Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Resumen

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Resumen

La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.

Introducción

El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias¹. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales ^2,3,4. En los cerebros de mamíferos, la FMRP probablemente está asociada con cientos de ARNm que codifican proteínas que son importantes para diversas actividades neuronales⁵. Estudios de animales knockout convencionales Fmr1 demostraron que la expresión de FMRP es particularmente importante para el ensamblaje y la plasticidad de la neurotransmisión sináptica⁶. Varios modelos de knockout condicional y mosaico han demostrado además que las acciones y señales de FMRP varían según las regiones cerebrales, los tipos de células y los sitios sinápticos durante varios eventos de desarrollo, incluida la proyección axonal, el patrón dendrítico y la plasticidad sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La función aguda de FMRP en la regulación de la transmisión sináptica fue estudiada por la administración intracelular de anticuerpos inhibidores de FMRP o FMRP en cortes cerebrales o neuronas cultivadas^15,16,17,18. Estos métodos, sin embargo, no ofrecen la capacidad de rastrear las consecuencias inducidas por la expresión errónea de FMRP durante el desarrollo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP está en gran necesidad, y se espera que ayude a determinar si las anomalías reportadas en pacientes con FXS son consecuencias directas de la pérdida de FMRP en las neuronas y circuitos asociados, o consecuencias secundarias derivadas de cambios en toda la red durante el desarrollo¹⁹.

El tronco cerebral auditivo de embriones de pollo ofrece un modelo excepcionalmente ventajoso para análisis funcionales en profundidad de la regulación FMRP en el desarrollo de circuitos y sinapsis. El fácil acceso a los cerebros embrionarios de pollo y la bien establecida técnica de electroporación in ovo para la manipulación genética han contribuido en gran medida a nuestra comprensión del desarrollo cerebral en las primeras etapas embrionarias. En un estudio recientemente publicado, esta técnica se combinó con herramientas moleculares avanzadas que permiten el control temporal de la expresión errónea de FMRP^20,21. Aquí, la metodología es avanzada para inducir manipulaciones selectivas de neuronas presinápticas y postsinápticas por separado. Este método fue desarrollado en el circuito auditivo del tronco encefálico. La señal acústica es detectada por las células ciliadas en el oído interno auditivo y luego transportada al ganglio auditivo (AG; también llamado ganglio espiral en mamíferos). Las neuronas bipolares en el AG inervan las células ciliadas con sus procesos periféricos y, a su vez, envían una proyección central (el nervio auditivo) al tronco encefálico donde terminan en dos núcleos cocleares primarios, el núcleo magnocellularis (NM) y el núcleo angularis (NA). Las neuronas en el NM son estructural y funcionalmente comparables a las células esféricas tupidas del núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro del NM, las fibras nerviosas auditivas (ANF) hacen sinapsis en el somata de las neuronas NM a través del bulbo terminal grande de los terminales de Held²². Durante el desarrollo, las neuronas NM surgen de los rombómeros 5 y 6 (r5/6) en el cerebro posterior²³, mientras que las neuronas AG se derivan de neuroblastos que residen en el otocisto²⁴. Aquí, describimos el procedimiento para derribar selectivamente la expresión de FMRP en las neuronas AG presinápticas y en las neuronas NM postsinápticas por separado.

Protocolo

Los huevos y los embriones de pollo se manejaron con cuidado y respeto de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jinan.

1. Preparación de huevos y plásmidos

1. Preparación del huevo
   1. Obtenga huevos de gallina fertilizados frescos (Gallus gallus) de la Universidad Agrícola del Sur de China y guárdelos a 16 ° C antes de la incubación. Para una viabilidad óptima, coloque todos los huevos para la incubación dentro de una semana de su llegada.
   2. Colocar los huevos horizontalmente e incubar a 38 °C durante 46-48 h hasta la etapa 12^{a 25} de Hamburger y Hamilton (HH) para la transfección del tubo neural, o durante 54-56 h hasta HH13 para la transfección de otocistos. Debido a que el polo animal del huevo es más ligero que el polo vegetal, la colocación horizontal coloca el embrión en la parte superior del huevo para facilitar la manipulación. Tenga cuidado de mantener el huevo horizontal en este y todos los pasos siguientes.
   3. La ubicación del embrión aparece como un área oscura en la cáscara del huevo cuando se proyecta luz desde el fondo del huevo con una linterna. En las etapas deseadas de HH, use este método de linterna para marcar la ubicación del embrión en la cáscara del huevo con lápiz.
   4. Limpie los huevos con una gasa que contenga 75% de etanol. Perfore un agujero en el extremo puntiagudo de los huevos con la punta de las tijeras y retire 2 ml de albúmina con una jeringa de aguja de 18 G. Asegúrese de que el orificio solo sea lo suficientemente grande como para permitir la inserción de la aguja. Limpie cualquier albúmina que gotee con una gasa y selle el orificio con cinta adhesiva transparente.
   5. Para minimizar las grietas y evitar la caída de restos de cáscara durante las ventanas, cubra la parte superior de los huevos con cinta adhesiva transparente, centrándose en el área oscura marcada con lápiz.
2. Extracción de ADN plásmido
   1. Clone pollo Fmr1 shRNA usando un sistema Tet-on basado en transposones como se describió anteriormente²⁰. Este sistema contiene tres plásmidos: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 y pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, proporcionando un sistema vectorial inducible por fármaco por el cual la expresión de Fmr1 shRNA y EGFP se silencia después de la transfección y puede activarse mediante la inducción de doxiciclina (Dox).
      NOTA: Estos plásmidos no están disponibles actualmente en un repositorio. Los autores se comprometen a proporcionar los plásmidos a petición razonable.
   2. Extraiga ADN plásmido utilizando un kit de preparación libre de endotoxinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precipite agregando 1/15 volumen de acetato de sodio 7.5 M y 1 volumen de isopropanol al 100%.
   3. Precipitar plásmidos a -20 °C durante la noche y centrifugar a 13.000 x g durante 10 min. Disuelva el pellet con el tampón Tris-EDTA proporcionado en el kit hasta una concentración final de 4-5 μg/μL. Los plásmidos pueden almacenarse a -20 °C durante 12 meses sin reducir la eficiencia de la transfección.
   4. El día de la electroporación, mezclar bien 2 μL de cada plásmido en un tubo de centrífuga estéril con una punta de pipeta. El volumen resultante de 6 μL de la mezcla de plásmidos es suficiente para electropolar tres docenas de huevos. Para ayudar a visualizar el plásmido durante la electroporación, agregue 1 μL de verde rápido al 0,1% (preparado en ddH₂O estéril) por cada 6 μL de mezcla de ADN²⁶, lo que convierte la mezcla de plásmidos en azul.

2. Electroporación in ovo

1. Ventana de óvulos e identificación de embriones
   1. El día de la electroporación, retire los huevos de la incubadora, una docena de huevos a la vez. Mantener los huevos fuera de su incubadora durante más de 1 h introduce variaciones en el desarrollo y reduce la viabilidad.
   2. Limpie todas las herramientas de cirugía con una gasa que contenga 75% de etanol.
   3. Coloque cada huevo en un soporte de espuma hecho a medida. Limpie el área cubierta con cinta adhesiva con etanol al 75% y corte una ventana (1-2 cm²) alrededor de la circunferencia de la marca del lápiz con un pequeño par de tijeras (Figura 1A). Al cortar, sostenga las tijeras planas para evitar dañar el embrión debajo.
   4. Coloque el huevo con ventana bajo un microscopio estereoscópico con un ocular de 10x y un zoom de 2x e identifique el embrión. Ajuste el ángulo y el brillo de la fuente de luz para una mejor visualización.
      NOTA: Se necesita práctica y experiencia para visualizar el embrión e identificar el tubo neural en esta etapa.
      1. Para principiantes, use la siguiente inyección de tinta opcional para facilitar la identificación del embrión. Prepare una solución de tinta india al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 0,01 M y autoclave con antelación. Llene una jeringa de 1 ml con la solución de tinta y luego coloque una aguja de 27G. Doble la aguja en un ángulo de 45° con fórceps.
      2. Bajo el microscopio, asomar cuidadosamente desde el borde del área opaca e insertar la aguja debajo del embrión. Inyecte ~ 50 μL de tinta, que se difundirá debajo del área pelúcida para la visualización del embrión. La tinta formará un fondo oscuro para una visualización clara del embrión.
         NOTA: Expulse el aire de la jeringa antes de la inserción y la inyección. Cuando sea experto en visualización, evite el paso de inyección de tinta, ya que reduce la tasa de supervivencia.
2. Inyección del tubo neural y electroporación
   NOTA: Este procedimiento se realiza en HH12 para transfectar neuronas NM en el tronco encefálico.
   1. Tire de los capilares de vidrio (~1 mm de diámetro y 100 mm de largo) en pipetas con un extractor de pipetas. Bajo un microscopio de disección, abra cuidadosamente la punta de la aguja capilar a 10-20 μm de diámetro con fórceps. Guarde las pipetas (generalmente 5-10 a la vez) en una caja de almacenamiento hasta que las use.
   2. Llenar una pipeta capilar con 0,5-1 μL de la mezcla plásmida aplicando presión negativa a través de un tubo de goma en el extremo de la pipeta. Esto se puede lograr con una jeringa o bomba de aire.
   3. Coloque el óvulo bajo el microscopio para que el embrión esté orientado verticalmente con la cola cerca de usted (u horizontalmente para inyectar pipetas capilares usando un manipulador de tres ejes). Sujete la pipeta capilar con una mano o con el manipulador de tres ejes y conduzca la punta de la pipeta hacia el r5/6 en dirección de cola a cabeza.
      NOTA: El área más anterior del cerebro posterior es r1 y cada protuberancia posterior a lo largo del tubo neural es un rombómero individual. R5/6 está en el mismo nivel anteroposterior que el otocisto, que es una estructura similar a una copa fácilmente reconocible (Figura 1B-C).
   4. Empuje suavemente la punta a través de la membrana vitelina y en el tubo neural dorsal y luego retire la pipeta un poco para que la punta esté en el lumen del tubo neural. Inyecte la mezcla de plásmidos aplicando presión de aire hasta que el plásmido teñido se difunda completamente en r5/6 y se extienda a r3 y r4.
      NOTA: No es necesario hacer una ranura en la membrana vitelina para inyección.
   5. Verifique si la inyección es exitosa, lo que se logra cuando la solución de plásmido azul se difunde rápidamente por el tubo neural sin fugas (Figura 1B-C). Cuando se produce una fuga, el azul se desvanece rápidamente.
   6. Inmediatamente después de la inyección, coloque un electrodo bipolar de platino a cada lado del tubo neural (Figura 1D). Entregar dos pulsos de 12 V y 50 ms de duración con un electroporador. Observe burbujas de aire en los extremos del electrodo bipolar, con más en el lado negativo.
   7. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos teñidos ingresa al tejido del tubo neural cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar.
   8. Cubra la ventana con la cáscara del huevo con un trozo de película transparente que se corta previamente en 2 cuadrados y se rocía con etanol al 75%. Vuelva a colocar el huevo en su incubadora.
   9. Limpie el electrodo bipolar administrando 10-20 pulsos de 12 V y 50 ms de duración en solución salina antes de proceder al siguiente huevo.
3. Inyección de otocisto y electroporación
   NOTA: Este procedimiento se realiza en HH13 para transfectar células ciliadas y neuronas AG en el oído interno.
   1. En HH13 (que es ~ día embrionario 2.5), el embrión ha girado para que el lado derecho de la cabeza mire hacia arriba. Bajo el microscopio, coloque el óvulo de manera que el embrión quede vertical, con la cola cerca de usted. Sostenga la pipeta capilar y empuje suavemente el otocisto derecho en dirección dorsolateral (Figura 2A).
      NOTA: En esta etapa, el otocisto aparece como una pequeña estructura circular en la parte superior del cuerpo al mismo nivel anteroposterior que r5/6.
   2. Inyecte la mezcla de plásmidos con presión de aire hasta que el otocisto se llene con solución azul²⁷. Verifique si hay una inyección exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmido azul está confinada dentro del otocisto y no tiene fugas.
   3. Inmediatamente después de la inyección, coloque el electrodo bipolar en el otocisto como se muestra en la Figura 2B. Coloque los lados positivo y negativo anterior y posterior al otocisto, respectivamente. Entregar dos pulsos de 12 V y 50 ms de duración con el electroporador.
   4. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos azules ingresa al tejido del otocisto cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar. Cubra la ventana de la cáscara del huevo con una película transparente y devuelva el huevo a la incubadora.

3. Administración de Dox para iniciar y mantener la transcripción de plásmidos

1. Preparación de la solución Dox
   1. Mida 100 mg de polvo de Dox bajo una campana química y disuélvalo en 100 ml de PBS estéril para hacer 1 mg / ml de solución de trabajo. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm y conservar 1 ml de alícuotas a -20 °C. Proteger de la luz^20,28.
2. Administración de Dox
   1. Para la edición de genes de fuerza completa, a las 24 h antes de la edad deseada, descongele una alícuota de Dox en hielo. Dejar caer 50 μL de Dox directamente sobre la membrana corioalantoidea del huevo con una jeringa que penetre en la película transparente. Selle el orificio de la aguja con una película transparente o cinta adhesiva después de la inyección.
   2. Para mantener el efecto de derribo, administre Dox cada dos días hasta la recolección de tejido en la etapa de desarrollo deseada.

4. Disección y seccionamiento de tejidos

1. Tronco encefálico
   1. Para embriones en etapa embrionaria 3 (E3) y E6, abra la cáscara del huevo y corte la membrana asociada con tijeras. Sacar el embrión con una cuchara y sumergirlo en paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón fosfato 0,1 M.
   2. Para los embriones E9, abra la cáscara del huevo, decapite el embrión con tijeras y transfiera la cabeza a una placa con fondo de silicio llena de PBS. Fije la cabeza hacia abajo a través de las órbitas y corte la parte superior del cráneo. Coloque cuidadosamente los fórceps debajo del cerebro desde ambos lados y eleve todo el cerebro desde el cráneo con los hombros de los fórceps. Sumergir el cerebro en un 4% de PFA.
   3. Para los embriones E15 y E19, abra la cáscara del huevo, decapite el embrión con tijeras y coloque la cabeza en una placa con fondo de silicio llena de PBS. Corte la piel en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
   4. Incide a través del cráneo verticalmente con una navaja de afeitar para separar el cerebro anterior y el cerebro caudal. Sumerja el bloque caudal en PBS, retire la parte superior del cráneo y luego retire el cerebro del cráneo.
   5. Fije el cerebro a través del lóbulo óptico y separe el cerebelo y el tronco encefálico. Tenga cuidado de no dañar el tronco cerebral auditivo, que se encuentra justo debajo del cerebelo. Retire la mayor cantidad de duramadre posible del tronco encefálico y luego sumérjala en PFA al 4%.
   6. Mantener los embriones y los tejidos cerebrales en PFA al 4% a 4 °C durante la noche, excepto los troncos cerebrales E19, que deben mantenerse en la misma condición durante 24 h.
   7. Después de la fijación, deshidrate el tejido en PBS que contiene 30% de sacarosa hasta que se asiente, lo que generalmente toma de 1 a 3 días, dependiendo de la edad.
   8. Seccionar el tronco encefálico (E15 y E19) a 30 μm en el plano coronal utilizando un micrótomo deslizante. Recoger las secciones en PBS y almacenar a 4 °C antes de la inmunotinción.
   9. Para embriones E3 y E6 y troncos cerebrales E9, sección transversal a 50 μm. Recoger las secciones en PBS y almacenar a 4 °C. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina antes de la inmunotinción. La recolección de secciones más gruesas para estas edades facilita el manejo de los tejidos.
2. Conducto auditivo
   1. Después de extraer los troncos cerebrales de los embriones E9, E15 y E19, el conducto auditivo, que está incrustado en el hueso temporal, es fácilmente identificable debajo del cráneo, y el hueso temporal es fácilmente separable del cráneo circundante. Para embriones E9, fijar todo el hueso temporal en 4% PFA. Para embriones más viejos, retire la estructura ósea del hueso temporal para aislar el conducto auditivo y fije el conducto auditivo en 4% PFA.
   2. Mantenga todos los huesos temporales y conductos auditivos en PFA al 4% a 4 °C durante la noche antes de la incrustación del tejido.
   3. Realice la incrustación de tejido como se describe. Prepare la solución de incrustación de la siguiente manera: Remoje la gelatina al 10% (de la piel bovina) en agua fría hasta que los gránulos de gelatina se hinchen y se asienten (aproximadamente 30 min). Caliente la mezcla a ~ 50 ° C para disolver la gelatina y agregue sacarosa al 20% en la solución de gelatina y revuelva para disolver. Conservar la solución de gelatina y sacarosa a 4 °C durante un máximo de un mes.
   4. Para su uso, calentar la solución de gelatina y sacarosa a 37 °C. Remojar los huesos temporales/conductos auditivos en la solución tibia de gelatina y sacarosa en una placa de 96 pocillos a 37 °C hasta que se asienten, generalmente 30-60 min.
   5. Forre el fondo de los pocillos de una placa de 12 pocillos con una tira de película transparente. Agregue una capa de solución tibia de gelatina y sacarosa y espere hasta que se solidifique. Transfiera un hueso temporal/conducto auditivo a cada pocillo.
   6. Implante el tejido con una segunda capa de solución tibia de gelatina y sacarosa. Ajuste la posición del tejido para que quede en el centro del gel y el conducto auditivo esté orientado horizontalmente. Mueva con cuidado la placa a una nevera a 4 °C y espere hasta que el gel esté firme.
   7. Tire de la tira de película transparente para mover el bloque de tejido gel fuera del pozo. Recorte el gel adicional en un bloque cuadrado y corte una esquina del bloque para identificar la orientación. Envuelva el bloque de gelatina con un trozo de papel de aluminio, congele en hielo seco y luego guárdelo a -80 ° C hasta seccionarlo.
   8. Seccionar el bloque a 20 μm a lo largo de la longitud del conducto auditivo con un criostato. Monte las secciones directamente en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina. Conservar los portaobjetos a -80 °C antes de la inmunotinción.
   9. Antes de la inmunotinción, sumergir los portaobjetos en PBS precalentado (45 °C) durante 5 minutos para disolver la gelatina, y luego lavar los portaobjetos 3 veces con PBS a temperatura ambiente para eliminar la gelatina residual.

5. Inmunotinción e imágenes de microscopio

NOTA: Se realizan dos tipos de inmunotinción dependiendo de si las secciones están montadas en portaobjetos o flotando libremente en PBS.

1. Inmunotinción en portaobjetos
   1. Lave las diapositivas 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS. Rodee la región que contiene las secciones con una pluma de aceite para evitar fugas de líquido durante la tinción. Cubrir las secciones con una solución de bloqueo que contenga un 5% de suero normal de cabra en PBS e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   2. Diluir los anticuerpos primarios (para la concentración final utilizada consultar la Tabla de materiales) en PBS que contiene 0,3% de TritonX-100 y 5% de suero normal de cabra. Retire la solución bloqueante y luego cubra las secciones con la solución de anticuerpos primarios. Incubar los portaobjetos a 4 °C durante la noche en una caja que contenga una capa de agua destilada en la parte inferior.
   3. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 10 minutos con PBS. Aplicar anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos a 1:500 en PBS que contengan 0,3% de TritonX-100 en portaobjetos. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 4 h, protegidos de la luz.
   4. Lave las diapositivas 3 veces con PBS. Deje caer suavemente dos gotas de medio de montaje sobre las guías y cubra las secciones con cubreobjetos. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire entre el cubreobjetos y el portaobjetos.
2. Inmunotinción para embriones de montaje entero y secciones de flotación libre
   1. Lave los embriones/secciones con PBS 3x durante 10 minutos cada uno en una placa de pozo. Diluir los anticuerpos primarios en PBS que contienen 0,3% de TritonX-100 y 5% de suero normal de cabra en tubos centrífugos. Transfiera cada embrión o sección a un tubo con un gancho de vidrio e incube en un agitador a 60 rpm durante la noche a 4 °C.
   2. Lave los embriones/secciones 3x con PBS durante 10 minutos cada uno en una placa de pozo. Transfiera cada embrión / sección a un tubo centrífugo oscuro lleno de solución de anticuerpos secundarios fluorescentes e incube a temperatura ambiente durante 4 h en el agitador.
   3. Lave los embriones/secciones 3x con PBS en una placa de pozo. Use un cepillo para montar las secciones en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina en un plato de 15 cm que contenga PBS. Después de que los portaobjetos se sequen ligeramente (~ 5 min), aplique dos gotas de medio de montaje y coloque un cubreobjetos. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Mantenga todos los tejidos de montaje en PBS para obtener imágenes.
3. Imagenológico
   1. Imagen de todos los tejidos de montaje en PBS en un plato con un fondo de silicio que contiene polvo de carbono, que proporciona un fondo negro. Capture y procese imágenes utilizando un paquete de software comercial de procesamiento de imágenes Olympus, como se describió anteriormente²⁹.
   2. Imagen de las secciones de las diapositivas con un microscopio confocal como se describió anteriormente²⁰. Imagen de las secciones en un solo plano focal con objetivos de 10x, 20x y 63x. Captura todas las imágenes del mismo animal utilizando los mismos parámetros. Tenga cuidado de ajustar el nivel del láser y la configuración de adquisición de imágenes para evitar la saturación de la señal.
   3. Realice el procesamiento de imágenes utilizando el software Fiji. Para ilustrar, ajuste el brillo, el contraste y la gamma de la imagen utilizando un software profesional de edición de imágenes.

Resultados

Al realizar electroporación in ovo en diferentes sitios y en diferentes etapas de desarrollo, logramos un knockdown selectivo de FMRP en la periferia auditiva o en el tronco cerebral auditivo.

Derribo de FMRP en NM
El ARN horquilla pequeño (shRNA) contra el pollo Fmr1 fue diseñado y clonado en el sistema vectorial Tet-On como se describió anteriormente²⁰. La configuración para la electroporación in ovo se muestra en l...

Discusión

Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package