universidad Agrícola del Sur de China y guárdelos a 16 ° C antes de la incubación. Para una viabilidad óptima, coloque todos los huevos para la incubación dentro de una semana de su llegada.
   2. Colocar los huevos horizontalmente e incubar a 38 °C durante 46-48 h hasta la etapa ....

Resultados

Al realizar electroporación in ovo en diferentes sitios y en diferentes etapas de desarrollo, logramos un knockdown selectivo de FMRP en la periferia auditiva o en el tronco cerebral auditivo.

Derribo de FMRP en NM
El ARN horquilla pequeño (shRNA) contra el pollo Fmr1 fue diseñado y clonado en el sistema vectorial Tet-On como se describió anteriormente²⁰. La configuración para la electroporación in ovo se muestra en l.......

Discusión

Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package