聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖

要約

ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。

要約

脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)は、局所タンパク質翻訳を調節するmRNA結合タンパク質です。FMRPの喪失または機能障害は、知的障害、感覚異常、および社会的コミュニケーションの問題を特徴とする脆弱X症候群(FXS)において、異常なニューロンおよびシナプス活動につながります。FMRP機能とFXSの病因の研究は、主にトランスジェニック動物における Fmr1 (FMRPをコードする遺伝子)ノックアウトで行われています。ここでは、ニワトリ胚を用いた回路形成期およびシナプス形成期におけるFMRPの細胞自律機能を決定するための in vivo 法について報告する。この方法は、 Fmr1 低分子ヘアピンRNA(shRNA)とEGFPレポーターを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。この方法では、聴神経節(AG)とその脳幹標的の1つであるマグノセルラリス核(NM)で選択的なFMRPノックダウンを達成し、AG-NM回路内で成分特異的な操作を提供しました。さらに、トランスフェクションのモザイクパターンにより、動物内コントロールや隣接するニューロン/ファイバーの比較が可能になり、データ解析の信頼性と感度が向上します。誘導ベクターシステムは、遺伝子編集開始の時間的制御を提供し、蓄積された発生効果を最小限に抑えます。これらの戦略の組み合わせは、シナプスおよび回路発生におけるFMRPの細胞自律機能を解剖するための革新的なツールを提供します。

概要

脆弱X症候群(FXS)は、知的障害、感覚異常、自閉症行動を特徴とする神経発達障害です。ほとんどの場合、FXSは、初期胚期¹から始まる脆弱なX精神遅滞タンパク質(FMRP;Fmr1遺伝子によってコードされる)の全体的な喪失によって引き起こされます。FMRPはRNA結合タンパク質であり、通常、脳内のほとんどのニューロンおよびグリア細胞、ならびに感覚器官において発現される^2,3,4。哺乳類の脳では、FMRPは、さまざまな神経活動に重要なタンパク質をコードする数百のmRNAに関連している可能性があります⁵。従来のFmr1ノックアウト動物の研究は、FMRP発現がシナプス神経伝達の集合および可塑性にとって特に重要であることを示した⁶。いくつかの条件付きおよびモザイクノックアウトモデルは、軸索投影、樹状突起パターニング、およびシナプス可塑性を含むいくつかの発生イベント中に、FMRPアクションおよびシグナルが脳領域、細胞型、およびシナプス部位間で異なることをさらに示しています7,8,9,10,11,12,13,14 ....

プロトコル

卵と鶏の胚は、済南大学動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルに従って、注意と敬意を持って取り扱われました。

1.卵とプラスミドの調製

1. 卵の準備
   1. 華南農業大学から新鮮な受精鶏卵(Gallus gallus)を入手し、孵卵前に16°Cで保存します。最適な生存率のために、到着後1週間以内にすべての卵を孵卵のために設定してください。
   2. 卵を水平に置き、神経管トランスフェクションの場合はハンバーガーとハミルトン(HH)のステージ12²⁵ まで、耳嚢胞トランスフェクションの場合はHH13まで54〜56時間、38°Cで46〜48時間インキュベートします。卵の動物の棒は植物の棒よりも軽いので、水平に配置すると、操作が簡単になるように胚が卵の上に配置されます。この手順とそれに続くすべての手順で卵を水平に保つように注意してください。
   3. 胚の位置は、懐中電灯を使用して卵の底から光を当てると、卵殻の暗い領域として表示されます。目的のHH段階で、この懐中電灯法を使用して、卵殻上の胚の位置を鉛筆でマークします。
   4. 75%エタノールを含むガーゼで卵を拭きます。はさみの先端を使用して卵の先のとがった端に穴を開け、18 Gの針注射器で2 mLのアルブミンを取り除きます。穴が針を挿入できるのに十分な大きさであ....

結果

異なる部位および異なる発生段階で ovo エレクトロポレーションを行うことにより、聴覚末梢または聴覚脳幹のいずれかで選択的FMRPノックダウンを達成しました。

NM での FMRP ノックダウン
ニワトリFmr1に対する低分子ヘアピンRNA(shRNA)を設計し、前述のようにTet-Onベクター系にクローニングした²⁰。 inovoエレクトロポレ?.......

ディスカッション

FMRPの細胞自律機能を決定するためには、個々の細胞群または細胞型におけるFMRPの発現を操作する必要があります。FMRPの主要な機能の1つはシナプス形成と可塑性を制御することであるため、特定の回路の各シナプスコンポーネントを選択的に操作することは、シナプス通信におけるFMRPメカニズムを完全に理解するための前提条件です。ニワトリ胚のovoエレク?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package