Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Résumé

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Résumé

La protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP) est une protéine de liaison à l’ARNm qui régule la traduction locale des protéines. La perte ou le dysfonctionnement de la FMRP entraîne des activités neuronales et synaptiques aberrantes dans le syndrome de l’X fragile (FXS), qui se caractérise par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des problèmes de communication sociale. Les études de la fonction FMRP et de la pathogenèse FXS ont principalement été menées avec Fmr1 (le gène codant pour FMRP) knockout chez des animaux transgéniques. Nous rapportons ici une méthode in vivo pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP pendant la période d’assemblage du circuit et de formation synaptique à l’aide d’embryons de poulet. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant un petit ARN en épingle à cheveux Fmr1 (shRNA) et un rapporteur EGFP. Avec cette méthode, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif dans le ganglion auditif (AG) et dans l’une de ses cibles du tronc cérébral, le noyau magnocellularis (NM), fournissant ainsi une manipulation spécifique au composant dans le circuit AG-NM. De plus, le motif en mosaïque de la transfection permet des contrôles intra-animaux et des comparaisons neurones/fibres voisines pour une fiabilité et une sensibilité accrues dans l’analyse des données. Le système de vecteurs inductibles fournit un contrôle temporel de l’apparition de l’édition de gènes afin de minimiser l’accumulation d’effets sur le développement. La combinaison de ces stratégies fournit un outil innovant pour disséquer la fonction autonome cellulaire de la FMRP dans le développement synaptique et de circuits.

Introduction

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des comportements autistiques. Dans la plupart des cas, le FXS est causé par une perte globale de la protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP; codée par le gène Fmr1) à partir des premiers stades embryonnaires¹. La FMRP est une protéine de liaison à l’ARN qui est normalement exprimée dans la plupart des neurones et des cellules gliales du cerveau, ainsi que dans les organes sensoriels ^2,3,4. Dans le cerveau des mammifères, le FMRP est probablement associé à des centaines d’ARNm qui codent des protéines importantes pour diverses activités neuronales⁵. Des études sur des animaux knockout Fmr1 conventionnels ont démontré que l’expression de la FMRP est particulièrement importante pour l’assemblage et la plasticité de la neurotransmission synaptique⁶. Plusieurs modèles d’élimination conditionnelle et mosaïque ont en outre démontré que les actions et les signaux FMRP varient selon les régions du cerveau, les types de cellules et les sites synaptiques au cours de plusieurs événements de développement, y compris la projection axonale, la structuration dendritique et la plasticité synaptique 7,8,9,10,11,12,13,14 . La fonction aiguë de la FMRP dans la régulation de la transmission synaptique a été étudiée par administration intracellulaire d’anticorps inhibiteurs de la FMRP ou de la FMRP elle-même dans des tranches de cerveau ou des neurones en culture ^15,16,17,18. Ces méthodes, cependant, n’offrent pas la possibilité de suivre les conséquences induites par la mauvaise expression du FMRP pendant le développement. Ainsi, le développement de méthodes in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP est très nécessaire et devrait aider à déterminer si les anomalies signalées chez les patients FXS sont des conséquences directes de la perte de FMRP dans les neurones et les circuits associés, ou des conséquences secondaires dérivées de changements à l’échelle du réseau au cours du développement¹⁹.

Le tronc cérébral auditif des embryons de poulet offre un modèle particulièrement avantageux pour des analyses fonctionnelles approfondies de la régulation FMRP dans le développement des circuits et des synapses. L’accès facile aux cerveaux de poulet embryonnaires et la technique d’électroporation in ovo bien établie pour la manipulation génétique ont grandement contribué à notre compréhension du développement du cerveau aux stades embryonnaires précoces. Dans une étude récemment publiée, cette technique a été combinée avec des outils moléculaires avancés qui permettent le contrôle temporel de la mauvaise expression du FMRP^20,21. Ici, la méthodologie est avancée pour induire des manipulations sélectives des neurones présynaptiques et postsynaptiques séparément. Cette méthode a été développée dans le circuit auditif du tronc cérébral. Le signal acoustique est détecté par les cellules ciliées de l’oreille interne auditive, puis transmis au ganglion auditif (AG; également appelé ganglion en spirale chez les mammifères). Les neurones bipolaires de l’AG innervent les cellules ciliées avec leurs processus périphériques et envoient à leur tour une projection centrale (le nerf auditif) au tronc cérébral où ils se terminent par deux noyaux cochléaires primaires, le noyau magnocellulaire (NM) et le noyau angularis (NA). Les neurones de la NM sont structurellement et fonctionnellement comparables aux cellules sphériques touffues du noyau cochléaire antéroventral des mammifères. Dans le NM, les fibres nerveuses auditives (ANF) synapsent sur le somata des neurones NM via le grand bulbe terminal des terminaux Held²². Au cours du développement, les neurones NM proviennent des rhombomères 5 et 6 (r5/6) dans le cerveau postérieur²³, tandis que les neurones AG sont dérivés de neuroblastes résidant dans l’otocyste²⁴. Ici, nous décrivons la procédure pour renverser sélectivement l’expression FMRP dans les neurones AG présynaptiques et dans les neurones NM postsynaptiques séparément.

Protocole

Les œufs et les embryons de poulet ont été manipulés avec soin et respect conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jinan.

1. Préparation d’oeufs et de plasmides

1. Préparation des œufs
   1. Procurez-vous des œufs de poule frais fécondés (Gallus gallus) de l’Université agricole de Chine méridionale et conservez-les à 16 °C avant l’incubation. Pour une viabilité optimale, préparez tous les œufs pour l’incubation dans la semaine suivant l’arrivée.
   2. Placer les œufs horizontalement et incuber à 38 °C pendant 46 à 48 h jusqu’au stade 12²⁵ de Hamburger et Hamilton (HH) pour la transfection du tube neural, ou pendant 54 à 56 h jusqu’à HH13 pour la transfection des otocystes. Parce que le pôle animal de l’œuf est plus léger que le pôle végétal, le placement horizontal positionne l’embryon sur le dessus de l’œuf pour faciliter la manipulation. Soyez prudent pour garder l’œuf horizontal dans cette étape et toutes les suivantes.
   3. L’emplacement de l’embryon apparaît comme une zone sombre sur la coquille de l’œuf lors de la projection de lumière du fond de l’œuf à l’aide d’une lampe de poche. Aux stades HH souhaités, utilisez cette méthode de lampe de poche pour marquer l’emplacement de l’embryon sur la coquille d’œuf avec un crayon.
   4. Essuyez les œufs avec de la gaze contenant 75% d’éthanol. Percez un trou dans l’extrémité pointue des œufs à l’aide de la pointe des ciseaux et retirez 2 ml d’albumine avec une seringue à aiguille de 18 g. Assurez-vous que le trou est juste assez grand pour permettre l’insertion de l’aiguille. Essuyez toute fuite d’albumine avec de la gaze et scellez le trou avec du ruban adhésif transparent.
   5. Pour minimiser les fissures et empêcher la chute de débris de coquille pendant la fenêtrage, couvrez le dessus des œufs avec du ruban adhésif transparent, en se concentrant sur la zone sombre marquée au crayon.
2. Extraction d’ADN plasmidique
   1. Clone poulet Fmr1 shRNA à l’aide d’un système Tet-on basé sur un transposon, comme décrit précédemment²⁰. Ce système contient trois plasmides: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 et pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fournissant un système vectoriel inductible par un médicament par lequel l’expression de Fmr1 shRNA et EGFP est réduite au silence après la transfection et peut être activée par induction de doxycycline (Dox).
      Remarque : Ces plasmides ne sont pas actuellement disponibles dans un référentiel. Les auteurs acceptent de fournir les plasmides sur demande raisonnable.
   2. Extraire les ADN plasmidiques à l’aide d’une trousse de préparation sans endotoxines conformément aux instructions du fabricant et précipiter en ajoutant 1/15 volume d’acétate de sodium 7,5 M et 1 volume d’isopropanol à 100 %.
   3. Précipiter les plasmides à -20 °C pendant une nuit et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min. Dissoudre la pastille avec le tampon Tris-EDTA fourni dans le kit jusqu’à une concentration finale de 4-5 μg/μL. Les plasmides peuvent être conservés à -20 °C pendant 12 mois sans réduction de l’efficacité de la transfection.
   4. Le jour de l’électroporation, bien mélanger 2 μL de chaque plasmide dans un tube centrifuge stérile à l’aide d’un embout de pipette. Le volume résultant de 6 μL du mélange plasmidique est suffisant pour électroporer trois douzaines d’œufs. Pour aider à visualiser le plasmide pendant l’électroporation, ajoutez 1 μL de vert rapide à 0,1% (préparé dans du ddH₂O stérile) pour chaque 6 μL de mélange d’ADN²⁶, ce qui rend le mélange plasmidique bleu.

2. Électroporation in ovo

1. Fenêtre des œufs et identification des embryons
   1. Le jour de l’électroporation, retirez les œufs de l’incubateur, une douzaine d’œufs à la fois. Garder les œufs hors de leur incubateur pendant plus de 1 h introduit des variations de développement et réduit la viabilité.
   2. Essuyez tous les outils chirurgicaux avec de la gaze contenant 75% d’éthanol.
   3. Placez chaque œuf dans un porte-mousse sur mesure. Essuyez la zone recouverte de ruban adhésif avec de l’éthanol à 75 % et coupez une fenêtre (1-2 cm²) autour de la circonférence de la marque du crayon à l’aide d’une petite paire de ciseaux (Figure 1A). Lors de la coupe, tenez les ciseaux à plat pour éviter d’endommager l’embryon en dessous.
   4. Placez l’œuf fenêtré sous un stéréomicroscope avec un oculaire 10x et un zoom 2x et identifiez l’embryon. Ajustez l’angle et la luminosité de la source lumineuse pour une meilleure visualisation.
      REMARQUE: Il faut de la pratique et de l’expérience pour visualiser l’embryon et identifier le tube neural à ce stade.
      1. Pour les débutants, utilisez l’injection d’encre facultative suivante pour faciliter l’identification de l’embryon. Préparer à l’avance une solution d’encre de Chine à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 0,01 M et un autoclave. Remplissez une seringue de 1 mL avec la solution d’encre, puis installez une aiguille 27G. Pliez l’aiguille à un angle de 45° avec une pince.
      2. Sous le microscope, piquez soigneusement le bord de la zone opaca et insérez l’aiguille sous l’embryon. Injectez ~50 μL d’encre, qui diffusera sous la zone pellucide pour la visualisation de l’embryon. L’encre formera un fond sombre pour une visualisation claire de l’embryon.
         REMARQUE: Expulser l’air de la seringue avant l’insertion et l’injection. Lorsque vous êtes habile à visualiser, évitez l’étape d’injection d’encre car elle réduit le taux de survie.
2. Injection de tube neural et électroporation
   REMARQUE: Cette procédure est effectuée à HH12 pour transfecter les neurones NM dans le tronc cérébral.
   1. Tirer les capillaires en verre (~1 mm de diamètre et 100 mm de long) dans des pipettes à l’aide d’un extracteur de pipettes. Sous un microscope à dissection, ouvrez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire à 10-20 μm de diamètre avec une pince. Conservez les pipettes (généralement 5 à 10 à la fois) dans une boîte de rangement jusqu’à utilisation.
   2. Remplir une pipette capillaire avec 0,5-1 μL du mélange plasmidique en appliquant une pression négative à travers un tube en caoutchouc à l’extrémité de la pipette. Cela peut être réalisé à l’aide d’une seringue ou d’une pompe à air.
   3. Placez l’œuf au microscope de manière à ce que l’embryon soit orienté verticalement avec la queue près de vous (ou horizontalement pour injecter des pipettes capillaires à l’aide d’un manipulateur à trois axes). Tenez la pipette capillaire d’une main ou avec le manipulateur à trois axes et enfoncez l’extrémité de la pipette vers le r5/6 dans le sens de la queue à la tête.
      REMARQUE: La zone la plus antérieure du cerveau postérieur est r1 et chaque renflement ultérieur le long du tube neural est un rhombomère individuel. R5/6 est au même niveau antéropostérieur que l’otocyste, qui est une structure en forme de coupe facilement reconnaissable (Figure 1B-C).
   4. Poussez doucement l’embout à travers la membrane vitelline et dans le tube neural dorsal, puis retirez un peu la pipette pour que l’embout soit dans la lumière du tube neural. Injecter le mélange plasmidique en appliquant une pression d’air jusqu’à ce que le plasmide teinté diffuse complètement dans r5/6 et s’étende en r3 et r4.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de faire une fente sur la membrane vitelline pour injection.
   5. Vérifiez si l’injection est réussie, ce qui est obtenu lorsque la solution de plasmide bleu diffuse rapidement dans le tube neural sans fuite (Figure 1B-C). En cas de fuite, le bleu s’estompe rapidement.
   6. Immédiatement après l’injection, placez une électrode bipolaire en platine de chaque côté du tube neural (Figure 1D). Délivrez deux impulsions de 12 V et une durée de 50 ms avec un électroporateur. Observez les bulles d’air aux extrémités de l’électrode bipolaire, avec plus du côté négatif.
   7. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique teinté pénètre dans le tissu du tube neural près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire.
   8. Couvrez la fenêtre sur la coquille de l’œuf avec un morceau de film transparent prédécoupé en carrés de 2 pouces et pulvérisé avec de l’éthanol à 75%. Replacez l’œuf dans son incubateur.
   9. Nettoyez l’électrode bipolaire en délivrant 10 à 20 impulsions de 12 V et une durée de 50 ms dans une solution saline avant de passer à l’œuf suivant.
3. Injection et électroporation d’otocystes
   REMARQUE: Cette procédure est effectuée à HH13 pour transfecter les cellules ciliées et les neurones AG dans l’oreille interne.
   1. À HH13 (qui est ~ jour embryonnaire 2,5), l’embryon a tourné de sorte que le côté droit de la tête est tourné vers le haut. Sous le microscope, placez l’œuf de manière à ce que l’embryon soit vertical, avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire et piquez doucement l’otocyste droit dans une direction dorsolatérale (Figure 2A).
      NOTE: A ce stade, l’otocyste apparaît comme une petite structure circulaire sur le dessus du corps au même niveau antéropostérieur que r5/6.
   2. Injecter le mélange plasmidique avec la pression de l’air jusqu’à ce que l’otocyste soit rempli de solution bleue²⁷. Vérifiez une injection réussie, qui est obtenue lorsque le mélange plasmidique bleu est confiné dans l’otocyste et ne fuit pas.
   3. Immédiatement après l’injection, placez l’électrode bipolaire sur l’otocyste comme illustré à la figure 2B. Positionnez respectivement les côtés positif et négatif antérieur et postérieur à l’otocyste. Délivrez deux impulsions de 12 V et une durée de 50 ms avec l’électroporateur.
   4. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique bleu pénètre dans le tissu de l’otocyste près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire. Couvrez la fenêtre de la coquille d’œuf avec un film transparent et remettez l’œuf dans l’incubateur.

3. Administration de Dox pour initier et maintenir la transcription plasmidique

1. Préparation de la solution Dox
   1. Mesurer 100 mg de poudre de Dox sous une hotte chimique et la dissoudre dans 100 mL de PBS stérile pour obtenir 1 mg/mL de solution de travail. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm et conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C. Protéger de la lumière^20,28.
2. Administration de Dox
   1. Pour l’édition génique à pleine puissance, à 24 h avant l’âge désiré, décongelez une partie aliquote Dox sur la glace. Déposer 50 μL de Dox directement sur la membrane chorio-allantoïdienne de l’œuf à l’aide d’une seringue pénétrant dans le film transparent. Scellez le trou de l’aiguille avec un film transparent ou du ruban adhésif après l’injection.
   2. Pour maintenir l’effet knockdown, administrer Dox tous les deux jours jusqu’à ce que les tissus prélèvent au stade de développement souhaité.

4. Dissection et sectionnement tissulaire

1. Tronc cérébral
   1. Pour les embryons aux stades embryonnaires 3 (E3) et E6, ouvrez la coquille d’œuf et coupez la membrane associée avec des ciseaux. Retirer l’embryon à la cuillère et l’immerger dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M.
   2. Pour les embryons E9, ouvrez la coquille d’œuf, décapitez l’embryon avec des ciseaux et transférez la tête sur une plaque à fond de silicium remplie de PBS. Épinglez la tête à travers les orbites et coupez le haut du crâne. Placez soigneusement les pinces sous le cerveau des deux côtés et élevez tout le cerveau du crâne avec les épaules des forceps. Immergez le cerveau dans 4% PFA.
   3. Pour les embryons E15 et E19, ouvrez la coquille d’œuf, décapitez l’embryon avec des ciseaux et placez la tête sur une plaque à fond de silicium remplie de PBS. Coupez la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
   4. Inciser à travers le crâne verticalement avec un rasoir pour séparer le cerveau antérieur et le cerveau caudal. Immergez le bloc caudale dans PBS, retirez le haut du crâne, puis retirez le cerveau du crâne.
   5. Épinglez le cerveau à travers le lobe optique et séparez le cervelet et le tronc cérébral. Veillez à ne pas endommager le tronc cérébral auditif, situé juste en dessous du cervelet. Retirez autant de dure-mère que possible du tronc cérébral, puis immergez-le dans du PFA à 4%.
   6. Conserver les embryons et les tissus cérébraux dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit, à l’exception des troncs cérébraux E19, qui doivent être conservés dans le même état pendant 24 heures.
   7. Après la fixation, déshydrater le tissu dans du PBS contenant 30% de saccharose jusqu’à ce qu’il se dépose, ce qui prend généralement 1 à 3 jours, selon l’âge.
   8. Couper le tronc cérébral (E15 et E19) à 30 μm au niveau du plan coronal à l’aide d’un microtome coulissant. Prélever les sections dans du PBS et conserver à 4 °C avant immunomarquage.
   9. Pour les embryons E3 et E6 et les troncs cérébraux E9, coupe transversale à 50 μm. Collecter les sections dans PBS et les conserver à 4 °C. Monter les sections sur des lames de microscope recouvertes de gélatine avant l’immunomarquage. La collecte de sections plus épaisses pour ces âges facilite la manipulation des tissus.
2. Conduit auditif
   1. Après avoir retiré les troncs cérébraux des embryons E9, E15 et E19, le conduit auditif, qui est intégré dans l’os temporal, est facilement identifiable sous le crâne, et l’os temporal est facilement séparable du crâne environnant. Pour les embryons E9, fixer l’os temporal entier dans 4% PFA. Pour les embryons plus âgés, enlever la structure osseuse de l’os temporal pour isoler le conduit auditif et fixer le conduit auditif dans 4% PFA.
   2. Conserver tous les os temporaux et les conduits auditifs dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit avant l’encastrement des tissus.
   3. Effectuer l’incorporation des tissus comme décrit. Préparer la solution d’enrobage comme suit: Faire tremper 10% de gélatine (de peau de bovin) dans de l’eau froide jusqu’à ce que les granules de gélatine gonflent et se déposent (environ 30 min). Chauffer le mélange à ~50 °C pour dissoudre la gélatine et ajouter 20% de saccharose dans la solution de gélatine et remuer pour dissoudre. Conservez la solution gélatine-saccharose à 4 °C jusqu’à un mois.
   4. Pour utilisation, chauffer la solution gélatine-saccharose à 37 °C. Faire tremper les os temporaux/conduits auditifs dans la solution chaude gélatine-saccharose sur une plaque de 96 puits à 37 °C jusqu’à ce qu’ils se déposent, généralement 30 à 60 min.
   5. Tapisser le fond des puits d’une plaque de 12 puits avec une bande de film transparent. Ajouter une couche de solution chaude gélatine-saccharose et attendre qu’elle se solidifie. Transférez un os temporel / conduit auditif à chaque puits.
   6. Implantez le tissu avec une deuxième couche de solution chaude de gélatine-saccharose. Ajustez la position du tissu de sorte qu’il soit au centre du gel et que le conduit auditif soit orienté horizontalement. Déplacez délicatement la plaque dans un réfrigérateur à 4 °C et attendez que le gel soit ferme.
   7. Tirez la bande de film transparent pour déplacer le bloc de tissu gel hors du puits. Coupez le gel supplémentaire en un bloc carré et coupez un coin du bloc pour identifier l’orientation. Envelopper le bloc de gélatine avec un morceau de papier d’aluminium, congeler sur de la glace sèche, puis conserver à -80 °C jusqu’à sectionnement.
   8. Couper le bloc à 20 μm le long de la longitude du conduit auditif à l’aide d’un cryostat. Montez les sections directement sur des lames de microscope recouvertes de gélatine. Conserver les lames à -80 °C avant l’immunomarquage.
   9. Avant l’immunomarquage, immerger les lames dans du PBS préchauffé (45 °C) pendant 5 minutes pour dissoudre la gélatine, puis laver les lames 3x avec du PBS à température ambiante pour éliminer la gélatine résiduelle.

5. Immunomarquage et imagerie au microscope

REMARQUE: Deux types d’immunomarquage sont effectués selon que les sections sont montées sur des glissières ou flottantes en PBS.

1. Immunocoloration sur lames
   1. Lavez les lames 3x pendant 10 minutes chacune avec PBS. Encerclez la région contenant les sections avec un stylo à huile pour éviter les fuites de liquide pendant la coloration. Couvrir les sections avec une solution bloquante contenant 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante.
   2. Diluer les anticorps primaires (pour la concentration finale utilisée, voir le tableau des matières) dans du PBS contenant 0,3 % de TritonX-100 et 5 % de sérum de chèvre normal. Retirez la solution bloquante, puis couvrez les sections avec la solution d’anticorps primaires. Incuber les lames à 4 °C pendant une nuit dans une boîte contenant une couche d’eau distillée au fond.
   3. Rincez les lames 3x pendant 10 min avec du PBS. Appliquer des anticorps secondaires fluorescents dilués à 1:500 dans du PBS contenant 0,3% de TritonX-100 sur des lames. Incuber les lames à température ambiante pendant 4 h, à l’abri de la lumière.
   4. Lavez les lames 3x avec PBS. Déposez doucement deux gouttes de support de montage sur les glissières et couvrez les sections avec des lamelles de couverture. Veillez à ne pas générer de bulles d’air entre la lamelle de couverture et la glissière.
2. Immunocoloration pour embryons montés entiers et sections flottantes
   1. Laver les embryons/sections avec PBS 3x pendant 10 min chacun dans une plaque de puits. Diluer les anticorps primaires dans du PBS contenant 0,3 % de TritonX-100 et 5 % de sérum de chèvre normal dans des tubes centrifuges. Transférer chaque embryon/section dans un tube à l’aide d’un crochet en verre et incuber sur un agitateur à 60 tr/min pendant une nuit à 4 °C.
   2. Laver les embryons/sections 3x avec du PBS pendant 10 min chacun dans une plaque de puits. Transvaser chaque embryon/section dans un tube centrifuge foncé rempli d’une solution d’anticorps secondaires fluorescents et incuber à température ambiante pendant 4 h sur l’agitateur.
   3. Laver les embryons/sections 3x avec du PBS dans une plaque de puits. Utilisez un pinceau pour monter les sections sur des lames de microscope recouvertes de gélatine dans une boîte de 15 cm contenant du PBS. Une fois les lames légèrement séchées (~5 min), appliquez deux gouttes de support de montage et placez une lamelle de couverture. Veillez à ne pas générer de bulles d’air entre la lamelle de couverture et la glissière. Conservez tous les tissus de montage dans PBS pour l’imagerie.
3. Imagerie
   1. Imaginez l’ensemble des tissus de montage dans PBS dans un plat avec un fond en silicium contenant de la poudre de carbone, qui fournit un fond noir. Capturez et traitez des images à l’aide d’un progiciel commercial de traitement d’images Olympus, comme décrit précédemment²⁹.
   2. Imagez les sections sur les lames avec un microscope confocal comme décrit précédemment²⁰. Imagez les sections à un seul plan focal avec des objectifs 10x, 20x et 63x. Capturez toutes les images du même animal en utilisant les mêmes paramètres. Prenez soin d’ajuster le niveau laser et les paramètres d’acquisition d’images pour éviter la saturation du signal.
   3. Effectuer le traitement d’image à l’aide du logiciel Fidji. Pour l’illustration, réglez la luminosité, le contraste et le gamma de l’image à l’aide d’un logiciel de retouche d’image professionnel.

Résultats

En effectuant une électroporation in ovo à différents sites et à différents stades de développement, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif soit dans la périphérie auditive, soit dans le tronc cérébral auditif.

FMRP knockdown en NM
Un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre le poulet Fmr1 a été conçu et cloné dans le système vectoriel Tet-On comme décrit précédemment²⁰. La configuration de l’élect...

Discussion

Pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP, il est nécessaire de manipuler son expression dans des groupes cellulaires individuels ou des types de cellules. Étant donné que l’une des principales fonctions de la FMRP est de réguler la formation synaptique et la plasticité, la manipulation sélective de chaque composant synaptique d’un certain circuit est une condition préalable à une compréhension complète du mécanisme FMRP dans la communication synaptique. E...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package