Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

Riepilogo

Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali pigmentate polarizzate, situato tra la coroide e la neuroretina nella retina. Molteplici funzioni, tra cui la fagocitosi, il trasporto di nutrienti / metaboliti, il metabolismo della vitamina A, ecc., Sono condotte dall'RPE su base giornaliera. Le cellule RPE sono cellule epiteliali differenziate terminalmente con poca o nessuna capacità rigenerativa. La perdita di cellule RPE provoca molteplici malattie degli occhi che portano a disabilità visive, come la degenerazione maculare legata all'età. Pertanto, la creazione di un modello di coltura in vitro di cellule RPE primarie, che assomiglia più da vicino all'RPE in vivo rispetto alle linee cellulari, è fondamentale per gli studi caratteristici e meccanicistici delle cellule RPE. Considerando il fatto che la fonte dei bulbi oculari umani è limitata, creiamo un protocollo per la coltura di cellule RPE primarie suine. Utilizzando questo protocollo, le cellule RPE possono essere facilmente dissociate dai bulbi oculari suini adulti. Successivamente, queste cellule dissociate si attaccano a piatti/inserti di coltura, proliferano per formare un monostrato confluente e ristabiliscono rapidamente le caratteristiche chiave del tessuto epiteliale in vivo entro 2 settimane. Con la qRT-PCR, è dimostrato che le cellule RPE primarie suine esprimono più geni firma a livelli comparabili con il tessuto RPE nativo, mentre le espressioni della maggior parte di questi geni sono perse / altamente ridotte nelle cellule umane simili a RPE, ARPE-19. Inoltre, la colorazione con immunofluorescenza mostra la distribuzione delle proteine della giunzione stretta, della polarità tissutale e del citoscheletro, nonché la presenza di RPE65, un'isomerasi fondamentale per il metabolismo della vitamina A, nelle cellule primarie in coltura. Nel complesso, abbiamo sviluppato un approccio facile da seguire alla coltura di cellule RPE primarie suine con elevata purezza e caratteristiche RPE native, che potrebbe servire come un buon modello per comprendere la fisiologia dell'RPE, studiare la tossicità cellulare e facilitare gli screening farmacologici.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova tra i fotorecettori e i coriocapillari nello strato esterno della retina¹ con molteplici funzioni, tra cui la formazione della barriera emato-retinica, il trasporto e lo scambio di nutrienti e metaboliti della retina, il riciclaggio della vitamina A per mantenere un normale ciclo visivo e la fagocitosi e la clearance dei segmenti esterni dei fotorecettori (POS)^2,3 . Poiché i POS richiedono un costante auto-rinnovamento per generare la visione, le cellule RPE devono continuamente inghiottire i POS distaccati per mantenere l'omeostasi retinica⁴. Pertanto, la disfunzione RPE provoca molte malattie dell'occhio accecante, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD)⁴, la retinite pigmentosa (RP)⁵, l'amaurosi congenita di Leber⁶, la retinopatia diabetica⁷, ecc. Fino ad ora, l'esatta patogenesi della maggior parte di queste malattie rimane elusiva. Di conseguenza, la coltura cellulare RPE viene stabilita per studiare la biologia cellulare RPE, i cambiamenti patologici e i meccanismi sottostanti.

Come modello più semplice per studiare la biologia cellulare, la coltura delle cellule RPE è stata avviata già nel 1920⁸. Sebbene ARPE-19 sia ampiamente utilizzato come cellule RPE, la perdita di pigmentazione, la morfologia del ciottolo e, soprattutto, le funzioni di barriera in questa linea cellulare sollevano molte preoccupazioni⁹. In confronto, la coltura di cellule RPE umane primarie offre uno scenario più realistico per studi fisiologici e patologici⁹. Tuttavia, la disponibilità relativamente limitata ne limita l'uso e le questioni etiche esistono sempre. Inoltre, diversi gruppi hanno utilizzato modelli murini per la coltura di celle RPE. Tuttavia, la dimensione dell'occhio del topo è piccola e una singola coltura di solito richiede molti topi, il che non è conveniente⁹. Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato nuovi metodi per utilizzare cellule staminali embrionali umane o cellule staminali pluripotenti indotte per derivare cellule RPE. Sebbene questa tecnica abbia un particolare potenziale per il trattamento dei disturbi ereditari di RPE, richiede molto tempo e di solito richiede diversi mesi per generare cellule RPE mature¹⁰. Per superare questi problemi, qui introduciamo un protocollo facile da seguire per isolare e coltivare regolarmente cellule RPE ad alta purezza in laboratorio. In condizioni di coltura adeguate, queste cellule possono mostrare funzioni RPE tipiche e mostrare morfologie RPE tipiche. Pertanto, questo metodo di coltura può fornire un buon modello per comprendere la fisiologia RPE, studiare la citotossicità, indagare sui meccanismi patologici delle malattie oculari correlate e condurre screening farmacologici.

Protocollo

L'uso di animali da esperimento è conforme ai regolamenti dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) ed è stato approvato dal Comitato etico di gestione animale sperimentale dell'Università di Xiamen.

1. Preparazione di dispositivi chirurgici sperimentali, enzima di digestione tissutale e tampone di coltura cellulare

1. Preparare i dispositivi chirurgici sperimentali, pulendo e autoclavando due paia di forbici chirurgiche oftalmiche e pinze il giorno prima della dissezione del bulbo oculare, e successivamente asciugando la scatola con dispositivi chirurgici in un forno di protocollo generale a 65 ° C durante la notte.
2. Preparazione dei terreni culturali.
   1. Preparare DMEM/Terreni di base integrati con siero bovino fetale al 10% (v/v), 2 mM di L-glutammina e 1% (v/v) di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/ml).
   2. Preparare i terreni DMEM/F12 integrati con 1% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL).
   3. Preparare MEM-Nic 11, integrando MEM alfa con 2 mM di L-glutammina, 1% FBS, 1% (v/v) penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v) supplemento di N1, taurina (0,25 mg/ml), idrocortisone (20 ng/mL), triiodo-tironina (0,013 ng/ml) e¹⁰ mM di nicotinamide.
      NOTA: Per migliorare la vitalità e la proliferazione cellulare, la percentuale di FBS può essere aumentata al 20% per neutralizzare gli enzimi della digestione e seminare le cellule dissociate. Per la coltura cellulare a lungo termine, la percentuale di FBS può essere ridotta fino all'1%¹².
3. Scongelare l'aliquota dell'enzima di digestione tissutale (soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% (p/v) integrata con 0,91 mM EDTA, di seguito denominata soluzione di tripsina/EDTA) durante l'esperimento.
   NOTA: La soluzione fresca di tripsina/EDTA deve essere utilizzata ogni volta per ottenere risultati ottimali. Aliquot 10 mL di soluzione fresca di tripsina/EDTA in ciascuna provetta sterile da centrifuga da 15 mL e congelare le aliquote in frigorifero a -20 °C fino all'uso.
4. Soluzione di dissezione.
   1. Sterilizzare 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (pH 7,2) integrata con penicillina al 2% (v/v) (100 U/ml) e streptomicina (100 U/ml) filtrando la soluzione attraverso un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
5. Rivestire le piastre di coltura e gli inserti transwell.
   1. Lavare i pozzetti e gli inserti transwell con 1x PBS. Rimuovere il PBS dai pozzetti e dai pozzetti con una pipetta, quindi aggiungere 1 mL di 1x PBS fresco nella camera inferiore e 600 μL di 10 μg/mL di soluzione di laminina nella camera superiore.
   2. Incubare le piastre/inserti transwell nell'incubatore di coltura cellulare per una notte a 37 °C e 5% di CO₂. Rimuovere la soluzione di laminina dalla camera superiore e lavare con 1 mL di freddo 1x PBS due volte prima di seminare le cellule.

2. Dissezione delle cellule RPE del bulbo oculare suino

1. Preparazione degli strumenti.
   1. Pulire la cappa a flusso laminare con etanolo al 75% e luce UV. Preparare tre provette da centrifuga sterili da 50 ml contenenti ~25 ml di etanolo al 75%, tre provette sterili da centrifuga da 50 ml contenenti ~25 ml di 1x PBS e tre piastre di coltura cellulare sterile da 10 cm contenenti ~15 ml di 1x PBS.
      NOTA: queste impostazioni vengono solitamente utilizzate per sezionare quattro bulbi oculari suini. Si prega di aumentare quando vengono utilizzati più bulbi oculari. Per migliorare la vitalità della cella, preraffreddare 1x tampone PBS sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Sia l'etanolo al 75% che la luce UV sono necessari per garantire che gli strumenti sperimentali e le cellule non siano contaminati. Accendere la lampada UV in anticipo per sterilizzare l'intero tavolo operatorio per almeno 15 minuti.
2. Pulire i bulbi oculari suini.
   1. Procurarsi bulbi oculari freschi da un macello e tenerli sul ghiaccio fino alla dissezione. Immergere quattro bulbi oculari suini in ~ 15 ml di etanolo al 75% in una capsula di Petri da 10 cm e utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare tutti i tessuti connettivi e i muscoli residui.
      NOTA: Rimuovere quanto più tessuto possibile dall'esterno della sclera per ridurre le contaminazioni. Non tagliare il nervo ottico in questo momento per facilitare il trasferimento dei bulbi oculari durante la fase di decontaminazione e lavaggio. Dopo questo passaggio, tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare.
3. Decontaminare i bulbi oculari suini immergendo e lavando quattro bulbi oculari suini in tre provette sterili da centrifuga da 50 ml riempite con etanolo al 75% in modo sequenziale; Ogni bulbo oculare è immerso per almeno 5 minuti in ogni tubo. Quindi, lavare i bulbi oculari suini in tre provette da centrifuga sterili da 50 ml riempite con 1x PBS in modo sequenziale; lavare ogni bulbo oculare per almeno 5 minuti in ogni tubo (Figura 1A). Capovolgere i tubi ogni minuto per lavare accuratamente i bulbi oculari.
4. Dissezione dei bulbi oculari suini.
   1. Spostare i quattro bulbi oculari suini in un piatto di coltura cellulare sterile di 10 cm contenente 1x PBS. Tagliare nuovamente la superficie esterna di ciascun bulbo oculare per rimuovere il nervo ottico e i piccoli detriti (Figura 1B). Utilizzare le forbici per eseguire un piccolo taglio all'intersezione del limbus e della sclera, quindi rimuovere la cornea, l'iride, il cristallino, il corpo vitreo e la retina neurale (per le strutture dettagliate di questi tessuti, fare riferimento alla Figura 1).
   2. Trasferire il complesso RPE-coroide-sclera in un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 cm ed effettuare quattro tagli per appiattire la concia oculare a forma di quadrifoglio (Figura 1C).
5. Eseguire la digestione della soluzione di tripsina/EDTA posizionando i quattro complessi RPE-coroide-sclera in un nuovo piatto da 10 cm. Versare 20 ml di soluzione fresca di tripsina/EDTA per unire i complessi RPE-coroide-sclera e mettere il piatto nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C per ~30 minuti.
   NOTA: Utilizzare una soluzione fresca di tripsina/EDTA per dissociare le cellule RPE. Controllare attentamente il tempo di digestione della soluzione di tripsina/EDTA, poiché un tempo di incubazione più lungo (più di 30 minuti) può aumentare la contaminazione di altri tipi di cellule.

3. Isolamento e coltura di cellule RPE del bulbo oculare suino

1. Dissociazione RPE.
   1. Estrarre il piatto dall'incubatore dopo 30 minuti di incubazione con la soluzione di tripsina/EDTA e aggiungere 20 ml di terreno di coltura preriscaldato (con il 10% di FBS) al piatto per neutralizzare la soluzione di tripsina/EDTA.
      NOTA: in questo passaggio, viene utilizzato solo il supporto DMEM/Basic. Quando le cellule raggiungono la confluenza, è possibile utilizzare tre terreni di coltura a seconda delle condizioni sperimentali: DMEM/Basic media, DMEM/F12 e MEM-Nic media.
   2. Utilizzare una pipetta di trasferimento da 5 mL per dissociare le celle RPE pipettando delicatamente più volte. Raccogliere le sospensioni cellulari in provette da centrifuga da 15 ml. Utilizzare altri 10 ml di terreno di coltura fresco (10% FBS) per lavare i complessi RPE-coroide-sclera sul piatto mediante pipettaggio delicato per ottenere il maggior numero possibile di cellule RPE.
      NOTA: Non triturare le cellule troppo vigorosamente. Assicurarsi di riempire e svuotare la pipetta ad una velocità di circa 3 ml/s. Evitare di gorgogliare la sospensione cellulare.
2. Raccogliere le celle RPE centrifugando i tubi a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con una pipetta e aggiungere altri 5 ml di terreno di coltura (10% FBS) per risospendere le cellule e centrifugare a 200 x g per altri 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere le cellule con 12 ml di terreno di coltura.
   NOTA: Quando si aspira il surnatante, lasciare circa 1 mL di fluido per evitare la rottura dei grumi cellulari.
3. Semina di celle RPE.
   1. Seminare ~ 1-2 x 10⁵ cellule / pozzetto in piastre di coltura a 12 pozzetti o inserti transwell. Di solito, circa 1,5 x 10⁶ celle RPE sono ottenute da quattro bulbi oculari suini. Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni e ridurre la concentrazione sierica all'1% quando le cellule coprono completamente la superficie dei pozzetti/inserti.
      NOTA: Non spostare il piatto di coltura cellulare troppo frequentemente prima che le cellule si attacchino al piatto o agli inserti di coltura.
4. Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni fino a quando le cellule non vengono raccolte.
   NOTA: La concentrazione di FBS può essere ridotta dopo che le cellule raggiungono la confluenza e le cellule possono essere coltivate fino a diversi mesi per consentire la piena differenziazione e maturazione.

4. Caratterizzazione di cellule RPE primarie suine

1. Coltivare le cellule alla confluenza per 1 o 2 settimane, quindi raccogliere le cellule per ulteriori analisi.
2. Raccogliere cellule per l'analisi quantitativa real-time PCR (qRT-PCR).
   1. Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1 ml di 1x PBS freddo, quindi aggiungere 500 μL di soluzione di estrazione dell'RNA in ciascun pozzetto per raccogliere il lisato cellulare da circa 1 x 10⁶ cellule.
   2. Estrarre mRNA¹³; da ciascun campione vengono estratti circa 4 μg di RNA. Utilizzare 100 ng di mRNA per eseguire la trascrizione inversa¹⁴; diluire il cDNA di 40 volte per l'analisi quantitativa della PCR in tempo reale. I primer sono elencati nella Tabella 1.
3. Raccogliere cellule per la colorazione con immunofluorescenza.
   1. Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS freddo, quindi aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4% (p/v) in 1x PBS per fissare le cellule (circa 1 x 10⁶ cellule/pozzetto) per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule con 1x PBS due volte ed eseguire la colorazione con immunofluorescenza con anticorpi primari (1:100 in 1x PBS integrato con albumina sierica bovina all'1% (p/v) a 4 °C durante la notte e anticorpi secondari (1:200 in 1x PBS integrato con albumina sierica bovina all'1% (p/v) a temperatura ambiente per 2 ore secondo i protocolli online¹⁵.
   2. Le immagini di immunofluorescenza vengono acquisite da un microscopio confocale seguendo il manuale online¹⁶.
4. Celle di raccolta per l'analisi Western blot.
   1. Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1x PBS freddo due volte, quindi aggiungere 80 μL di tampone RIPA (con 1x inibitore della proteasi) in ciascun pozzetto e utilizzare raschietti cellulari per grattare circa 1 x 10⁶ cellule dai piatti / inserti.
   2. Raccogliere il lisato cellulare da ciascun pozzetto/inserirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Far bollire i lisati cellulari per 10 minuti e quindi misurare le concentrazioni proteiche utilizzando kit BCA; la concentrazione proteica di ciascun campione è di circa 2 mg/ml. Utilizzare 25 μg di proteine di ciascun campione per l'analisi Western blot secondo i protocolli online¹⁷.
   3. Per Western blot, incubare le membrane in 5 mL di soluzione anticorpale primaria (1:1.000 diluizione di anticorpi primari in 1x soluzione TBST integrata con albumina sierica bovina al 5% (p/v) a 4 °C durante la notte su uno shaker rotante multiuso.
   4. Quindi, incubare la membrana con circa 15 ml di soluzione anticorpale secondaria anti-coniglio o anti-topo (1:5.000 diluizione di anticorpi secondari in 1x soluzione TBST integrata con latte non grasso al 5% (p/v) a temperatura ambiente per 2 ore su uno shaker orbitale, in base alla fonte di anticorpo primario utilizzato.
5. Misurazione della resistenza transepiteliale (TER).
   1. Lavare gli elettrodi delle bacchette con etanolo al 70% e sterile 1x PBS in modo sequenziale. Quindi posizionare l'estremità più corta dell'elettrodo nella camera superiore e l'estremità più lunga nella camera inferiore degli inserti transwell e fare clic sul pulsante sul voltmetro epiteliale per le misurazioni. Registrare le misurazioni TER di ciascun pozzetto in triplice copia.

Risultati

Le cellule RPE primarie suine (pRPE) sono state coltivate in terreni DMEM / Basic con il 10% di FBS e la morfologia cellulare al microscopio ottico è stata fotografata a 2 giorni (Figura 2A), 6 giorni (Figura 2B) e 10 giorni (Figura 2C) dopo la semina. Dopo 1 settimana, è stato osservato un monostrato confluente di cellule pRPE pigmentate con morfologie di ciottoli.

Per caratterizzare meglio le cellule ...

Discussione

Qui, è stato descritto un protocollo dettagliato e ottimizzato per l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di cellule RPE da bulbi oculari suini, che genera un buon modello per la caratterizzazione in vitro delle cellule RPE e studi sui disturbi correlati a RPE. I metodi per l'isolamento dell'RPE dagli occhi umani, di topo e di ratto sono stati descritti in precedenza^23,24,25. Tuttavia, è difficile ottenere bu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins