Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

Резюме

Здесь представлен простой в применении метод культивирования первичных пигментных эпителиальных клеток свиньи in vitro .

Аннотация

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой поляризованных пигментированных эпителиальных клеток, расположенный между сосудистой оболочкой и нейроретиной в сетчатке. Множественные функции, включая фагоцитоз, транспортировку питательных веществ / метаболитов, метаболизм витамина А и т. Д., Проводятся RPE на ежедневной основе. Клетки RPE представляют собой терминально дифференцированные эпителиальные клетки с небольшой регенеративной способностью или вообще без нее. Потеря клеток RPE приводит к множественным заболеваниям глаз, приводящим к нарушениям зрения, таким как возрастная макулярная дегенерация. Поэтому создание модели культуры in vitro первичных клеток RPE, которая больше напоминает RPE in vivo , чем клеточные линии, имеет решающее значение для характерных и механистических исследований клеток RPE. Учитывая тот факт, что источник глазных яблок человека ограничен, мы создаем протокол для культивирования первичных клеток Свиньи RPE. Используя этот протокол, клетки RPE могут быть легко диссоциированы от глазных яблок взрослых свиней. Впоследствии эти диссоциированные клетки прикрепляются к культуральным чашкам / вставкам, размножаются, образуя сливающийся монослой, и быстро восстанавливают ключевые особенности эпителиальной ткани in vivo в течение 2 недель. С помощью qRT-PCR показано, что первичные клетки RPE свиней экспрессируют несколько сигнатурных генов на сопоставимых уровнях с нативной тканью RPE, в то время как экспрессия большинства этих генов теряется / сильно снижается в человеческих RPE-подобных клетках, ARPE-19. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показывает распределение плотного соединения, полярности тканей и белков цитоскелета, а также присутствие RPE65, изомеразы, критической для метаболизма витамина А, в культивируемых первичных клетках. В целом, мы разработали простой в использовании подход к культивированию первичных клеток RPE свиней с высокой чистотой и нативными характеристиками RPE, который может служить хорошей моделью для понимания физиологии RPE, изучения токсичности клеток и облегчения скрининга лекарств.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) расположен между фоторецепторами и хориокапиллярисом во внешнем слое сетчатки¹ с несколькими функциями, включая формирование гематорезитарного барьера, транспортировку и обмен питательными веществами и метаболитами сетчатки, рециркуляцию витамина А для поддержания нормального зрительного цикла, а также фагоцитоз и клиренс наружных сегментов фоторецепторов (POSs)^2,3 . Поскольку POS требуют постоянного самообновления для генерации зрения, клетки RPE должны непрерывно поглощать отделенные POS для поддержания гомеостаза сетчатки⁴. Т....

протокол

Использование экспериментальных животных соответствовало правилам Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и было одобрено Комитетом по этике управления экспериментальными животными Сямыньского университета.

1. Подготовка экспериментальных хирургических устройств, фермента переваривания тканей и буфера клеточной культуры

1. Подготовьте экспериментальные хирургические устройства, очистив и автоклавировав две пары офтальмологических хирургических ножниц и щипцов за день до рассечения глазного яблока, а затем высушив коробку хирургическими устройствами в общепроцедурной печи при 65 °C в течение но....

Результаты

Первичные клетки Свиньи RPE (pRPE) культивировали в DMEM/Basic средах с 10% FBS, а морфологию клеток под световым микроскопом фотографировали через 2 дня (Рисунок 2A), 6 дней (Рисунок 2B) и 10 дней (Рисунок 2C) после посева. Через 1 нед наблюдался сливающийся ?.......

Обсуждение

Здесь был описан подробный и оптимизированный протокол для выделения, культивирования и характеристики клеток RPE из глазных яблок свиней, который генерирует хорошую модель для характеристики in vitro клеток RPE и исследований расстройств, связанных с RPE. Методы выделения РПЭ из глаз че.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins