ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

要約

ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。

要約

網膜色素上皮(RPE)は、網膜の脈絡膜と神経網膜の間に位置する偏光色素上皮細胞の単層です。食作用、栄養素/代謝物輸送、ビタミンA代謝などを含む複数の機能がRPEによって日常的に行われています。RPE細胞は、再生能力がほとんどまたはまったくない最終分化上皮細胞です。RPE細胞の喪失は、加齢黄斑変性症などの視覚障害につながる複数の眼疾患をもたらします。したがって、細胞株よりもin vivoのRPEによく似た初代RPE細胞のin vitro培養モデルの確立は、RPE細胞の特徴的かつ機構的な研究にとって重要です。ヒトの眼球の供給源が限られていることを考慮して、我々は初代ブタRPE細胞を培養するためのプロトコルを作成します。このプロトコルを使用することにより、RPE細胞は成体のブタ眼球から容易に解離することができる。その後、これらの解離した細胞は培養皿/インサートに付着し、増殖してコンフルエントな単層を形成し、in vivoで上皮組織の重要な特徴を2週間以内に迅速に再確立します。qRT-PCRにより、初代ブタRPE細胞は、天然RPE組織と同等のレベルで複数のシグネチャ遺伝子を発現する一方で、ヒトRPE様細胞ARPE-19では、これらの遺伝子のほとんどの発現が失われたり、大幅に減少したりすることが実証されています。さらに、免疫蛍光染色は、培養初代細胞におけるタイトジャンクション、組織極性、細胞骨格タンパク質の分布、およびビタミンA代謝に重要なイソメラーゼであるRPE65の存在を示しています。全体として、高純度でネイティブなRPE機能を備えた初代ブタRPE細胞を培養するためのわかりやすいアプローチを開発し、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、薬物スクリーニングを容易にするための優れたモデルとして役立つ可能性があります。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、網膜¹の外層の光受容体と脈絡毛細血管の間に位置し、血液網膜関門の形成、栄養素と網膜代謝物の輸送と交換、正常な視覚サイクルを維持するためのビタミンAのリサイクル、脱落した光受容体外側セグメント(POS)の食作用とクリアランスなど、複数の機能を持っています^2,3。.POSは視力を生成するために絶え間ない自己複製を必要とするため、RPE細胞は網膜の恒常性を維持するために剥離したPOSを継続的に飲み込む必要があります⁴。したがって、RPE機能障害は、加齢黄斑変性症(AMD)⁴、網膜色素変性症(RP)⁵、レーバー先天性無力症⁶、糖尿病性網膜症⁷など、多くの失明性眼疾患を引き起こします。今まで、これらの病気のほとんどの正確な病因はとらえどころのないままです。その結果、RPE細胞生物学、病理学的変化、およびその根底にあるメカニズムを研究するためにRPE細胞培養が確立されます。

細胞生物学を研究するための最も単純なモデルとして、RPE細胞の培養は早くも1920年代に開始されました⁸。ARPE-19はRPE細胞として広く用いられているが、色素沈着の喪失、石畳の形態、特にこの細胞株におけるバリア機能は、多くの懸念を引き起こす⁹。それに比べて、初代ヒトRPE細胞の培養は、生理学的および病理学的研究のためのより現実的なシナリオを提供します⁹。ただし、可用性が比較的限られているため、使用が制限され、倫理的な問題が常に存在します。さらに、いくつかのグループは、RPE細胞を培養するためにマウスモデルを使用しました。しかし、マウスの目のサイズは小さく、1回の培養には通常多くのマウスが必要であり、これは便利ではありません⁹。最近、科学者は、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を使用してRPE細胞を誘導する新しい方法を開発しました。この技術は、遺伝性RPE障害の治療に特に可能性を秘めているが、時間がかかり、通常、成熟RPE細胞を生成するのに数ヶ月を要する¹⁰。これらの問題を克服するために、ここでは、実験室で高純度RPE細胞を日常的に分離および培養するためのわかりやすいプロトコルを紹介します。適切な培養条件下では、これらの細胞は典型的なRPE機能を示し、典型的なRPE形態を示すことができます。したがって、この培養法は、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、関連する眼疾患の病理学的メカニズムを調査し、薬物スクリーニングを実施するための優れたモデルを提供することができます。

プロトコル

実験動物の使用は、視覚眼科学研究協会(ARVO)の規則に準拠し、厦門大学の実験動物管理の倫理委員会によって承認されました。

1. 実験用手術器具、組織消化酵素、細胞培養バッファーの調製

1. 実験用手術器具を準備し、眼球解剖の前日に2組の眼科手術用ハサミ及び鉗子を洗浄及びオートクレーブ処理し、その後、手術器具の入った箱を一般プロトコールオーブン中で65°Cで一晩乾燥させた。
2. 培地の調製。
   1. 10%(v/v)ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したDMEM/ベーシック培地を調製します。
   2. 1%(v/v)FBS、1%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したDMEM/F12培地を調製します。
   3. MEM アルファに 2 mM L-グルタミン、1% FBS、1% (v/v) ペニシリン (100 U/mL) およびストレプトマイシン (100 U/mL)、0.1 mM NEAA、1% (v/v) N1 サプリメント、タウリン (0.25 mg/mL)、ヒドロコルチゾン (20 ng/mL)、トリヨード-チロニン (0.013 ng/mL)、および 10 mM ニコチンアミドを補給して、MEM-Nic¹¹ を調製します。
      注:細胞の生存率と増殖を改善するために、FBSの割合を20%に増やして消化酵素を中和し、解離した細胞に播種することができます。長期間の細胞培養では、FBSの割合を1%まで減らすことができます¹²。
3. 実験中に組織消化酵素アリコート(0.91 mM EDTAを添加した0.25%(w/v)トリプシン/EDTA溶液、以下、トリプシン/EDTA溶液と呼びます)を解凍します。
   注意: 最適な結果を得るには、毎回新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を使用する必要があります。10 mLの新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を各15 mL滅菌遠心チューブに分注し、使用するまで-20°Cの冷蔵庫でアリコートを凍結します。
4. 解剖ソリューション。
   1. 2%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.2)を、0.22 μmのシリンジフィルターユニットで溶液をろ過して滅菌します。
5. 培養プレートとトランスウェルインサートをコーティングします。
   1. ウェルとトランスウェルインサートを1x PBSで洗浄します。ピペットでウェルおよびトランスウェルからPBSを取り出し、1 mLの新しい1x PBSを下チャンバーに、600 μLの10 μg/mLラミニン溶液を上部チャンバーに追加します。
   2. プレート/トランスウェルインサートを細胞培養インキュベーター内で37°C、5%_CO2で一晩インキュベートします。ラミニン溶液を上部チャンバーから取り出し、細胞を播種する前に1 mLの冷たい1x PBSで2回洗浄します。

2. ブタ眼球RPE細胞の解剖

1. 楽器の準備。
   1. 層流フードを75%エタノールとUV光で清掃します。~25 mLの75%エタノールを含む50 mL滅菌遠心チューブ3本、1x PBSを~25 mL入った50 mL滅菌遠心チューブ3本、および1x PBSを~15 mL入った10 cm滅菌細胞培養皿3本を準備します。
      注:これらの設定は通常、4つのブタの眼球を解剖するために使用されます。より多くの眼球が使用されるとき、スケールアップしてください。細胞の生存率を向上させるには、1x PBSバッファーを氷上で少なくとも30分間予冷します。75%エタノールとUV光の両方が、実験装置と細胞が汚染されていないことを確認するために必要です。事前にUVランプをオンにして、操作テーブル全体を少なくとも15分間滅菌してください。
2. ブタの眼球をきれいにします。
   1. 食肉処理場から新鮮な眼球を入手し、解剖まで氷の上に置いておきます。10cmのシャーレに4本のブタ眼球を~15mLの75%エタノールに浸し、はさみと鉗子を使って残っている結合組織と筋肉をすべて切り取ります。
      注意: 汚染を減らすために、強膜の外側からできるだけ多くの組織を取り除きます。除染および洗浄ステップ中の眼球の移動を容易にするために、この時点で視神経を切断しないでください。このステップの後、すべての手順は層流フードで実行する必要があります。
3. 75%エタノールで満たされた3つの50 mL滅菌遠心チューブに4つのブタ眼球を順次浸して洗浄することにより、ブタ眼球を除染します。各眼球を各チューブに少なくとも5分間浸します。次に、1x PBSで満たされた3本の50 mL滅菌遠心チューブでブタの眼球を順次洗浄します。各眼球を各チューブで少なくとも5分間洗浄します(図1A)。眼球を完全に洗うために毎分チューブを反転させます。
4. ブタ眼球の解剖。
   1. 4頭のブタ眼球を、1x PBSを含む10cmの滅菌細胞培養皿に移します。各眼球の外面を再度トリミングして、視神経と小さな破片を取り除きます(図1B)。ハサミを使って辺縁と強膜の交点に小さな切り込みを入れ、角膜、虹彩、水晶体、硝子体、神経網膜を取り除きます(これらの組織の詳細な構造については、 図1を参照してください)。
   2. RPE-脈絡膜-強膜複合体を新しい10 cmの細胞培養皿に移し、4つの切り込みを入れて、四つ葉のクローバーの形にアイカップを平らにします(図1C)。
5. 4つのRPE-脈絡膜-強膜複合体を新しい10 cmディッシュに入れて、トリプシン/EDTA溶液消化を実行します。RPE-脈絡膜-強膜複合体を融合させるために20 mLの新しいトリプシン/EDTA溶液を注ぎ、ディッシュを37°Cの細胞培養インキュベーターに~30分間入れます。
   注:新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を使用して、RPE細胞を解離します。インキュベーション時間が長くなる(30分以上)と、他の種類の細胞の汚染が増加する可能性があるため、トリプシン/EDTA溶液の消化時間を慎重に制御してください。

3. ブタ眼球RPE細胞の単離と培養

1. RPE解離。
   1. トリプシン/EDTA溶液で30分間インキュベートした後、インキュベーターからディッシュを取り出し、20 mLの予熱した培地(10%FBSを含む)をディッシュに加えて、トリプシン/EDTA溶液を中和します。
      メモ: このステップでは、DMEM/ベーシックメディアのみが使用されます。細胞がコンフルエントになったら、実験条件に応じて、DMEM/ベーシック培地、DMEM/F12培地、MEM-Nic培地の3つの培地を使用できます。
   2. 5 mLトランスファーピペットを使用して、数回穏やかにピペッティングしてRPE細胞を解離します。細胞懸濁液を15 mLの遠沈管に集めます。さらに10 mLの新鮮な培地(10%FBS)を使用して、できるだけ多くのRPE細胞を得るために穏やかにピペッティングして皿上のRPE-脈絡膜-強膜複合体を洗浄します。
      注意: 細胞を激しく粉砕しすぎないでください。ピペットを約3 mL/sの速度で充填および空にしてください。細胞懸濁液を泡立てないでください。
2. チューブを200 x g で室温で5分間遠心分離することにより、RPE細胞を収集します。ピペットを使用して上清を吸引し、さらに5 mLの培養培地(10%FBS)を加えて細胞を再懸濁し、200 x g でさらに5分間遠心分離します。上清をデカントし、12 mLの培地で細胞を再懸濁します。
   注:上清を吸引するときは、細胞塊の破壊を避けるために約1mLの培地を残してください。
3. RPE細胞の播種。
   1. ~1-2 x 10⁵ 細胞/ウェルを12ウェル培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種します。通常、約1.5 x 10⁶ RPE細胞が4つのブタ眼球から得られます。2日ごとに培地を交換し、細胞がウェル/インサートの表面を完全に覆ったら、血清濃度を1%に下げます。
      注:細胞が培養皿/インサートに付着する前に、細胞培養皿を頻繁に動かさないでください。
4. 細胞が回収されるまで、2日ごとに培地を交換してください。
   注:細胞がコンフルエントに達した後にFBSの濃度を下げることができ、細胞を最大数ヶ月間培養して完全な分化と成熟を可能にすることができます。

4. 初代ブタRPE細胞のキャラクタリゼーション

1. コンフルエントな状態で細胞を1週間または2週間培養し、さらに分析するために細胞を回収します。
2. 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)分析のために細胞を回収します。
   1. 培養液を取り出し、1 mLの冷たい1x PBSで細胞を洗浄し、次に500 μLのRNA抽出溶液を各ウェルに加えて、約1 x 10⁶ 細胞から細胞ライセートを収集します。
   2. mRNA¹³を抽出します。各サンプルから約4μgのRNAを抽出します。100 ngのmRNAを使用して逆転写を実行します¹⁴;定量的リアルタイムPCR分析のためにcDNAを40倍に希釈します。プライマーを 表1に記載する。
3. 免疫蛍光染色のために細胞を回収します。
   1. 培養液を取り出し、1 mLの冷たい1x PBSで細胞を洗浄し、次に1x PBS中の500 μLの4%(w/v)パラホルムアルデヒドを加えて、室温で30分間細胞を固定します(約1 x 10⁶ 細胞/ウェル)。次に、1x PBSで細胞を2回洗浄し、一次抗体(1%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x PBSで1:100)を4°Cで一晩、二次抗体(1%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x PBSで1:200)で免疫蛍光染色をオンラインプロトコル¹⁵に従って室温で2時間行います。
   2. 免疫蛍光画像は、オンラインマニュアル¹⁶に従って共焦点顕微鏡によって取得されます。
4. ウェスタンブロット分析のために細胞を回収します。
   1. 培養液を取り出し、冷たい1x PBSで細胞を2回洗浄した後、80 μLのRIPAバッファー(1x プロテアーゼ阻害剤を含む)を各ウェルに加え、セルスクレーパーを使用して、ディッシュ/インサートから約1 x 10⁶ 細胞をスクラッチします。
   2. 各ウェルから細胞ライセートを回収し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに挿入します。細胞溶解物を10分間煮沸し、BCAキットを使用してタンパク質濃度を測定します。各サンプルのタンパク質濃度は約2 mg/mLです。各サンプルのタンパク質25 μgをオンラインプロトコル¹⁷に従ったウェスタンブロット分析に使用します。
   3. ウェスタンブロットの場合は、メンブレンを5 mLの一次抗体溶液(5%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x TBST溶液中の一次抗体の1:1,000希釈)中で、回転する多目的シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 次に、使用した一次抗体の供給源に応じて、約15 mLの抗ウサギまたは抗マウス二次抗体溶液(5%(w/v)の無脂肪乳を添加した1x TBST溶液中の二次抗体の1:5,000希釈)で室温で2時間インキュベートします。
5. 経上皮抵抗(TER)測定。
   1. 箸電極を70%エタノールで洗浄し、1x PBSを滅菌します。次に、電極の短い方の端をトランスウェルインサートの上部チャンバーに、長い方の端を下部チャンバーに配置し、上皮電圧計のボタンをクリックして測定します。各ウェルのTER測定値をトリプリケートで記録します。

結果

初代ブタRPE(pRPE)細胞を10%FBSを含むDMEM/ベーシック培地で培養し、播種後2日目(図2A)、6日目(図2B)、および10日目(図2C)に光学顕微鏡下で細胞形態を撮影しました。1週間後、石畳の形態を有する色素性pRPE細胞のコンフルエント単層が観察された。

初代pRPE細胞をよりよく特徴付けるために、継代3(P3)18の初代ヒ?...

ディスカッション

ここでは、ブタ眼球からのRPE細胞の単離、培養、および特性評価のための詳細で最適化されたプロトコルが、RPE細胞のin vitro特性評価およびRPE関連障害研究のための優れたモデルを生成することが記載されている。ヒト、マウス、およびラットの眼からRPEを単離するための方法は、以前に記載されている²³、^24、25。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins