Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

Resumen

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales pigmentadas polarizadas, ubicadas entre la coroides y la neuroretina en la retina. El RPE realiza diariamente múltiples funciones, incluyendo fagocitosis, transporte de nutrientes/metabolitos, metabolismo de la vitamina A, etc. Las células del EPR son células epiteliales terminalmente diferenciadas con poca o ninguna capacidad regenerativa. La pérdida de células del EPR da lugar a múltiples enfermedades oculares que conducen a la discapacidad visual, como la degeneración macular relacionada con la edad. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de cultivo in vitro de células primarias del EPR, que se asemeje más al EPR in vivo que a las líneas celulares, es fundamental para los estudios característicos y mecanicistas de las células del EPR. Teniendo en cuenta el hecho de que la fuente de globos oculares humanos es limitada, creamos un protocolo para cultivar células primarias de EPR porcino. Mediante el uso de este protocolo, las células RPE se pueden disociar fácilmente de los globos oculares porcinos adultos. Posteriormente, estas células disociadas se adhieren a placas / inserciones de cultivo, proliferan para formar una monocapa confluente y restablecen rápidamente las características clave del tejido epitelial in vivo dentro de las 2 semanas. Mediante qRT-PCR, se demuestra que las células primarias del EPR porcino expresan múltiples genes de firma a niveles comparables con el tejido RPE nativo, mientras que las expresiones de la mayoría de estos genes se pierden/se reducen altamente en las células humanas similares al EPR, ARPE-19. Además, la tinción de inmunofluorescencia muestra la distribución de la unión estrecha, la polaridad tisular y las proteínas del citoesqueleto, así como la presencia de RPE65, una isomerasa crítica para el metabolismo de la vitamina A, en células primarias cultivadas. En conjunto, hemos desarrollado un enfoque fácil de seguir para cultivar células primarias de EPR porcino con alta pureza y características nativas de EPR, que podría servir como un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar las toxicidades celulares y facilitar las pruebas de detección de fármacos.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) se encuentra entre los fotorreceptores y el coriocapilar en la capa externa de la retina¹ con múltiples funciones, incluida la formación de la barrera hematoretiniana, el transporte e intercambio de nutrientes y metabolitos retinianos, el reciclaje de vitamina A para mantener un ciclo visual normal, y la fagocitosis y eliminación de los segmentos externos fotorreceptores (POS) ^{desprendidos2,3} . Dado que los POS requieren una auto-renovación constante para generar visión, las células RPE necesitan engullir continuamente POS separados para manten....

Protocolo

El uso de animales de experimentación cumplió con las regulaciones de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) y fue aprobado por el Comité de Ética de Manejo de Animales Experimentales de la Universidad de Xiamen.

1. Preparación de dispositivos quirúrgicos experimentales, enzima de digestión tisular y tampón de cultivo celular

1. Preparar los dispositivos quirúrgicos experimentales, limpiando y esterilizando en autoclave dos pares de tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps el día antes de la disección del globo ocular, y luego secando la caja con dispositivos quirúrgicos en un horno de pr....

Resultados

Las células primarias de EPR porcino (pRPE) se cultivaron en medios DMEM/Basic con 10% de FBS, y la morfología celular bajo microscopio óptico se fotografió a los 2 días (Figura 2A), 6 días (Figura 2B) y 10 días (Figura 2C) después de la siembra. Después de 1 semana, se observó una monocapa confluente de células pRPE pigmentadas con morfologías de adoquines.

Para caracterizar mejor las célula.......

Discusión

Aquí, se ha descrito un protocolo detallado y optimizado para el aislamiento, cultivo y caracterización de células de EPR de globos oculares porcinos, que genera un buen modelo para la caracterización in vitro de células de EPR y estudios de trastornos relacionados con EPR. Los métodos para el aislamiento del EPR de los ojos humanos, de ratón y de rata se han descrito previamente^23,24,25. Sin embargo, es difícil.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins