In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

Özet

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

Özet

Frajil X mental retardasyon proteini (FMRP), lokal protein translasyonunu düzenleyen mRNA bağlayıcı bir proteindir. FMRP kaybı veya disfonksiyonu, zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve sosyal iletişim sorunları ile karakterize olan kırılgan X sendromunda (FXS) anormal nöronal ve sinaptik aktivitelere yol açar. FMRP fonksiyonu ve FXS patogenezi çalışmaları öncelikle transgenik hayvanlarda Fmr1 (FMRP'yi kodlayan gen) nakavtı ile yapılmıştır. Burada, tavuk embriyolarını kullanarak devre montajı ve sinaptik oluşum döneminde FMRP'nin hücre otonom fonksiyonunu belirlemek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Fmr1 küçük saç tokası RNA'sı (shRNA) ve bir EGFP muhabiri içeren ilaca bağlı bir vektör sisteminin aşama, saha ve yöne özgü elektroporasyonunu kullanır. Bu yöntemle, işitsel ganglionda (AG) ve beyin sapı hedeflerinden biri olan çekirdek magnoselülarisinde (NM) seçici FMRP nakavtı elde ettik, böylece AG-NM devresinde bileşene özgü bir manipülasyon sağladık. Ek olarak, transfeksiyonun mozaik deseni, veri analizinde gelişmiş güvenilirlik ve duyarlılık için hayvan içi kontrollere ve komşu nöron / lif karşılaştırmalarına izin verir. İndüklenebilir vektör sistemi, biriken gelişimsel etkileri en aza indirmek için gen düzenleme başlangıcının zamansal kontrolünü sağlar. Bu stratejilerin kombinasyonu, FMRP'nin sinaptik ve devre geliştirmedeki hücre otonom işlevini incelemek için yenilikçi bir araç sağlar.

Giriş

Frajil X sendromu (FXS), zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve otistik davranışlarla karakterize nörogelişimsel bir bozukluktur. Çoğu durumda, FXS, erken embriyonik aşama^1'den başlayarak kırılgan X zihinsel gerilik proteininin (FMRP; Fmr1 geni tarafından kodlanmış) küresel bir kaybından kaynaklanır. FMRP, normalde beyindeki çoğu nöronda ve glial hücrede ve ayrıca duyu organlarında eksprese edilen RNA bağlayıcı bir proteindir ^2,3,4. Memeli beyinlerinde, FMRP muhtemelen çeşitli sinirsel aktiviteler için önemli olan proteinleri kodlayan yüzlerce mRNA ile ilişkilidir⁵. Konvansiyonel Fmr1 nakavt hayvanları üzerinde yapılan çalışmalar, FMRP ekspresyonunun sinaptik nörotransmisyon^6'nın montajı ve plastisitesi için özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Birkaç koşullu ve mozaik nakavt modeli, FMRP eylemlerinin ve sinyallerinin aksonal projeksiyon, dendritik modelleme ve sinaptik plastisite 7,8,9,10,11,12,13,14 dahil olmak üzere çeşitli gelişimsel olaylar sırasında beyin bölgeleri^, hücre tipleri ve sinaptik bölgeler arasında değiştiğini göstermiştir. . FMRP'nin sinaptik iletimi düzenlemedeki akut fonksiyonu, inhibitör FMRP antikorlarının veya FMRP'nin kendisinin beyin dilimlerinde veya kültürlenmiş nöronlarda hücre içi verilmesi ile incelenmiştir^15,16,17,18. Bununla birlikte, bu yöntemler, geliştirme sırasında FMRP yanlış ifadeye bağlı sonuçları izleme yeteneği sunmaz. Bu nedenle, FMRP'nin hücre otonom fonksiyonlarını araştırmak için in vivo yöntemlerin geliştirilmesine büyük ihtiyaç duyulmaktadır ve FXS hastalarında bildirilen anomalilerin, ilişkili nöronlardaki ve devrelerdeki FMRP kaybının doğrudan sonuçları mı yoksa gelişim sırasında ağ çapındaki değişikliklerden kaynaklanan ikincil sonuçlar mı olduğunu belirlemeye yardımcı olması beklenmektedir¹⁹.

Tavuk embriyolarının işitsel beyin sapı, devre ve sinaps gelişiminde FMRP regülasyonunun derinlemesine fonksiyonel analizleri için benzersiz bir avantajlı model sunar. Embriyonik tavuk beyinlerine kolay erişim ve genetik manipülasyon için köklü ovo elektroporasyon tekniği, erken embriyonik aşamalarda beyin gelişimini anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada, bu teknik, FMRP yanlış ekspresyonu^20,21'in zamansal kontrolüne izin veren gelişmiş moleküler araçlarla birleştirilmiştir. Burada, metodoloji, presinaptik ve postsinaptik nöronların seçici manipülasyonlarını ayrı ayrı indüklemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem işitsel beyin sapı devresinde geliştirilmiştir. Akustik sinyal, işitsel iç kulaktaki saç hücreleri tarafından tespit edilir ve daha sonra işitsel gangliona (AG; memelilerde spiral ganglion olarak da adlandırılır) iletilir. AG'deki bipolar nöronlar, periferik süreçleriyle saç hücrelerini innerve eder ve sırayla beyin sapına merkezi bir projeksiyon (işitme siniri) gönderir ve burada iki primer koklear çekirdekte, çekirdek magnocellularis (NM) ve çekirdek angularis (NA) ile sona erer. NM'deki nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak memeli anteroventral koklear çekirdeğinin küresel gür hücreleriyle karşılaştırılabilir. NM'de, işitme siniri lifleri (ANF'ler), Held terminallerinin^22'sinin büyük uç ampulü aracılığıyla NM nöronlarının somatası üzerinde sinaps oluşturur. Gelişim sırasında, NM nöronları arka beyin^23'teki eşkenar dörtgen 5 ve 6'dan (r5/6) kaynaklanırken, AG nöronları otokist^24'te bulunan nöroblastlardan türetilir. Burada, presinaptik AG nöronlarında ve postsinaptik NM nöronlarında FMRP ekspresyonunu seçici olarak yok etme prosedürünü ayrı ayrı açıklıyoruz.

Protokol

Yumurta ve tavuk embriyoları, Jinan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan protokollerine uygun olarak özen ve saygıyla ele alındı.

1. Yumurta ve plazmid hazırlanması

1. Yumurta hazırlama
   1. Güney Çin Tarım Üniversitesi'nden taze döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus) alın ve kuluçkadan önce 16 ° C'de saklayın. Optimum canlılık için, tüm yumurtaları varıştan sonraki bir hafta içinde kuluçkaya koyun.
   2. Yumurtaları yatay olarak yerleştirin ve nöral tüp transfeksiyonu için Hamburger ve Hamilton (HH) evre 12^25'e kadar 46-48 saat boyunca 38 ° C'de veya otokist transfeksiyonu için HH13'e kadar 54-56 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Yumurtanın hayvan kutbu bitkisel direkten daha hafif olduğundan, yatay yerleştirme embriyoyu kolay manipülasyon için yumurtanın üstüne yerleştirir. Yumurtayı bu ve sonraki tüm adımlarda yatay tutmak için dikkatli olun.
   3. Embriyonun yeri, bir el feneri kullanarak yumurtanın dibinden ışık dökerken yumurta kabuğu üzerinde karanlık bir alan olarak görünür. İstenilen HH aşamalarında, embriyonun yumurta kabuğu üzerindeki yerini kalemle işaretlemek için bu el feneri yöntemini kullanın.
   4. Yumurtaları% 75 etanol içeren gazlı bezle silin. Makasın ucunu kullanarak yumurtaların sivri ucunda bir delik açın ve 18 G iğne şırıngası ile 2 mL albümin çıkarın. Deliğin yalnızca iğne yerleştirmeye izin verecek kadar büyük olduğundan emin olun. Sızdıran albüminleri gazlı bezle silin ve deliği şeffaf bantla kapatın.
   5. Çatlakları en aza indirmek ve pencereleme sırasında düşen kabuk kalıntılarını önlemek için, yumurtaların üst kısmını, kalemle işaretlenmiş karanlık alana ortalayarak şeffaf bantla örtün.
2. Plazmid DNA ekstraksiyonu
   1. Klon tavuk Fmr1 shRNA, daha önce tarif edildiği gibi transpozon tabanlı bir Tet-on sistemi kullanarak²⁰. Bu sistem üç plazmid içerir: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 ve pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, Fmr1 shRNA ve EGFP ekspresyonunun transfeksiyondan sonra susturulduğu ve doksisiklin (Dox) indüksiyonu ile açılabildiği ilaca bağlı bir vektör sistemi sağlar.
      NOT: Bu plazmidler şu anda bir depoda mevcut değildir. Yazarlar makul talep üzerine plazmidleri sağlamayı kabul ederler.
   2. Üreticinin talimatına göre endotoksin içermeyen bir hazırlama kiti kullanarak plazmid DNA'larını çıkarın ve 1/15 hacim 7.5 M sodyum asetat ve 1 hacim% 100 izopropanol ekleyerek çökeltin.
   3. Plazmidleri gece boyunca -20 ° C'de çökeltin ve 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Pelet, kit içinde sağlanan Tris-EDTA tamponu ile 4-5 μg / μL'lik bir son konsantrasyona çözün. Plazmidler, transfeksiyon verimliliği azalmadan 12 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
   4. Elektroporasyon gününde, her plazmidin 2 μL'sini bir pipet ucu kullanarak steril bir santrifüj tüpünde iyice karıştırın. Plazmid karışımının ortaya çıkan 6 μL hacmi, üç düzine yumurtayı elektroporat etmek için yeterlidir. Elektroporasyon sırasında plazmidin görselleştirilmesine yardımcı olmak için, plazmid karışımını maviye çeviren her 6 μL DNA karışımı₂₆için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (steril ddH² O'da hazırlanmış) ekleyin.

2. Ovo elektroporasyonunda

1. Yumurta pencereleme ve embriyo tanımlama
   1. Elektroporasyon gününde, yumurtaları inkübatörden, bir seferde bir düzine yumurtadan çıkarın. Yumurtaları kuluçka makinesinden 1 saatten fazla uzak tutmak, gelişimsel varyasyonlara neden olur ve canlılığı azaltır.
   2. Tüm ameliyat aletlerini% 75 etanol içeren gazlı bezle silin.
   3. Her yumurtayı ısmarlama bir köpük tutucuya yerleştirin. Bantla kaplı alanı% 75 etanol ile silin ve küçük bir makas çifti kullanarak kalem işaretinin çevresine bir pencere (^{1-2 cm2}) kesin (Şekil 1A). Keserken, altındaki embriyoya zarar vermemek için makası düz tutun.
   4. Pencereli yumurtayı 10x göz merceği ve 2x zoom ile bir stereomikroskop altına yerleştirin ve embriyoyu tanımlayın. Daha iyi görselleştirme için ışık kaynağının açısını ve parlaklığını ayarlayın.
      NOT: Bu aşamada embriyoyu görselleştirmek ve nöral tüpü tanımlamak pratik ve deneyim gerektirir.
      1. Yeni başlayanlar için, embriyo tanımlamayı kolaylaştırmak için aşağıdaki isteğe bağlı mürekkep enjeksiyonunu kullanın. 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) ve otoklavda %10 Hint mürekkep çözeltisini önceden hazırlayın. 1 mL'lik bir şırıngayı mürekkep çözeltisiyle doldurun ve ardından 27G'lik bir iğne takın. Forseps ile iğneyi 45° açıyla bükün.
      2. Mikroskop altında, opaka alanının kenarından dikkatlice dürtün ve iğneyi embriyonun altına yerleştirin. Embriyo görselleştirme için pellucida alanının altına yayılacak ~ 50 μL mürekkep enjekte edin. Mürekkep, embriyonun net bir şekilde görselleştirilmesi için koyu renkli bir arka plan oluşturacaktır.
         NOT: Yerleştirmeden ve enjeksiyondan önce havayı şırıngadan dışarı atın. Görselleştirme konusunda yetenekli olduğunuzda, hayatta kalma oranını azalttığı için mürekkep enjeksiyonu adımından kaçının.
2. Nöral tüp enjeksiyonu ve elektroporasyon
   NOT: Bu prosedür, beyin sapındaki NM nöronlarını transfekte etmek için HH12'de gerçekleştirilir.
   1. Bir pipet çektirici kullanarak cam kılcal damarları (~1 mm çapında ve 100 mm uzunluğunda) pipetlere çekin. Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, kılcal iğnenin ucunu forseps ile çapı 10-20 μm'ye dikkatlice açın. Pipetleri (genellikle bir seferde 5-10 adet) kullanana kadar bir saklama kutusunda saklayın.
   2. Bir kılcal pipeti, pipetin ucundaki kauçuk bir tüpten negatif basınç uygulayarak plazmid karışımının 0,5-1 μL'si ile doldurun. Bu bir şırınga veya hava pompası ile sağlanabilir.
   3. Yumurtayı mikroskop altına yerleştirin, böylece embriyo size yakın kuyrukla dikey olarak yönlendirilir (veya üç eksenli bir manipülatör kullanarak kılcal pipetleri enjekte etmek için yatay olarak). Kılcal pipeti tek elinizle veya üç eksenli manipülatörle tutun ve pipetin ucunu kuyruktan başa doğru r5/6'ya doğru sürün.
      NOT: En ön arka beyin bölgesi r1'dir ve nöral tüp boyunca sonraki her çıkıntı bireysel bir eşkenar dörtgendir. R5/6, kolayca tanınabilir fincan benzeri bir yapı olan otokist ile aynı anteroposterior seviyededir (Şekil 1B-C).
   4. Ucu nazikçe vitelin membrandan ve dorsal nöral tüpün içine sokun ve ardından pipeti biraz çekin, böylece uç nöral tüpün lümeninde olur. Plazmid karışımını, renkli plazmid tamamen r5/6'ya yayılana ve r3 ve r4'e uzayana kadar hava basıncı uygulayarak enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyon için vitelin membran üzerinde bir yuva yapılması gerekli değildir.
   5. Mavi plazmid çözeltisi sızıntı yapmadan nöral tüpten hızla aşağı yayıldığında elde edilen başarılı bir enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1B-C). Sızıntı meydana geldiğinde, mavi hızla kaybolur.
   6. Enjeksiyondan hemen sonra, nöral tüpün her iki tarafına bir platin bipolar elektrot yerleştirin (Şekil 1D). Bir elektroporatör ile 12 V ve 50 ms süreli iki darbe verin. Bipolar elektrotun uçlarındaki hava kabarcıklarını, negatif tarafta daha fazlası ile gözlemleyin.
   7. Renkli plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın nöral tüp dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın.
   8. Yumurta kabuğundaki pencereyi, kareler halinde 2'ye önceden kesilmiş ve% 75 etanol ile püskürtülen şeffaf bir film parçasıyla örtün. Yumurtayı tekrar inkübatörüne yerleştirin.
   9. Bir sonraki yumurtaya geçmeden önce tuzlu suda 12 V ve 50 ms süreli 10-20 darbe vererek bipolar elektrodu temizleyin.
3. Otokist enjeksiyonu ve elektroporasyon
   NOT: Bu prosedür, iç kulaktaki saç hücrelerini ve AG nöronlarını transfekte etmek için HH13'te gerçekleştirilir.
   1. HH13'te (~ embriyonik gün 2.5), embriyo başın sağ tarafı yukarı bakacak şekilde döndü. Mikroskop altında, yumurtayı embriyo dikey olacak şekilde, kuyruğu size yakın olacak şekilde yerleştirin. Kılcal pipeti tutun ve sağ otokisti dorsolateral yönde hafifçe dürtün (Şekil 2A).
      NOT: Bu aşamada, otokist vücudun üst kısmında r5/6 ile aynı anteroposterior seviyede küçük dairesel bir yapı olarak görünür.
   2. Plazmid karışımını, otokist mavi çözelti²⁷ ile doldurulana kadar hava basıncı ile enjekte edin. Mavi plazmid karışımı otokist içinde hapsedildiğinde ve sızıntı yapmadığında elde edilen başarılı bir enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.
   3. Enjeksiyondan hemen sonra, bipolar elektrodu Şekil 2B'de gösterildiği gibi otokist üzerine yerleştirin. Pozitif ve negatif tarafları sırasıyla otokistin ön ve arka taraflarını konumlandırın. Elektroporatör ile 12 V ve 50 ms süreli iki darbe verin.
   4. Mavi plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın otokistin dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın. Yumurta kabuğundaki pencereyi şeffaf bir filmle örtün ve yumurtayı inkübatöre geri koyun.

3. Plazmid transkripsiyonunu başlatmak ve sürdürmek için Dox uygulaması

1. Dox çözeltisinin hazırlanması
   1. Kimyasal bir başlık altında 100 mg Dox tozu ölçün ve 1 mg / mL'lik bir çalışma çözeltisi yapmak için 100 mL steril PBS içinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile filtreleyin ve -20 °C'de 1 mL alikot saklayın. Işıktan koruyun^20,28.
2. Dox'un Yönetimi
   1. Tam güçlü gen düzenlemesi için, istenen yaştan 24 saat önce, buz üzerinde bir Dox aliquot çözülür. Şeffaf filme nüfuz eden bir şırınga kullanarak doğrudan yumurtanın koryoallantoik zarına 50 μL Dox bırakın. Enjeksiyondan sonra iğne deliğini şeffaf film veya bantla kapatın.
   2. Nakavt etkisini korumak için, istenen gelişim aşamasında doku hasadına kadar her gün Dox'u uygulayın.

4. Doku diseksiyonu ve kesitleme

1. Beyin sapı
   1. Embriyonik evre 3 (E3) ve E6'daki embriyolar için, yumurta kabuğunu açın ve ilgili zarı makasla kesin. Embriyoyu kaşıklayın ve 0.1 M fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırın.
   2. E9 embriyoları için yumurta kabuğunu açın, embriyonun kafasını makasla kesin ve kafayı PBS ile doldurulmuş silikon tabanlı bir plakaya aktarın. Kafayı yörüngelerden aşağı doğru sabitleyin ve kafatasının üstünü ayırın. Forsepsleri her iki taraftan da beynin altına dikkatlice yerleştirin ve tüm beyni forsepslerin omuzlarıyla kafatasından yükseltin. Beyni% 4 PFA'ya batırın.
   3. E15 ve E19 embriyoları için yumurta kabuğunu açın, embriyonun kafasını makasla kesin ve kafayı PBS ile doldurulmuş silikon tabanlı bir plakaya yerleştirin. Kafatasını ortaya çıkarmak için başın üstündeki cildi kesin.
   4. Ön beyni ve kaudal beyni ayırmak için kafatasını dikey olarak bir tıraş bıçağı ile kesin. Kaudal bloğu PBS'ye batırın, kafatasının üstünü çıkarın ve ardından beyni kafatasından çıkarın.
   5. Beyni optik lobdan aşağı doğru sabitleyin ve beyincik ile beyin sapını ayırın. Beyinciğin hemen altında bulunan işitsel beyin sapına zarar vermemeye dikkat edin. Beyin sapından mümkün olduğunca fazla dura çıkarın ve% 4 PFA'ya batırın.
   6. Embriyoları ve beyin dokularını, 24 saat boyunca aynı durumda tutulması gereken E19 beyin sapları hariç, gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da tutun.
   7. Fiksasyonu takiben, çökene kadar% 30 sakkaroz içeren PBS'deki dokuyu dehidre edin, bu da yaşa bağlı olarak genellikle 1-3 gün sürer.
   8. Beyin sapını (E15 ve E19) kayan bir mikrotom kullanarak koronal düzlemde 30 μm'de kesitleyin. PBS'deki bölümleri toplayın ve immün boyama işleminden önce 4 ° C'de saklayın.
   9. E3 ve E6 embriyoları ve E9 beyin sapları için, enine 50 μm'de kesit. PBS'deki bölümleri toplayın ve 4 °C'de saklayın. İmmün boyamadan önce bölümleri jelatin kaplı mikroskop slaytlarına monte edin. Bu yaşlar için daha kalın kesitlerin toplanması doku kullanımını kolaylaştırır.
2. İşitme kanalı
   1. Beyin sapları E9, E15 ve E19 embriyolarından çıkarıldıktan sonra, temporal kemiğe gömülü olan işitme kanalı, kafatasının altında yatan kolayca tanımlanabilir ve temporal kemik, çevredeki kafatasından kolayca ayrılabilir. E9 embriyoları için, tüm temporal kemiği% 4 PFA'da sabitleyin. Daha yaşlı embriyolar için, işitme kanalını izole etmek ve işitme kanalını% 4 PFA'da sabitlemek için temporal kemiğin kemikli yapısını çıkarın.
   2. Tüm temporal kemikleri ve işitme kanallarını, doku gömülmeden önce gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da tutun.
   3. Açıklandığı gibi doku gömme işlemini gerçekleştirin. Gömme çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın:% 10 jelatini (sığır derisinden) jelatin granülleri şişene ve çökene kadar (yaklaşık 30 dakika) soğuk suda bekletin. Jelatini çözmek için karışımı ~ 50 ° C'ye ısıtın ve jelatin çözeltisine% 20 sakkaroz ekleyin ve çözünmesi için karıştırın. Jelatin-sakkaroz çözeltisini 4 ° C'de bir aya kadar saklayın.
   4. Kullanım için, jelatin-sakkaroz çözeltisini 37 ° C'de ısıtın. Zamansal kemikleri / işitsel kanalları, genellikle 30-60 dakika yerleşene kadar 37 ° C'de 96 delikli bir plaka üzerindeki ılık jelatin-sakkaroz çözeltisine batırın.
   5. 12 delikli bir plakanın kuyularının dibini şeffaf bir film şeridi ile hizalayın. Bir kat ılık jelatin-sakkaroz çözeltisi ekleyin ve katılaşana kadar bekleyin. Her bir kuyucuğa zamansal bir kemik / işitsel kanal aktarın.
   6. Dokuyu ikinci bir sıcak jelatin-sakkaroz çözeltisi tabakası ile implante edin. Dokunun pozisyonunu, jelin merkezinde olacak ve işitme kanalı yatay olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Plakayı dikkatlice 4 ° C'lik bir buzdolabına taşıyın ve jel sertleşene kadar bekleyin.
   7. Jel doku bloğunu kuyudan çıkarmak için şeffaf film şeridini çekin. Ekstra jeli kare bir bloğa kesin ve yönü tanımlamak için bloğun bir köşesini kesin. Jelatin bloğu bir parça folyo ile sarın, kuru buz üzerinde dondurun ve ardından kesitleyene kadar -80 ° C'de saklayın.
   8. Bloğu bir kriyostat ile işitme kanalının boylamı boyunca 20 μm'de kesitleyin. Bölümleri doğrudan jelatin kaplı mikroskop slaytlarına monte edin. İmmün boyamadan önce slaytları -80 ° C'de saklayın.
   9. İmmün boyamadan önce, jelatini eritmek için slaytları önceden ısıtılmış PBS'ye (45 ° C) 5 dakika batırın ve ardından artık jelatini çıkarmak için slaytları oda sıcaklığında PBS ile 3 kat yıkayın.

5. İmmün boyama ve mikroskop görüntüleme

NOT: Kesitlerin slaytlara mı yoksa PBS'de serbest yüzer mi monte edildiğine bağlı olarak iki tip immün boyama yapılır.

1. Slaytlarda immün boyama
   1. Slaytları PBS ile her biri 10 dakika boyunca 3 kat yıkayın. Boyama sırasında sıvı sızıntısını önlemek için bölümleri içeren bölgeyi bir yağ kalemi ile çevreleyin. Bölümleri PBS'de% 5 normal keçi serumu içeren bir bloke edici çözelti ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   2. Birincil antikorları (kullanılan son konsantrasyon için Malzeme Tablosuna bakınız) PBS'de% 0.3 TritonX-100 ve% 5 normal keçi serumu içeren seyreltin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve ardından bölümleri birincil antikor çözeltisi ile örtün. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de, altta damıtılmış su tabakası içeren bir kutuda inkübe edin.
   3. Slaytları PBS ile 10 dakika boyunca 3 kat durulayın. Slaytlara% 0.3 TritonX-100 içeren PBS'de 1:500'de seyreltilmiş floresan sekonder antikorlar uygulayın. Slaytları oda sıcaklığında 4 saat boyunca ışıktan korunmuş olarak inkübe edin.
   4. Slaytları PBS ile 3 kat yıkayın. Slaytların üzerine iki damla montaj ortamını yavaşça bırakın ve bölümleri kapak kapaklarıyla örtün. Kapak kayması ve kızak arasında hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
2. Tüm montajlı embriyolar ve serbest yüzen bölümler için immün boyama
   1. Embriyoları/kesitleri PBS 3x ile her biri bir kuyu plakasında 10 dakika boyunca yıkayın. Santrifüj tüplerde %0.3 TritonX-100 ve %5 normal keçi serumu içeren PBS'deki primer antikorları seyreltin. Her embriyoyu / bölümü cam kancalı bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca 60 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   2. Embriyoları/kesitleri PBS ile 3 kat daha iyi bir kuyu plakasında her biri 10 dakika yıkayın. Her embriyoyu/bölümü, floresan sekonder antikor çözeltisi ile doldurulmuş karanlık bir santrifüj tüpe aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. Embriyoları/bölümleri PBS ile 3x kuyucuk plakasında yıkayın. PBS içeren 15 cm'lik bir kapta jelatin kaplı mikroskop slaytları üzerindeki bölümleri monte etmek için bir fırça kullanın. Slaytlar hafifçe kuruduktan sonra (~ 5 dakika), iki damla montaj ortamı uygulayın ve bir kapak kayması yerleştirin. Kapak kayması ve kızak arasında hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Görüntüleme için tüm montaj dokularını PBS'de tutun.
3. Görüntüleme
   1. PBS'deki tüm montaj dokularını, siyah bir arka plan sağlayan karbon tozu içeren silikon tabanlı bir kapta görüntüleyin. Daha önce açıklandığı gibi ticari bir görüntü işleme Olympus yazılım paketi kullanarak görüntüleri yakalayın ve işleyin²⁹.
   2. Slaytlardaki bölümleri daha önce açıklandığı gibi bir konfokal mikroskopla^{görüntüleyin 20}. Bölümleri 10x, 20x ve 63x hedefleriyle tek bir odak düzleminde görüntüleyin. Aynı parametreleri kullanarak aynı hayvandan gelen tüm görüntüleri yakalayın. Sinyal doygunluğunu önlemek için lazer seviyesini ve görüntüleme alma ayarlarını yapmaya özen gösterin.
   3. Fiji yazılımını kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin. Örnek olarak, profesyonel bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak görüntü parlaklığını, kontrastı ve gamayı ayarlayın.

Sonuçlar

Ovo elektroporasyonunda farklı bölgelerde ve farklı gelişim aşamalarında gerçekleştirerek, işitsel çevrede veya işitsel beyin sapında seçici FMRP nakavtı sağladık.

NM'de FMRP nakavtı
Tavuk Fmr1'e karşı küçük saç tokası RNA'sı (shRNA), daha önce^20'de açıklandığı gibi Tet-On vektör sistemine tasarlanmış ve klonlanmıştır. In ovo elektroporasyon için kurulum Şekil 1A'd...

Tartışmalar

FMRP'nin hücre özerk işlevini belirlemek için, ekspresyonunu bireysel hücre gruplarında veya hücre tiplerinde manipüle etmek gerekir. FMRP'nin ana işlevlerinden biri sinaptik oluşumu ve plastisiteyi düzenlemek olduğundan, belirli bir devrenin her bir sinaptik bileşenini seçici olarak manipüle etmek, sinaptik iletişimde FMRP mekanizmasının tam olarak anlaşılması için ön koşuldur. Tavuk embriyolarının ovo elektroporasyonunda kullanarak, AG-NM devresinde, p...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package